申秋艷 羅偉生

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530023，電子郵箱：923059147@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧市 530011)

【提要】 肝纖維化是一種受多種理化生物因素影響的復(fù)雜性肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。多種表觀遺傳機(jī)制，如DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA基因調(diào)控等在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。本文綜述了表觀遺傳機(jī)制在肝纖維化中的表達(dá)情況及其意義，為肝纖維化的早期診斷及臨床治療提供新的思路。

肝纖維化是指在各種理化因素、局部缺血、感染、免疫反應(yīng)等損傷因子作用下，肝臟中以膠原蛋白為主的各種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)代謝失衡，導(dǎo)致ECM過度沉積，肝臟結(jié)構(gòu)被破壞，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。其中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化為肌成纖維細(xì)胞是ECM的主要來源。因此，HSC活化被認(rèn)為是肝纖維化過程的中心環(huán)節(jié)，而上述病理過程均受基因調(diào)控，包括多種表觀遺傳機(jī)制。表觀遺傳是指在無DNA序列改變的情況下，通過調(diào)控特異基因的表達(dá)，影響組織細(xì)胞表型，發(fā)揮對細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育生長、機(jī)體功能運(yùn)行的調(diào)控作用，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用[1]。

1 表觀遺傳機(jī)制概述

表觀遺傳學(xué)最先于1942 年由Waddington[2]以“后成論”和“遺傳學(xué)”的合成詞提出。此后多次重提，直到2008年的冷泉港會議，各專家對該概念達(dá)成了共識，即“表觀遺傳學(xué)是指基因表達(dá)的穩(wěn)定和可遺傳的變化，而非DNA序列改變”[3]。在同種生物體的所有細(xì)胞中，除生殖細(xì)胞外，其他細(xì)胞的基因組及DNA序列都是相同的。但是，不同的細(xì)胞類型有其特異的表觀基因組控制細(xì)胞表型，使不同組織細(xì)胞有自己定義的不同于其他組織細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)特征，調(diào)控著生命活動向不同方向運(yùn)行。表觀遺傳機(jī)制包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、印記基因丟失、非編碼 RNA(non-coding RNA，ncRNA)基因調(diào)控等，其中DNA甲基化、組蛋白修飾和ncRNA基因調(diào)控是目前研究較多的機(jī)制。

2 DNA甲基化與肝纖維化

DNA甲基化發(fā)生在胞嘧啶核苷酸中嘧啶環(huán)的第5個碳上，最常見于胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)雙核苷酸中。DNA 復(fù)制時，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基被DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶脫下，并與CpG 雙核苷酸 5′端的胞嘧啶發(fā)生共價結(jié)合，形成 5′甲基胞嘧啶，且這是一個可逆的過程。范鈺琨等[4]以DNA序列最小長度為200bp，GC占比不小于50%，CpG觀察預(yù)期不小于1.4的標(biāo)準(zhǔn)尋找CpG島，結(jié)果顯示CpG島具有非常重要的作用。60%以上基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域含有大量的CpG島，可以與轉(zhuǎn)錄因子高度結(jié)合，高甲基化狀態(tài)會降低其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，學(xué)者們認(rèn)為DNA甲基化與基因沉默有關(guān)，而研究基因轉(zhuǎn)錄區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)對認(rèn)識疾病十分重要。

DNA甲基化分析和基因定位研究表明，在人體器官纖維化的進(jìn)程中，DNA甲基化發(fā)生了顯著的變化[3]。有報告顯示，與器官纖維化進(jìn)程相關(guān)的已知基因，如Thy1、Fli1和Rasal1基因的DNA低甲基化狀態(tài)均與成纖維細(xì)胞和膠原蛋白的生成相關(guān)[5-6]。Zeybel等[7]使用Illumina Infinium珠陣列對29名輕度和重度肝纖維化患者進(jìn)行全基因組甲基化分析，獲得了310個差異甲基化區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)同源異型盒A2基因和組蛋白脫乙?；?的高甲基化狀態(tài)以及蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)因子亞基18的低甲基化狀態(tài)與重度肝纖維化顯著相關(guān)。Agata等[8]發(fā)現(xiàn)DNA甲基化和DNA羥甲基化伴隨著HSC調(diào)節(jié)酶活性的變化和肝纖維化發(fā)展的整個進(jìn)程。

此外，DNA甲基化可以通過靶向調(diào)控肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，影響HSC的活化，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化過程中，CpG位點的Sad1/UNC84結(jié)構(gòu)域蛋白-2(Sad1/UNC84 domain protein-2，SUN2)基因呈高甲基化狀態(tài)，SUN2基因表達(dá)降低，HSC活化；該研究的體外實驗還發(fā)現(xiàn)，用DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷處理活化的HSC-T6細(xì)胞后，SUN2基因的高甲基化狀態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，SUN2表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)肝纖維化的相關(guān)因子被抑制，肝纖維化程度減輕。Moran-Salvador等[10]報告5 -氮雜胞苷和Zeste同系物增強(qiáng)因子2抑制劑(組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)在體外和體內(nèi)均可抑制HSC 的活化。此外，DNA甲基化還可以調(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)。如炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵趨化因子分泌型磷酸蛋白1基因在肝纖維化早期呈低甲基化狀態(tài)[11]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因的高甲基化狀態(tài)可抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性及誘導(dǎo)多種促炎因子生成，放大炎癥效應(yīng)[12]。

3 組蛋白修飾與肝纖維化

H2A、H2B、H3和H4各2個分子共同組成組蛋白8聚體。組蛋白8聚體分子和盤繞在其分子表面的DNA雙螺旋共同組成染色質(zhì)的基本單位-核小體。在兩個相鄰核小體之間的DNA連接線上，結(jié)合著第5種組蛋白。這些球狀組蛋白具有N端長尾，翻譯后可進(jìn)行修飾，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、蘇?；?、泛素化或二磷酸腺苷核糖基化，這些化學(xué)基團(tuán)為特定蛋白復(fù)合物提供了結(jié)合位點，這些特定蛋白復(fù)合物可以激活或沉默基因，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。在肝纖維化的研究中，組蛋白的甲基化和乙?；悄壳把芯枯^多的機(jī)制。

3.1 組蛋白的甲基化 肝纖維化主要受組蛋白H3和H4殘基的調(diào)控，F(xiàn)ei等[13]以人HSC細(xì)胞系LX-2為細(xì)胞模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抑制組蛋白甲基化修飾可抑制低氧誘導(dǎo)因子1核轉(zhuǎn)運(yùn)、自噬體形成以及LX-2細(xì)胞活化，提示組蛋白甲基化修飾在調(diào)節(jié)HSC活化的低氧誘導(dǎo)因子1信號級聯(lián)中發(fā)揮著重要作用。Pollicino 等[14]報告，組蛋白H3與H4的甲基化狀態(tài)對HBV的復(fù)制具有重要作用。Martin-Mateos等[15]的研究證實組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶參與轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信號通路，影響HSC活化。

3.2 組蛋白的乙酰化 組蛋白乙?；梢源龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄，而組蛋白去乙酰化則抑制轉(zhuǎn)錄。Dou等[16]發(fā)現(xiàn)，肝硬化的形成過程中，激活HSC分化為肌成纖維細(xì)胞，需要p300(一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶)的核積累。Park等[17]報告N-羥基-7-(2-萘硫)heptanomide(一種新型組蛋白去乙?；敢种苿?可以抑制膽管結(jié)扎引起的肝纖維化大鼠體內(nèi)HSC的活化，減少肝ECM的積累，抑制肝纖維化進(jìn)展，保護(hù)肝臟功能。此外，Valerio等[18]還發(fā)現(xiàn)組蛋白MaroH2A1.1表達(dá)上調(diào)能夠改善葡萄糖代謝，抑制脂質(zhì)生成基因的表達(dá)，降低脂肪酸的含量，間接發(fā)揮護(hù)肝作用。

組蛋白修飾調(diào)控肝纖維化的過程中常伴有DNA甲基化的參與，兩者共同影響肝纖維化的進(jìn)程。Taghdouini等[19]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞類型的特異性DNA甲基化影響細(xì)胞早期發(fā)育和分化相關(guān)功能，DNA甲基化與人類HSC激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄存在部分一致性，此外，在參與肝纖維化的基因的啟動子和推定的新型增強(qiáng)子元件中，組蛋白的甲基化和乙?；兓秸{(diào)一致。

4 ncRNA基因調(diào)控與肝纖維化

除了DNA甲基化和組蛋白修飾，ncRNA也可以調(diào)控細(xì)胞表型。ncRNA是一種功能性非蛋白編碼的RNA分子，根據(jù)其分子大小和在轉(zhuǎn)錄過程中的功能可分為長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)、小核RNA、核仁小分子RNA、小干擾RNA等。ncRNA廣泛參與染色質(zhì)修飾、基因轉(zhuǎn)錄等過程，還參與基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。其中，肝纖維化與miRNA、lncRNA的相關(guān)研究最多。

4.1 miRNA miRNA被認(rèn)為是HSC活化的關(guān)鍵調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-212超表達(dá)可以通過激活TGF-β信號通路，誘導(dǎo)HSC活化，生成α平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白[20]。高表達(dá)水平的miRNA-214通過抑制Hedgehog通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子Sufu表達(dá)，促進(jìn)HSC活化[21]。miRNA-145可通過靶向調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子鋅指E-框結(jié)合蛋白2，影響Wnt/β-catenin通路，參與肝纖維化過程[22]。至少有一部分lncRNA-p21通過miRNA-17-5p介導(dǎo)的Wnt/β-catenin途徑抑制HSC活化[23]。在肝臟炎癥和纖維化的發(fā)展過程中，miRNA-378在核因子κB-腫瘤壞死因子α軸的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是治療非酒精性脂肪性肝病的潛在靶點[24]。在半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-8和線粒體介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)途徑的參與下，miRNA-21可通過靶向FasL調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡[25]。高表達(dá)水平的miRNA-182和低表達(dá)水平的叉頭框蛋白O1通過反饋磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路，促進(jìn)肝纖維化細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[26]。miRNA-29a可通過抑制Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2和TLR4信號通路進(jìn)而抑制肝纖維化形成[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25可充當(dāng)負(fù)反饋抗纖維化控件，調(diào)節(jié)Notch、Wnt和TGF-β信號傳導(dǎo)之間的交聯(lián)，同時影響多條信號通路，調(diào)控肝纖維化過程[28]。

總之，miRNA可通過負(fù)調(diào)控 TGF-β/Smads、Wnt、Hedgehog、核因子κB、Caspase、PI3K/AKT、TLR等信號通路，介導(dǎo) HSC 的活化、增殖和凋亡，影響ECM代謝和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與肝纖維化的調(diào)控。此外，miRNA還可通過調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)，參與肝纖維化。李貽弘等[29]發(fā)現(xiàn)miRNA-377可結(jié)合早期生長反應(yīng)因子(early growth response l,Egr1)的3′非翻譯區(qū)，進(jìn)而直接抑制Egr1的mRNA翻譯及其蛋白表達(dá)，還可抑制經(jīng)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)后的肝細(xì)胞增殖活性以及經(jīng)血管緊張素Ⅱ刺激后的α平滑肌肌動蛋白、FSP1和Collagen Ⅰ的表達(dá)，從而改變肝細(xì)胞的增殖活性和病理狀態(tài)。

4.2 lncRNA lncRNA與肝纖維化密切相關(guān)。林嘉裕等[30]的一項薈萃分析結(jié)果顯示，在肝纖維化中，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1、漿細(xì)胞瘤多樣異位基因l、被TGFβ活化的長鏈非編碼RNA、鋁介導(dǎo)的p21轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)上調(diào)，母系表達(dá)基因3、生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5、H19、長鏈基因非編碼RNA-p21、缺氧誘導(dǎo)因子1α反義RNA1表達(dá)下調(diào)；在肝硬化中，鋁介導(dǎo)的p21轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、肝癌高表達(dá)基因、lncRNA AK053349、同源框蛋白轉(zhuǎn)錄反義RNA轉(zhuǎn)錄反義RNA表達(dá)上調(diào)，長鏈基因非編碼RNA-p21、母系表達(dá)基因3表達(dá)下調(diào)。以上這些基因的生物學(xué)作用大多與抑制或促進(jìn)HSC活化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增加或減少細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)；部分基因通過參與肝臟炎癥反應(yīng)過程促進(jìn)肝纖維化形成，如肝癌高表達(dá)基因和HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA在乙型肝炎相關(guān)肝硬化中表達(dá)均上調(diào)，肝癌高表達(dá)基因還可直接抑制p18表達(dá)，促使調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞分化，參與肝臟炎癥及纖維化過程。

此外，SCARNA10、小核RNA宿主基因7、癢應(yīng)答基因1的長鏈非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA of scrapie responsive gene 1，lnc-SCRG1)與肝纖維化亦存在關(guān)聯(lián)。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)SCARNA10的lncRNA ENSMUST00000158992在小鼠纖維化的肝臟中表達(dá)上調(diào)，SCARNA10的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)水平在晚期肝纖維化患者的血清和肝臟中增加，且SCARNA10還可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和HSC活化在體外和體內(nèi)促進(jìn)肝纖維化。 Yu等[32]發(fā)現(xiàn)，小核RNA宿主基因7(一種新型的lncRNA)可通過減少miRNA-378a-3p的表達(dá)并減弱其對蓬亂段極性蛋白2的控制，增強(qiáng)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑活性，從而促進(jìn)肝纖維化。Wu等[33]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，lnc-SCRG1(轉(zhuǎn)錄長度為3 118 bp的lncRNA)在人肝硬化組織中表達(dá)上調(diào)13.62倍，定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)證實lnc-SCRG1的表達(dá)水平隨著人肝纖維化的進(jìn)展而增加；他們還發(fā)現(xiàn)lnc-SCRG1可降低三特曲普瑞林蛋白的合成并抑制其靶基因腫瘤壞死因子α和基質(zhì)金屬肽酶2的降解，該研究推測抑制lnc-SCRG1表達(dá)可能是誘導(dǎo)HSC凋亡和減輕人肝纖維化的新治療方法。

5 其他表觀遺傳機(jī)制與肝纖維化

隨著表觀遺傳機(jī)制在肝纖維化中的作用不斷被證實，有學(xué)者根據(jù)其機(jī)制特點反向探索肝纖維化機(jī)制。Pan等[34]的實驗結(jié)果表明，前列環(huán)素合成酶(prostacyclin synthase,PTGIS)基因的啟動子在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中呈高度甲基化狀態(tài)，予DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑處理后，表達(dá)下調(diào)的PTGIS得到改善，HSC活化被抑制，提示PTGIS在HSC活化中有重要作用。

6 小 結(jié)

肝纖維化是肝病發(fā)展的初期階段，如果能在肝纖維化早期控制病情，就能阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化向肝硬化、肝癌發(fā)展。表觀遺傳學(xué)機(jī)制通過調(diào)控HSC及相關(guān)信號分子或信號通路，在HSC 的活化、增殖和凋亡中扮演著重要角色，干預(yù)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。雖然表觀遺傳學(xué)機(jī)制在肝纖維化中的研究尚淺，相關(guān)治療靶點的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)尚不足，但這些機(jī)制均是肝纖維化潛在的診斷依據(jù)和治療靶點。通過觀察肝纖維化過程中的表觀遺傳學(xué)變化，探索肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，可以為肝纖維化的診斷和治療提供全新方案。