孫堅煒 雷利紅 譚靜怡 陳莉麗

浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院牙周科 杭州 310009

牙周炎是一種以菌斑生物膜為主要致病因素 的慢性感染性疾病，主要臨床表現(xiàn)為牙齦炎癥和出血、牙槽骨吸收、附著喪失及牙周袋形成，最終可導致牙齒脫落，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。因此，在牙周炎治療過程中如何阻止牙槽骨吸收，預防患牙松動、脫落一直是臨床工作者關注和研究的重點。

骨免疫學主要探究免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)之間的相互作用，在牙周炎進展過程中過強的自身免疫反應常導致骨質(zhì)破壞。近期，研究者[2-4]發(fā)現(xiàn)微小RNA（MicroRNA，miR）155在牙周炎患者的齦溝液和類風濕性關節(jié)炎患者的外周血單核細胞中的表達量可上調(diào)，miR-155可直接作用于骨骼系統(tǒng)細胞或通過免疫系統(tǒng)等間接參與骨性疾病及骨改建中。本文就miR-155在骨免疫中的相關研究進展進行綜述，旨在闡述miR-155在骨免疫中的調(diào)控機制及其在牙周炎發(fā)生過程中可能的作用。

1 miR-155及其相關疾病

miR-155位于人類21號染色體的B細胞整合簇上，其基因具有高度保守性[5-6]。作為典型的多功能miRNA的一員，miR-155可誘導蛋白質(zhì)Argonaute靶向作用于信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'-非編碼區(qū)以沉默靶基因[7]，在腫瘤發(fā)生、造血譜系分化、免疫及炎癥反應等多種生理或病理過程中發(fā)揮關鍵作用。有報道[8-11]顯示，miR-155能靶向作用于腫瘤蛋白53誘導核蛋白1（tumor protein 53 induced nuclear protein 1，TP53INP1），由此增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力，促進胰腺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)展。在B細胞中選擇性過表達miR-155，能誘導B細胞多克隆增殖，促進B細胞惡性腫瘤的發(fā)生[12]。此外，來自巨噬細胞外泌體的miR-155可進入心臟成纖維細胞中，通過靶向作用Son of Sevenless（SOS）1和細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）1，抑制心臟成纖維細胞增殖，促進炎癥反應，這一過程與心臟損傷密切相關[13]。

近年來，miR-155在免疫炎癥反應中的作用越來越引人注目。2008年，Stanczyk等[14]首次發(fā)現(xiàn)類風濕性關節(jié)炎患者的滑膜組織中miR-155表達量可高達健康者8倍。隨后，在類風濕性關節(jié)炎患者的全血及外周血單核細胞中觀察到miR-155高水平表達[15]，且其表達量還能隨著關節(jié)炎嚴重程度加重而遞增[2]。上述證據(jù)提示miR-155或許可作為骨關節(jié)炎的診斷標志物。而體外實驗[14]顯示，在過表達miR-155的類風濕性關節(jié)炎滑膜成纖維細胞中，在炎癥反應中引起組織損傷的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3的表達量減少。提示miR-155在特定的細胞和炎癥環(huán)境中也可能作為一種保護性miRNA發(fā)揮作用。2011年，Xie等[16]的研究顯示，在牙周炎患者的牙齦組織中miR-155水平降低；進一步靶基因預測發(fā)現(xiàn)，miR-155可能通過SOCS1、成纖維細胞生長因子7、Toll樣受體信號通路等對牙周炎癥進行調(diào)控。miR-155對多種疾病的調(diào)控機制正逐步被闡明，且根據(jù)其在牙周炎和類風濕性關節(jié)炎中的作用，可推測miR-155在骨穩(wěn)態(tài)的維持中也有所涉及。

2 骨免疫學

骨組織的形成和形態(tài)、功能的維持是骨基質(zhì)不斷分泌和吸收這一動態(tài)過程的結果。當成骨細胞（osteoblast）和破骨細胞（osteoclast）的數(shù)量和功能的平衡喪失時，骨代謝的穩(wěn)態(tài)將被打破，會導致牙周炎、骨質(zhì)疏松癥、類風濕性關節(jié)炎等骨破壞性疾病的發(fā)生[17-19]。本世紀初，Arron等[20]首次提出骨免疫學這一概念，認為骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間可以相互調(diào)控，由核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和骨保護素（osteoprotegerin，OPG）所組成的系統(tǒng)則是二者溝通的主要橋梁。常見的與骨代謝相關的免疫細胞包括T細胞、B細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞等。

2.1 免疫細胞對骨代謝的調(diào)控

T細胞介導的免疫應答反應是免疫系統(tǒng)參與骨代謝調(diào)控過程的重要方式[21-24]。激活的CD4+T細胞和CD8+T細胞能分泌RANKL、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-16和IL-17，促進破骨細胞形成[21]。輔助性T細胞（T helper cell，Th）17可分泌IL-17，被認為是促破骨能力最強的T細胞亞型[22]。已知IL-17能減少成骨前體細胞的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和其分泌的骨基質(zhì)礦化程度；同時降低骨鈣素（osteocalcin，OCN）和成骨相關轉錄因子抗體的表達水平[23]。體內(nèi)實驗[24]還發(fā)現(xiàn)，IL-17能夠有效抑制大鼠顱骨缺損模型的修復。然而，Wang等[25]報道IL-17可以促進小鼠顱骨原代成骨細胞在早期分化過程中成骨分化相關分子ALP、Runt相關轉錄因子（Runtrelated transcription factor，Runx）2、OCN和OPG的表達。另有研究[26-28]顯示，調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）既能通過表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA）4激活吲哚胺2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase），促進破骨前體細胞凋亡，也可通過分泌IL-4、IL-10和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β抑制骨吸收作用。此外，Takayanagi等[29]發(fā)現(xiàn)Th1和Th2產(chǎn)生的干擾素（interferon，IFN）-γ能夠通過誘導RANK和腫瘤壞死因子受體相關因子（tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）6快速降解，干擾RANKL-RANK信號通路，進而抑制破骨前體細胞向破骨細胞轉化。

盡管活化T細胞和破骨細胞的相互作用被認為是骨免疫學的核心[30]，B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞對于骨代謝的調(diào)控也不可忽視[31]。

在生理條件下，B細胞是OPG的主要來源[32]。將小鼠體內(nèi)的B細胞敲除后，可引起OPG減少和破骨細胞骨吸收速率增加[33]。與此同時，B細胞也能產(chǎn)生另一骨代謝關鍵分子RANKL。Onal等[34]發(fā)現(xiàn)特異性敲除B細胞RANKL相關基因，能夠緩解卵巢摘除術小鼠的骨質(zhì)喪失。

有研究[35]發(fā)現(xiàn)，當用巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和RANKL處理未成熟的樹突狀細胞后，樹突狀細胞能分化為功能性破骨細胞。

在炎癥過程中，巨噬細胞是炎癥因子的主要生產(chǎn)者，其產(chǎn)生的炎癥因子主要取決于其活化及極化狀態(tài)。大量研究[36-40]表明，M1型巨噬細胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-16等促炎因子，具有顯著的促骨質(zhì)吸收作用；M2型巨噬細胞則能通過分泌IL-10、TGF-β等相關抗炎因子，有利于骨的再生和修復。

有研究[41-42]結果顯示，中性粒細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞也具有促破骨細胞的作用。

2.2 骨骼系統(tǒng)對免疫細胞的調(diào)控

另一方面，骨骼系統(tǒng)對免疫細胞的發(fā)生、成熟也有調(diào)控作用。

多項研究[43-45]顯示，成骨細胞可產(chǎn)生趨化因子亞族CXC配體（CXC ligand，CXCL）12、Delta樣配體（Delta-like ligand，DLL）4、IL-17，分別調(diào)控B祖細胞、T祖細胞和淋巴祖細胞。此外，成骨細胞也可通過缺氧誘導因子依賴方式產(chǎn)生促紅細胞生成素，促進紅細胞的生成[46]。當成骨細胞受損后，小鼠骨髓內(nèi)的淋巴細胞數(shù)量減少，其造血功能可被破壞[47-48]。

破骨細胞在骨吸收過程中可引起局部骨基質(zhì)中的鈣離子和TGF-β的釋放，調(diào)控造血干細胞的定位、靜止及自我更新[49-50]。Lymperi等[51]報道，通過雙磷酸鹽處理抑制破骨細胞功能后，可引起造血干細胞數(shù)量的減少并降低其移植潛力。

骨硬化素主要由骨細胞表達。Cain等[52]在敲除骨硬化素基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)，骨髓中成熟的B細胞數(shù)目顯著減少。不僅如此，終末分化的骨細胞還可通過粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor）的表達，增加中性粒細胞和血小板的數(shù)量，提示骨細胞可以調(diào)節(jié)髓系細胞的分化[53]。

綜上，免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)在生理和病理條件下均存在密切聯(lián)系。眾所周知，牙周炎是一種以細菌為主要致病因素的慢性感染性疾病，機體的免疫炎癥反應是牙周炎導致牙槽骨吸收和牙齒脫落的重要因素[54]。在研究牙周炎過程中骨骼系統(tǒng)變化的同時，需要一并關注免疫系統(tǒng)的異常表現(xiàn)，將二者視為一個整體。

3 miR-155對骨免疫的調(diào)控

3.1 miR-155對骨免疫相關免疫細胞的調(diào)控

miR-155可靶向抑制特定基因，影響信號通路和細胞表型[55]?；罨腂細胞、T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞中均具有相當高的miR-155表達量。有學者[56-57]通過使胚胎干細胞產(chǎn)生突變等位基因獲得miR-155缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)miR-155缺陷小鼠的生發(fā)中心功能被抑制，其T細胞依賴性抗體和TNF-α、淋巴毒素α、IFN-γ等細胞因子的產(chǎn)量減少。

miR-155通過多條信號通路調(diào)控T細胞向特定的亞型分化，改變T細胞亞型之間的平衡關系，間接參與骨代謝過程。Zhang等[58]通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time PCR，qRTPCR）分析T細胞特異性轉錄因子Tbx21、Gata3、Rorc和Foxp3的表達量，發(fā)現(xiàn)高表達miR-155的骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cell）和脾臟單核細胞（spleen mononuclear cell）共培養(yǎng)后能夠抑制脾臟單核細胞中Tbx21和Rorc表達，而增加Gata3和Foxp3的表達量，表明miR-155能夠促進T細胞向Th2和Treg表型分化，而抑制其向Th1和Th17分化，使間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生免疫抑制作用。而Rodriguez等[56]報道在敲除miR-155的基因后，CD4+T細胞則更容易向Th2分化。進一步研究[59-61]發(fā)現(xiàn)，當miR-155缺失后，miR-155靶蛋白c-Maf水平上升，而c-Maf可促進Th2分泌IL-4、IL-5、IL-10，起到阻滯RANKL信號通路以抑制破骨的作用。此外，miR-155還能通過靶向抑制CD4+T細胞中SOCS1的表達，抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB、IL-2/STAT5和IL-6/STAT3等信號通路，由此促進T細胞的增殖、活化或向Th17和Treg分化，增加IL-17的表達量[62]。由此推論，miR-155參與T細胞的分化過程，但它是否通過T細胞對骨代謝進行調(diào)控仍需深入研究。

另有研究[57]表明，miR-155缺陷小鼠的樹突狀細胞抗原呈遞功能缺失，無法有效激活T細胞。Dunand-Sauthier等[63]發(fā)現(xiàn)，在活化的樹突狀細胞中，miR-155可靶向抑制精氨酸酶2的表達，阻止細胞外微環(huán)境中精氨酸的過度消耗，而成熟的樹突狀細胞只有在富含精氨酸時才能啟動T細胞的應答，促進T細胞的增殖。此外，miR-155可靶向作用于IL-13受體α1，抑制STAT6活化，促進巨噬細胞的活化[64]。Zhang等[65]進一步發(fā)現(xiàn)，miR-155可靶向作用于SOCS1，導致STAT1的激活及STAT6信號通路的抑制，并調(diào)節(jié)骨髓來源巨噬細胞向M1型轉化。有研究[56]顯示miR-155具有調(diào)節(jié)巨噬細胞向M1型轉化的作用，這將促進炎癥反應和組織損傷。以上研究表明，miR-155可以作用于不同靶蛋白，促進免疫炎癥反應，由此間接增強免疫炎癥導致的骨質(zhì)吸收。

綜上所述，miR-155可通過靶向作用于不同免疫細胞靶蛋白的mRNA調(diào)節(jié)免疫炎癥反應，而miR-155對T細胞亞型分化方向的調(diào)控作用目前仍存在爭議。目前，關于miR-155通過免疫系統(tǒng)影響骨代謝的機制尚未明確，還需從細胞層面對成骨細胞和破骨細胞的平衡進行更深入的研究。

3.2 miR-155對成骨作用的調(diào)控

骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有自我更新及多向分化潛能的干細胞[66]，受TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等多種因子調(diào)控，可以向成骨細胞、成軟骨細胞或成脂肪細胞分化。多項研究表明，miR-155可能參與骨髓間充質(zhì)干細胞分化過程的調(diào)節(jié)。Hou等[67]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，在(+)-膽甾酮-3-1[(+)- cholesten-3-one，CN]誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中，miR-155的表達水平降低。另有學者[68]以BMP-2誘導過表達miR-155的MC3T3-E1細胞成骨，發(fā)現(xiàn)細胞中的ALP活性和表達量、茜素紅染色強度等成骨指標均降低；進一步熒光素酶報告基因測試發(fā)現(xiàn)，miR-155能夠與Smad5 mRNA上的3'-非編碼區(qū)結合；實驗表明miR-155通過靶向作用于Smad5，抑制成骨前體細胞向成骨細胞分化。與此同時，miR-155還能靶向作用于Runx2和BMP受體9，抑制由BMP-9誘導的成骨分化作用[69]。而Zhao等（2018全國口腔生物醫(yī)學學術年會）則發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過負性調(diào)控缺氧誘導因子（hyp-oxiainducible factor）-1α的表達，抑制原代成骨細胞的成骨向分化。上述研究提示，miR-155可能是成骨向分化的負調(diào)控因子，通過靶向作用于多種不同蛋白質(zhì)的mRNA，發(fā)揮抑制成骨作用。

3.3 miR-155對破骨作用的調(diào)控

破骨細胞起源于骨髓造血系細胞的單核巨噬細胞系統(tǒng)，其高度分化具有顯著的骨吸收作用[70]。感染牙周組織的牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物和免疫炎癥因子等可增強破骨細胞活性，導致牙槽骨吸收[71]，而破骨細胞的活性決定了牙槽骨吸收的程度[70]。因此，探究如何抑制破骨細胞活性以減緩牙槽骨吸收的機制仍是目前的研究熱點。

miR-155對破骨細胞的分化、功能具有雙向調(diào)節(jié)作用。Sul等[72]從小鼠股骨和脛骨中獲取骨髓來源巨噬細胞（bone marrow macrophage），以M-CSF和RANKL誘導培養(yǎng)40 h，獲得破骨前體細胞，再以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理破骨前體細胞24 h后，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-155的表達量增加。隨后將miR-155類似物轉染到破骨前體細胞中，酸性磷酸酶同功酶TRAP、降鈣素受體、組織蛋白酶K、樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic cell specific transmembrane protein，DC-STAMP）和溶酶體基因ATP6v0d2等破骨細胞特殊基因的表達水平均上調(diào)，且TRAP陽性多核細胞數(shù)量增加。實驗[72]證明，LPS誘導破骨前體細胞產(chǎn)生miR-155，并且miR-155表達水平的升高可促進破骨細胞的形成，增加破骨細胞的活性，提示miR-155或許可成為治療炎癥反應引起的骨質(zhì)破壞的一個靶點。

與之相反， Zhao等[73]報告miR-155對破骨細胞分化可能有抑制作用，采用逆轉錄病毒上調(diào)鼠骨髓來源巨噬細胞中的miR-155后，破骨分化標志物DC-STAMP、組織蛋白酶K和活化T細胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1）等表達水平降低，TRAP陽性細胞數(shù)量減少；同時，破骨細胞生成的2種必要調(diào)節(jié)因子SOCS1和小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）的水平下降，結果表明miR-155可靶向作用于SOCS1和MITF，抑制破骨細胞分化。Zhang等[74]的實驗也證實miR-155能夠靶向作用于SOCS1和MITF，調(diào)控IFN-β對破骨細胞分化的抑制作用，阻止破骨細胞形成。另有學者[75]采用CRISPR/CAS9基因編輯技術定向敲除鼠巨噬細胞系RAW264.7的miR-155基因，降低內(nèi)源性miR-155，發(fā)現(xiàn)在LPS+IFN-γ共同刺激下，巨噬細胞產(chǎn)生的炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α減少；而miR-155基因敲除的RAW264.7細胞在RANKL誘導破骨分化后，能觀察到更多TRAP陽性細胞，表明miR-155具有促進炎癥反應和抑制破骨細胞生成的作用。

上述研究表明，miR-155對破骨細胞的分化、功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，miR-155對破骨細胞的調(diào)控效應尚不明確，其具體功能機制仍有待深入研究。

4 miR-155在牙周炎中的作用

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）是引起牙周炎的“核心”病原菌（keystone pathogen），主要功能包括對牙周局部宿主免疫功能的抑制和牙周局部菌群整體致病性的提升[76]。Xie等[77]發(fā)現(xiàn)，以牙齦卟啉單胞菌LPS刺激人牙齦成纖維細胞8 h后，細胞中miR-155的表達水平可顯著升高。與此同時，Nayar等[78]以牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體等多種牙周致病菌感染大鼠牙齦組織，12周后發(fā)現(xiàn)大鼠牙齦組織中的miR-155水平有所增加，提示在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中可能有miR-155的參與。

已有多項研究[4,79]表明，在慢性牙周炎患者的牙周組織中，miR-155的表達水平會發(fā)生改變，但miR-155與牙周炎發(fā)生、發(fā)展的確切關系尚不明確。Xie等[16]分別從10名牙周炎患者和10名牙周健康者獲取牙齦組織，對提取的RNA進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)牙周炎患者的牙齦組織中miR-155的表達量較健康對照組明顯減少。然而，有研究[79]結果與之恰好相反，發(fā)現(xiàn)牙周炎患者牙齦組織中的miR-155表達量比健康牙齦組織增加了1.7倍。與此同時，有學者[4]在牙周炎患者的齦溝液中觀察到miR-155高表達，當對患者進行非手術性牙周治療干預后，miR-155的表達量可以恢復至牙周健康者同一水平；進一步多變量分析顯示，miR-155的表達量與牙周炎具有顯著相關性。由此認為miR-155可能是一種新型的牙周炎陽性診斷生物標志物。

miR-155可通過多種途徑對牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過程進行調(diào)控。Xie等[16]通過采用targetscan和MicroRNA.org兩種目標基因預測算法發(fā)現(xiàn)，miR-155可能靶向作用于SOCS1、成纖維細胞生長因子7、IκB激酶ε（IκB kinase ε，IKKε）等相關信號通路，影響免疫炎癥反應和成纖維細胞的增殖、分化。有學者[80]以牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌刺激miR-155缺失的端粒酶永生化人牙齦角化細胞發(fā)現(xiàn)，IL-8和CXCL1的mRNA和蛋白質(zhì)水平均可提高；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，在miR-155敲除牙齦細胞中，NF-κB的mRNA表達量稍有增加，而IKKε的mRNA表達量可升高2倍左右。IKKε水平的增加可使細胞產(chǎn)生更多的NF-κB，有利于細胞產(chǎn)生更多的炎癥因子。結果表明在微生物感染后，miR-155能減少人牙齦組織中相關炎癥因子的表達。Zheng等[81]發(fā)現(xiàn)，與牙周健康者的牙周韌帶干細胞相比，來自牙周炎患者的牙周韌帶干細胞外泌體中具有更低的miR-155表達量。miR-155可靶向降低組蛋白去乙酰化酶的表達水平，繼而減弱維甲酸相關孤核受體（retinoid-related orphan nuclear receptor，ROR）γt的轉錄活性，抑制Th17的傳代和功能[82]。上述實驗提示，miR-155可能是一個負調(diào)節(jié)因子，通過一系列信號通路，緩解牙周炎過程中的炎癥反應。

然而，另有研究[83]發(fā)現(xiàn)，miR-155可靶向作用于SOCS1，抑制其對牙周炎的負反饋調(diào)節(jié)作用。因此，在牙周炎進展過程中，miR-155對炎性因子可能有負向亦或是正向調(diào)節(jié)作用，其中的機制還需進一步探索。

5 展望

miR-155對機體細胞代謝的調(diào)控作用正逐步被闡明，不僅參與機體的免疫、造血、炎癥等生理與病理過程，更對骨免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)有實驗顯示，miR-155能與靶基因結合直接作用于間充質(zhì)干細胞、成骨細胞和破骨細胞，也可以通過免疫系統(tǒng)間接進行骨代謝的調(diào)控。但是，miR-155的靶基因多樣，且牙周炎是一種由多種免疫炎癥因子參與的疾病，miR-155在該過程中可以形成一個極其復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，其具體機制仍有待進一步探索。對miR-155與骨免疫的關系進行研究，有助于進一步解釋牙周炎等骨吸收類疾病的發(fā)病機制。未來，通過miR-155靶向治療牙周炎癥所致的骨質(zhì)吸收或將成為可能。