黃錦榮 張 鳳 謝金蘭 張冬生 朱昔嬌 陳新強(qiáng) 范秀瓊 范劍明

（梅州市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)研究所，廣東 梅州 514011）

五指毛桃中文名粗葉榕Ficus hirta，屬?？芃oraceae 榕屬Ficus 植物，別名佛掌榕、土北芪、五爪龍、五指牛奶等；我國(guó)主要分布在廣東省、廣西自治區(qū)、江西省、福建省、海南省等地區(qū)；國(guó)外馬來西亞、緬甸、越南、泰國(guó)等國(guó)家亦有分布[1-3]。五指毛桃以根入藥，其味甘、辛，性平，有益氣健脾、舒筋化濕之功效，用于脾虛浮腫、自汗、風(fēng)濕痹痛、慢性支氣管炎等癥,是多種中成藥的原材料；同時(shí)五指毛桃是食藥同源的植物，開發(fā)了很多保健食品和藥膳，東南亞及我國(guó)港澳地區(qū)以五指毛桃為原料的湯料日漸盛行[2，4-5]。隨著其用量的逐年上升，野生資源日漸匱乏，為保證五指毛桃資源的可持續(xù)利用，人工種植，特別是林下仿野生種植優(yōu)良無性系是必然趨勢(shì)。五指毛桃的主要活性成分為補(bǔ)骨脂素，王曉平等[6]與劉春玲等[7]的試驗(yàn)均認(rèn)為五葉裂型五指毛桃中補(bǔ)骨脂素含量最高，為獲得大量?jī)?yōu)良五指毛桃苗木，通過組織培養(yǎng)繁育成為首選。

國(guó)內(nèi)關(guān)于五指毛桃組織培養(yǎng)的研究已有報(bào)道。其中陶瑜等[8]的研究以五指毛桃種子萌發(fā)的無菌芽苗為所需培養(yǎng)材料；李林軒等[3]的研究以五指毛桃葉片為外植體誘導(dǎo)叢芽得到培養(yǎng)材料；梁春輝等[9]的試驗(yàn)以五指毛桃葉片、葉柄和莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，認(rèn)為葉片產(chǎn)生愈傷優(yōu)于葉柄，而莖段無愈傷產(chǎn)生，亦無芽分化，不適合作外植體；蔣林等[10]的研究以帶頂芽或帶腋芽的莖段為外植體，通過從莖段上切面誘導(dǎo)出叢芽得到培養(yǎng)材料；蘇鈺琴[11]的研究以從頂芽切取的微莖尖為外植體誘導(dǎo)叢芽獲得培養(yǎng)材料。以上各研究均未見通過誘導(dǎo)腋芽或頂芽萌發(fā)來獲得培養(yǎng)材料的報(bào)道，本試驗(yàn)以帶頂芽的莖段為外植體，誘導(dǎo)頂芽萌發(fā)得到所需培養(yǎng)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 外植體 試驗(yàn)所用外植體來自梅州市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)研究所2017 年3 月五指毛桃扦插試驗(yàn)培育的優(yōu)良植株，扦插試驗(yàn)所用插穗全為五葉裂型五指毛桃枝條，來自大埔縣世源農(nóng)業(yè)生態(tài)有限公司在西河鎮(zhèn)水祝村的五指毛桃種植基地，扦插試驗(yàn)在本所龍上苗圃場(chǎng)實(shí)施（116°7′29″～116°7′33″E，24°15′4″～24°15′12″N），苗木培育基質(zhì)為黃心土，剪取無病蟲、健壯的帶頂芽嫩枝為外植體。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基除生根培養(yǎng)基蔗糖濃度為20 g·L-1、活性碳為0.5 g·L-1外，其余培養(yǎng)基蔗糖濃度為30 g·L-1，卡拉膠濃度均為6.5 g·L-1，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)整pH 值為5.8～6.2，培養(yǎng)基加入的激素均由上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn)，培養(yǎng)基在121℃下滅菌15～20 min。 培 養(yǎng) 室 溫 度 為（26±2） ℃， 相 對(duì) 濕 度 為65%～70%，光照強(qiáng)度為1 000～2 000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)為10～12 h·d-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌 將采回的嫩枝剪去葉片，切取長(zhǎng)約2～3 cm 帶頂芽莖段，置入干凈玻璃瓶中，注入適量洗滌劑和水清洗莖段表面，用自來水反復(fù)沖洗干凈，然后在超凈工作臺(tái)上用75 %的酒精浸泡10～15 s，無菌水沖洗1～2 次，再浸泡到添加1～2 滴吐溫80 的1 g·L-1升汞溶液滅菌，時(shí)間為13、14、15 min，隨后用無菌水沖洗4～6 次，取出莖段，在切口上方切去一小段，接種于培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1中，每個(gè)處理接種15 瓶，每瓶接種1 個(gè)莖段，在培養(yǎng)室培養(yǎng)15 d 后觀察滅菌效果，計(jì)算滅菌成功率。

1.2.2 芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 用MS 作為基本培養(yǎng)基，加入6-BA 1.0 mg·L-1，IBA（0.1、0.5 mg·L-1） 或NAA（0.1、0.5 mg·L-1），試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理接種15 瓶，每瓶接種1 個(gè)外植體。在超凈工作臺(tái)上，用無菌紙吸干已滅菌莖段表面水分，在切口上方切去少許接種在培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)外植體誘導(dǎo)萌芽數(shù)，計(jì)算芽誘導(dǎo)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 用MS 作為基本培養(yǎng)基，加入6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1），IBA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1），試驗(yàn)設(shè)置9 個(gè)處理，3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理接種5 瓶，每瓶接種3 個(gè)單芽或小叢芽。在超凈工作臺(tái)上，將經(jīng)過數(shù)次初代培養(yǎng)獲得的叢芽，分切成單芽或小叢芽接種在培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)35 d 后統(tǒng)計(jì)芽個(gè)數(shù)，計(jì)算芽增殖倍數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 用1/4MS（大量元素1/4）作為基本培養(yǎng)基，加入IBA（1.0、1.5、2.0 mg·L-1），NAA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1），試驗(yàn)設(shè)置9 個(gè)處理，3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理接種5 瓶，每瓶接種10個(gè)芽苗。在超凈工作臺(tái)上，從增殖培養(yǎng)的芽苗中，切取具3 片以上舒展葉片、高2.5～3.5 cm 的芽苗，接種在培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)25 d 后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，計(jì)算生根率。

1.2.5 瓶苗移栽 將煉苗后的生根植株從瓶中移到盆中，用清水輕輕洗去根部粘附的培養(yǎng)基，種植于容器基質(zhì)中，基質(zhì)采用黃心土與輕型基質(zhì)（椰糠70%，泥炭30%），種植時(shí)先在基質(zhì)中挖個(gè)小坑，將小苗植入坑中，用基質(zhì)完全覆蓋小苗根部，注意不要按壓基質(zhì)防止傷及苗根，栽后淋透水，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，種植一個(gè)月后調(diào)查存活率。

表1 不同滅菌時(shí)間對(duì)五指毛桃外植體的影響Tab.1 The effect of different sterilization time on the explants of Ficus hirta

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

將滅菌后的五指毛桃外植體接種到培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+卡拉膠6.5 g·L-1中，培養(yǎng)15 d 后的滅菌效果分析見表1。可見滅菌時(shí)長(zhǎng)對(duì)五指毛桃外植體的污染率、褐化率及滅菌成功率的影響均差異顯著（P ＜0.05）。滅菌時(shí)長(zhǎng)13 min 的處理污染率最高，為82.23%，無褐化，滅菌成功率為17.77%；滅菌時(shí)長(zhǎng)14 min 的處理污染率為55.53%，褐化率為8.9%，滅菌成功率最高，為35.53%；滅菌時(shí)長(zhǎng)15 min 的處理污染率最低，為46.67%，而褐化率最高達(dá)37.77 %，滅菌成功率僅為15.53%。因此五指毛桃外植體最合適的滅菌時(shí)長(zhǎng)為14 min。

2.2 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

外植體接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30 d 后的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2?？梢? 個(gè)處理的芽誘導(dǎo)率差異不顯著。表2 直觀可見，在培養(yǎng)基中加入相同濃度的IBA 或NAA 時(shí)，IBA 作用下的芽誘導(dǎo)率稍高；在培養(yǎng)基中加入不同濃度的同一生長(zhǎng)素時(shí)，芽誘導(dǎo)率會(huì)隨著生長(zhǎng)素濃度的增加而小幅下降；在IBA 的濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，五指毛桃外植體的芽誘導(dǎo)率最高，平均芽誘導(dǎo)率為40%。因此認(rèn)為，加入6-BA 1.0 mg·L-1與IBA0.1 mg·L-1的培養(yǎng)基適合五指毛桃外植體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.3 增殖培養(yǎng)

將單芽或小叢芽接種在增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)35 d 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。不同濃度6-BA 與IBA 配比，對(duì)五指毛桃增殖倍數(shù)的影響差異顯著（P ＜0.05），隨著6-BA 濃度由0.5 mg·L-1增加至1.5 mg·L-1，芽的增殖倍數(shù)亦從2.87 上升至6.64，當(dāng)6-BA 的濃度為1.5 mg·L-1時(shí)芽增殖倍數(shù)最高為6.64，但在此濃度時(shí)芽苗生長(zhǎng)慢，葉逐漸變黃，長(zhǎng)期使用不利于增殖培養(yǎng)，當(dāng)6-BA 的濃度為1.0 mg·L-1時(shí)芽增殖倍數(shù)為5.43，芽苗生長(zhǎng)正常，葉綠色，適合五指毛桃增殖培養(yǎng)；由表3 可見，不同濃度IBA 對(duì)增殖培養(yǎng)的影響與6-BA 的濃度有關(guān)，當(dāng)6-BA 濃度為0.5 mg·L-1時(shí)IBA 不同濃度對(duì)芽增殖影響差異不顯著，當(dāng)6-BA 濃度為1.0 mg·L-1與 1.5 mg·L-1時(shí)IBA 不同濃度對(duì)芽增殖影響差異顯著，當(dāng)IBA濃度由0.1 mg·L-1增加至0.3 mg·L-1時(shí)，芽增殖倍數(shù)亦上升，而當(dāng)IBA 濃度由0.3 mg·L-1增加至0.5 mg·L-1時(shí)，芽增殖倍數(shù)則下降；因此，加入6-BA 1.0 mg·L-1與IBA0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基，最適合五指毛桃芽增殖培養(yǎng)。

表2 不同激素配比對(duì)五指毛桃芽誘導(dǎo)的影響Tab.2 The effect of different hormone ratio on the bud induction of Ficus hirta

表3 不同激素配比對(duì)五指毛桃芽增殖的影響Tab.3 The effect of different hormone ratio on the bud proliferation of Ficus hirta

表4 不同激素配比對(duì)五指毛桃生根的影響Tab.4 The effect of different hormone ratio on the take root of Ficus hirta

2.4 生根培養(yǎng)

將芽苗接種在生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)25 d 后統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4。不同濃度IBA與NAA 配比，對(duì)五指毛桃生根率的影響差異顯著（P ＜0.05）。當(dāng)IBA 的 濃 度 由1.0 mg·L-1增加至1.5 mg·L-1時(shí)，生根率隨著IBA 的濃度增加而升高；當(dāng)IBA 的濃度由1.5mg·L-1增加至2.0 mg·L-1時(shí)，生根率隨著IBA 的濃度增加而下降，并且根系纖細(xì)；當(dāng)IBA 的濃度不變，NAA的濃度在0.1～0.5 mg·L-1時(shí)，隨著NAA 的濃度升高，生根率沒有顯著變化；在IBA 的濃度為1.5 mg·L-1、NAA 濃度為0.3 mg·L-1時(shí)生根率最高，達(dá)到了96%，根數(shù)較多，根系生長(zhǎng)正常。因此，加入IBA1.5 mg·L-1與NAA0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基，是五指毛桃生根的最佳培養(yǎng)基。

2.5 瓶苗移栽

瓶苗移栽30 d 后統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表5。不同基質(zhì)對(duì)五指毛桃組培苗移栽存活率的影響差異顯著（P ＜0.05），移栽到黃心土中的幼苗平均存活率為94.73%，移栽到輕型基質(zhì)中的幼苗平均存活率為98.15%，輕型基質(zhì)中生長(zhǎng)的五指毛桃幼苗的平均存活率明顯高于黃心土中五指毛桃幼苗的平均存活率，因此，五指毛桃組培苗移栽最佳的基質(zhì)為輕型基質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

本研究確定了五指毛桃外植體用1 g·L-1升汞滅菌最適合的時(shí)長(zhǎng)為14 min；適合五指毛桃外植體芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+卡拉膠6.5 g·L-1；最適合五指毛桃不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1+ 蔗 糖30 g·L-1+ 卡拉膠6.5 g·L-1；最適合五指毛桃生根的培養(yǎng)基為1/4MS+IBA1.5 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1+ 蔗糖20 g·L-1+卡拉膠6.5 g·L-1+活性碳0.5 g·L-1；最適合五指毛桃組培苗移栽的基質(zhì)為輕型基質(zhì)。

表5 不同基質(zhì)對(duì)五指毛桃移栽的影響Tab.5 The effect of different stroma on the transplant of Ficus hirta

本研究在五指毛桃芽增殖培養(yǎng)試驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)基中6-BA 濃度的增加，芽增殖倍數(shù)也隨著升高，當(dāng)6-BA 濃度增加至一定數(shù)值時(shí)，雖然芽增殖倍數(shù)是升高了，但會(huì)影響芽苗的正常生長(zhǎng)，這與陳麗靜等[12]和丁偉等[13]在植物組織培養(yǎng)過程中芽增殖培養(yǎng)的研究結(jié)果一致。在五指毛桃生根培養(yǎng)試驗(yàn)中，本試驗(yàn)以1/4MS 為基本培養(yǎng)基，加入IBA濃度為1.5 mg·L-1、NAA 濃度為0.3 mg·L-1時(shí)生根率最高，這與李林軒等[3]和陶瑜等[8]的試驗(yàn)結(jié)果稍有差異，李林軒等和陶瑜等的試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，在加入IBA 濃度為1.0 mg·L-1、 NAA 濃度為0.3 mg·L-1時(shí)生根率最高，兩者間形成差異是否與所用基本培養(yǎng)基不同相關(guān)，或者是所用活性碳濃度不同相關(guān)，或者是其他因素如芽苗切割方法不同等相關(guān)，原因有待進(jìn)一步研究 分析。

本研究在五指毛桃外植體滅菌過程中只使用了75%的酒精與1 g·L-1的升汞進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的滅菌試驗(yàn)，外植體滅菌成功率最高僅為35.53%，后續(xù)需進(jìn)一步探索不同滅菌劑對(duì)五指毛桃外植體的滅菌效果，以提高五指毛桃外植體的滅菌成功率；在瓶苗移栽試驗(yàn)中，只采用了2 種基質(zhì)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，存在一定的局限性，有必要增加一些不同基質(zhì)來完善試驗(yàn)。