鄺 鳴 劉晥蒙 姚 健 霍詩天 劉學(xué)芹

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 3. 湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心, 武漢 430070; 4. 水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 武漢 430070)

天然免疫在機(jī)體抵抗病原體感染中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞中天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活受各種轉(zhuǎn)錄或翻譯修飾以及翻譯后修飾(包括磷酸化、乙?；头核鼗?的調(diào)節(jié)[1]。TRIM蛋白參與許多細(xì)胞過程, 如發(fā)育過程, 腫瘤抑制和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。一些TRIM蛋白通過不同的機(jī)制與抗病毒防御相關(guān),通常由I型IFN誘導(dǎo)或作為調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑對病毒感染作出反應(yīng)[2]。在哺乳動(dòng)物中, TRIM25在p53/Mdm2環(huán)中具有雙重功能： TRIM25可增強(qiáng)p53/Mdm2的豐度, 也可抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性并抑制對DNA損傷的反應(yīng)[3]。人(Homo sapiens)TRIM11在肺癌中發(fā)揮重要作用, 其過表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。人TRIM56通過阻止病毒RNA合成來限制A型和B型流感病毒增殖[5]。除哺乳動(dòng)物外,許多研究表明TRIM蛋白在魚類抗病毒免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。大黃魚TRIM8通過調(diào)節(jié)促炎因子和干擾素信號傳導(dǎo)發(fā)揮抗病毒作用[6]。石斑魚TRIM 32和TRIM39可以抑制虹彩病毒和諾達(dá)病毒的復(fù)制[7,8], 并且一些魚類TRIM蛋白在抗病毒信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用, 例如石斑魚TRIM16負(fù)調(diào)控干擾素免疫反應(yīng)并促進(jìn)DNA病毒的復(fù)制[9]。石斑魚TRIM62促進(jìn)單股正鏈RNA (ssRNA)病毒石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)的復(fù)制[10]。

TRIM家族蛋白包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域, 1個(gè)或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)卷曲螺旋(Coiledcoil)結(jié)構(gòu)域。此外還具有1個(gè)高度可變的C末端, 含有PRY / SPRY結(jié)構(gòu)域, 也稱為B30.2結(jié)構(gòu)域或NHL結(jié)構(gòu)域[11,12]。FinTRIM是在硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的TRIM亞家族, 在病毒感染的虹鱒中被最先鑒定[13]。目前對于finTRIM在魚類免疫系統(tǒng)中的作用研究較少。最近的研究表明, FTR36可以通過IFN途徑激活免疫反應(yīng)從而抑制SVCV的復(fù)制[14]。ftr83的過表達(dá)可以抑制IHNV、VHSV、SVCV的復(fù)制[15]。

鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp, SVC)是由SVCV引起的高死亡率的嚴(yán)重疾病, 屬于彈狀病毒科的鯉春病毒屬的成員。SVCV是一種單股負(fù)鏈RNA(ssRNA)病毒, 編碼五種病毒蛋白并導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖嚴(yán)重?fù)p失[16—18]。盡管SVCV在水產(chǎn)養(yǎng)殖中造成嚴(yán)重?fù)p害, 但對該病毒的致病機(jī)制還了解甚少,且目前尚無針對SVCV的疫苗[19]。

本研究克隆了斑馬魚ftr56, 對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和真核表達(dá)載體的構(gòu)建, 過表達(dá)后檢測其對SVCV復(fù)制的影響, 為研究FinTRIM在天然免疫中的作用及機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑： M199和DMEM細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液購自Hyclone, OPTI-MEM、青霉素-鏈霉素溶液、0.25% Trypsin-EDTA、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司, 結(jié)晶紫購自BIOSHARP公司, 甲基纖維素購自Sigma-Alrich公司, 轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD regeant購自Promega, ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自武漢聚能譯通生物有限公司, SVCV-G單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備, 鼠源His單抗、兔源Actin多抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自于愛博泰克生物科技有限公司, 真核表達(dá)載體pcDNA4.0-His由本實(shí)驗(yàn)室保存, 2×TaqPCR Mix、反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、RNAiso Plus及PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser等購自Takara公司, 蛋白Marker及T4 DNA連接酶購自Thermo公司, DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

主要儀器： 核酸及蛋白凝膠電泳儀、凝膠成像儀為BioRad公司生產(chǎn), 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf);Nanodrop 2000濃度定量儀、-80℃超低溫冰箱為Thermo生產(chǎn), 超凈工作臺(tái)、生物安全柜、生化培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司), 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司), 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler? 480II), ECL化學(xué)發(fā)光儀(美國通用電器), 轉(zhuǎn)膜儀(京六一儀器長), 恒溫水浴鍋(精宏), 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司)。

1.2 細(xì)胞和病毒

SVCV毒株及FHM、ZF4細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存, 分別使用含有10%胎牛血清、和1%雙抗(青霉素-鏈霉素各100 μg/mL)的M199、DMEM培養(yǎng)基中置于28℃, 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 克隆斑馬魚ftr 56 CDS區(qū)全長

根據(jù)實(shí)驗(yàn)說明書, 使用RNAiso Plus試劑提取斑馬魚脾的總RNA, 使用PrimeScript RT?試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)cDNA。根據(jù)NCBI中斑馬魚ftr56 (序列號： XM_003200557.5)CDS序列設(shè)計(jì)引物ftr56-F和ftr56-R, 將PCR產(chǎn)物插入pcDNA4.0-His載體中,構(gòu)建pcDNA4.0-FTR56-His質(zhì)粒。KpnⅠ和XbaⅠ分別加入到上游引物和下游引物中。引物序列見表1。

表1 引物列表Tab. 1 Primers list

1.4 序列分析

使用ClustalX2進(jìn)行序列比對, 并使用ESPript 3.0(http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)呈現(xiàn)。所述系統(tǒng)進(jìn)化樹是基于FTR56的氨基酸序列使用鄰接法(NJ)算法(MEGA版本5.1)構(gòu)成。使用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對FTR56結(jié)構(gòu)域的示意結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

通過qRT-PCR檢測FTR56 mRNA的表達(dá)變化,將長滿單層的ZF4細(xì)胞按照106個(gè)/孔(6孔板)的密度均勻傳代, 待細(xì)胞長至80%—90%時(shí), 吸棄原培養(yǎng)基, 然后用PBS溶液輕微洗滌細(xì)胞1次, 按照5MOI SVCV感染劑量感染ZF4細(xì)胞, 28℃孵育1h后更換成細(xì)胞維持培養(yǎng)基, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),于6h、12h和24h用PBS洗三次, 收取細(xì)胞樣, 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作說明設(shè)置反應(yīng)條件, 通過Light Cycler/Light Cycler 480 System(Roche)分析熒光信號。PCR條件如下： 95℃ 5min,然后40個(gè)循環(huán)的95℃ 15s, 60℃ 20s和72℃ 20s。qRT-PCR的所有引物如表1所示。通過使用2-ΔΔCt(其中Ct是閾值循環(huán))方法將它們與相應(yīng)的對照進(jìn)行比較來計(jì)算相對倍數(shù)變化。進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒感染

將培養(yǎng)的FHM細(xì)胞轉(zhuǎn)接到6孔板。24h后顯微鏡下觀察, 當(dāng)細(xì)胞量鋪滿板底的80%—90%時(shí)使用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。用2 μg的pcDNA4.0-FTR56質(zhì)粒或pcDNA4.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染24h后, 吸棄原培養(yǎng)基, 然后用PBS溶液輕微洗滌細(xì)1次, 按照0.05MOI SVCV感染劑量感染FHM細(xì)胞, 28℃孵育1h后更換成細(xì)胞維持培養(yǎng)基, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后6h、12h和24h后收集上清液用于測定病毒滴度, 收取細(xì)胞用于qRTPCR和蛋白免疫印記。

1.7 蛋白免疫印記(Western blot)

用RIPA裂解緩沖液處理細(xì)胞, 之后進(jìn)行SDSPAGE電泳后將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室溫下用5%脫脂乳封閉1h后, 將膜與小鼠抗His抗體(1：1000稀釋)或小鼠抗SVCV-G (實(shí)驗(yàn)室制備和保存)2h, 兔抗-β-Actin抗體(1：10000稀釋)用作對照, 用TBST洗滌三次后, 然后用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1：2000稀釋)孵育45min, 使用化學(xué)發(fā)光底物和ECL化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。

1.8 空斑實(shí)驗(yàn)

將FHM細(xì)胞接入12孔板, 20h后單層細(xì)胞鋪滿底壁。用無血清DMEM洗滌兩遍。10倍梯度稀釋病毒, 每孔加入500 μL已稀釋的病毒液, 每個(gè)濃度級做三孔重復(fù)。病毒吸附1h后, 除去感染培養(yǎng)基,在28℃下用含有5%FBS和1.5%羧甲基纖維素的M199培養(yǎng)基覆蓋。在第60h, 將細(xì)胞用10%甲醛固定過夜(10—12h)并用0.5%結(jié)晶紫染色3h時(shí), 讀數(shù)并計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次, 結(jié)果相似。使用Prism 6(GraphPad軟件)展示統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果表示為平均值±SDM。使用雙向ANOVA比較數(shù)據(jù)。對于所有比對,P＜0.05被認(rèn)為是顯著的并且用*標(biāo)記,P＜0.01用**標(biāo)記,P＜0.001用***標(biāo)記并且P＜0.0001用****標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 FTR56的序列特征

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示FTR56的進(jìn)化關(guān)系于黑猩猩、牛、鼠的TRIM56分開, 單獨(dú)聚為一簇(圖1)。FTR56具有finTRIM系列典型域結(jié)構(gòu), 包含RING結(jié)構(gòu)域, B-box結(jié)構(gòu)域和PRY / SPRY(B30.2)結(jié)構(gòu)域(圖2)。FTR56的全長CDS長度為1686 bp并編碼了561個(gè)氨基酸。比對結(jié)果表明, 斑馬魚FTR56與其他物種TRIM56的同源性較低, 與人、鼠、牛、黑猩猩TRIM56氨基酸序列相似性為13.57%, 13.61%,14.10%和13.68%。

圖1 Neighbor-joining法建立斑馬魚FTR56系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of zebrafish FTR56 using neighbor-joining methods

2.2 FTR56在FHM細(xì)胞中的過表達(dá)檢測

將FHM細(xì)胞接入12孔板, 20h后單層細(xì)胞鋪滿底壁后, 將pcDNA4.0-His或pcDNA4.0-FTR56-His轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后36h, 用RIPA裂解緩沖液處理細(xì)胞, 使用western blot測定法驗(yàn)證FTR56在FHM細(xì)胞中成功過表達(dá)(圖3)。

2.3 SVCV感染對ftr56 mRNA水平的影響

使用qRT-PCR在6h、12h和24h的時(shí)間點(diǎn)檢測SVCV感染組ZF4細(xì)胞中FTR56的轉(zhuǎn)錄水平并和未感染組進(jìn)行比較, MOI為5, TBP (TATA box binding protein)用作內(nèi)參。與對照組相比, FTR56的轉(zhuǎn)錄水平6h和12h無顯著變化, SVCV感染后24h顯著上調(diào)(圖4)。

2.4 FTR56過表達(dá)抑制SVCV的增殖

為了研究FTR56是否具有抵御病毒感染的能力, 我們檢測了FTR56過表達(dá)對SVCV復(fù)制的影響。將pcDNA4.0-FTR56-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞,同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA4.0-His空載體做為對照。在轉(zhuǎn)染24h后, 以MOI為0.05的劑量, 接種SVCV病毒, 在感染后6h、12h和24h收集細(xì)胞, 通過qRT-PCR檢測SVCV G基因mRNA的表達(dá); 以病毒G蛋白的單抗作為一抗, 通過Western blot檢測SVCV G基因蛋白表達(dá); 收集上清, 通過空斑試驗(yàn)檢測SVCV病毒的增殖滴度。結(jié)果顯示FTR56在感染12h和24h顯著抑制SVCV G mRNA的表達(dá)和蛋白合成(圖5a、5b),同時(shí)在病毒感染6h、12h和24h對病毒的滴度也有顯著抑制作用(圖5c、5d)。結(jié)果表明FTR56對SVCV的復(fù)制具有抑制作用。

圖2 FTR56是硬骨魚類中finTRIM家族的成員Fig. 2 FTR56 is a member of the finTRIM family in teleost fish

圖3 Western blot檢測FTR56在FHM細(xì)胞中的過表達(dá)情況Fig. 3 Western blot assay used to detect the overexpression of FTR56 using anti-His tag mouse monoclonal antibody was used in the test

圖4 ftr56 mRNA在SVCV感染ZF4細(xì)胞6h、12h和24h的相對表達(dá)水平Fig. 4 Relative mRNA expression of ftr 56 in FHM cells infected with SVCV at 6h, 12h and 24h

圖5 過表達(dá)FTR56抑制了SVCV的復(fù)制Fig. 5 Overexpression FTR56 inhibited the replication of SVCV

3 討論

TRIM家族具有E3泛素連接酶活性, 可以影響許多重要的細(xì)胞過程, 如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化、代謝途徑和細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)[11]。在哺乳動(dòng)物中, TRIM家族成員可以調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)先天免疫和抗病毒反應(yīng)[11,12,20,21]。最近的一些研究表明TRIM家族在魚類天然免疫中也發(fā)揮重要作用,來自石斑魚的TRIM8同源物通過增加干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和IRF7的轉(zhuǎn)錄以及增強(qiáng)的IRF3/IRF7誘導(dǎo)的干擾素刺激的應(yīng)答元件(ISRE)啟動(dòng)子活性來發(fā)揮其抗病毒活性[6], 鯉TRIM32和TRIM47可以抑制SVCV的復(fù)制[22,23]。目前對finTRIM研究較少, 迄今為止還沒有關(guān)于魚類FTR56分子功能的研究。本研究克隆并表達(dá)了斑馬魚FTR56, 探究其在病毒感染中的功能。

TRIM蛋白從N末端到C末端由1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域, 1個(gè)或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域, 卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,PRY和SPRY結(jié)構(gòu)域組成的B30.2結(jié)構(gòu)域等[24]。因此, TRIM蛋白也稱為RBCC蛋白。研究表明,TRIM蛋白的RING結(jié)構(gòu)域和B30.2結(jié)構(gòu)域在對病毒感染的反應(yīng)中起重要作用[14], FTR83和FTR82含有1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域, 2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域, 1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域, 以及一個(gè)B30.2結(jié)構(gòu)域[15], FTR36含有1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域, 1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域, 2個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和一個(gè)B30.2結(jié)構(gòu)域[14]。而FTR56具有一個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域, 和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。

TRIM參與多種抗病毒反應(yīng)機(jī)制, 其常作為調(diào)節(jié)因子起作用[25]。許多TRIM基因在病毒感染后上調(diào)并在魚類免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用, 如TRIM8、TRIM13和TRIM25[6,26,27], 斑馬魚中的這些fin-TRIM基因可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。對斑馬魚finTRIM的研究表明, FTR83和FTR36顯著增加IFN表達(dá)并調(diào)節(jié)ISG的表達(dá), 在體外和體內(nèi)介導(dǎo)對RNA病毒的有效抗病毒活性[14,15]。在本研究中FTR56在SVCV感染的ZF4細(xì)胞中mRNA水平24h顯著上調(diào), 在FHM細(xì)胞中過表達(dá)FTR56, 在SVCV感染12h和24h顯著抑制SVCV G的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平, 進(jìn)一步通過空斑實(shí)驗(yàn)檢測, 病毒滴度相比于對照組顯著降低。通過這些研究結(jié)果表明斑馬魚FTR56是一個(gè)關(guān)鍵的抗病毒蛋白。

本研究克隆了斑馬魚ftr56基因, 對其序列和表達(dá)譜的一系列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析, 并進(jìn)行了真核表達(dá)。在FHM細(xì)胞中過表達(dá)FTR56, 發(fā)現(xiàn)其對SVCV的復(fù)制具有顯著抑制作用, 本研究的結(jié)果為深入了解斑馬魚FTR56的抗病毒機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ), 為加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖病毒性疾病的預(yù)防和控制提供新的信息。