李承浩，王萌，任曉亮*

1.天津中醫(yī)藥大學 中藥學院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學 天津市現(xiàn)代中醫(yī)藥國家重點實驗室，天津 301617

杯芳烴是一類由苯酚單元通過亞甲基橋在酚羥基鄰位相連而得到的環(huán)狀低聚物，由于其結構像一個酒杯，故被稱為杯芳烴[1]。在其上緣進行結構修飾，得到磺化杯芳烴。磺化杯6芳烴(SC6A)具有合適的空腔(見圖1)，其上緣的磺酸根增強了杯芳烴空腔的電負性，并為其提供了額外的靜電結合位點，因此SC6A在水相中對有機陽離子展現(xiàn)出極強的鍵合能力[2-4]。此外，由于SC6A容易進行結構修飾，安全無毒，所以在藥物研究中引起了廣泛的興趣[5]。部分中藥單體成分水溶性較差，不僅影響其提取效果，而且會影響口服后的吸收利用度。因此改善中藥單體成分的水溶性是中藥研發(fā)的一大挑戰(zhàn)。SC6A可以在水相中結合客體分子，從而達到增溶效果[6-7]。

圖1 SC6A結構式

本實驗采用高效液相色譜法(HPLC)研究SC6A對中藥單體成分的增溶效果，采用熒光競爭滴定法測定鍵合常數(shù)并闡述其增溶機制，為SC6A在中藥應用方向的研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

荷葉堿(批號：141113)、槲皮素(批號：16062504)和蘆丁(批號：14071231)均購于四川省維克奇生物科技有限公司；毒扁豆堿(批號：YN1103CA14)、奎寧(批號：Z26M8H36891)、烏頭堿(批號：HA001001198)、次烏頭堿(批號：HH001002198)、鉤吻堿(批號：HA001001198)、吳茱萸堿(批號：X26A8P34704)、吳茱萸次堿(批號：C10J6Y1)、茶堿(批號：YN1103CA14)、苦參堿(批號：T22M10F88874)、野百合堿(批號：150921)、莨菪堿(批號：170821)、檳榔堿(批號：140311)、相思子堿(批號：151123)、士的寧(批號：140211)、橙皮苷(批號：140721)、大豆苷元(批號：141121)、大豆苷(批號：141211)、葛根素(批號：140921)、大黃酸(批號：EW410F88874)、大黃素(批號：D43210F88874)、大黃酚(批號：T22M10F88874)、綠原酸(批號：Y23M10K83669)、咖啡酸(批號：W01N9B73863)、原兒茶酸(批號：H21J9Z64031)、沒食子酸(批號：C13O9C72105)均購于四川源葉生物科技有限公司，以上化合物純度均大于98%；SC6A(批號：20181102，純度≥98%)購于東京化成工業(yè)株式會社；羅丹明6G(RH6G)購于成都艾科達化學試劑有限公司；甲醇和乙腈購于美國Sigma公司；蒸餾水購于屈臣氏集團有限公司；三乙胺購于天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器

H2016D型臺式高速離心機(上海知信實驗儀器技術有限公司)；BT125D型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；FA2004A型萬分之一電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；LC-20-AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Cary Eclipse型熒光光譜儀(美國安捷倫公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry?C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；生物堿類單體成分流動相：0.1%三乙胺水溶液(A)-乙腈(B)；黃酮類、蒽醌類、芳香性有機酸類單體成分流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL。等度洗脫條件見表1。

表1 4類中藥單體成分等度洗脫條件

2.2 SC6A對中藥單體成分水溶解性的影響

2.2.1SC6A溶液制備 精確稱定SC6A 223.42 mg，加40 mL水，配成5 mmol·L-1的SC6A儲備液。

2.2.2供試品溶液制備 分別稱取過量的荷葉堿、毒扁豆堿、奎寧、烏頭堿、次烏頭堿、鉤吻堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、茶堿、苦參堿、野百合堿、莨菪堿、檳榔堿、相思子堿、士的寧、槲皮素、蘆丁、橙皮苷、大豆苷元、大豆苷、葛根素、大黃酸、大黃素、大黃酚、綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、沒食子酸28個化合物各2份，分別加入1.0 mL蒸餾水和SC6A溶液，混勻。置于超聲波清洗器中，超聲30 min，8000 r·min-1離心10 min(離心半徑12 cm)，咖啡酸、葛根素、苦參堿用甲醇稀釋5倍，0.22 μm微孔濾膜濾過，即為供試品溶液[8-10]。

2.2.3樣品測定 按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，HPLC分析，記錄峰面積，未加入SC6A的各成分峰面積為A1，加入SC6A后各成分峰面積為A2，按照公式(1)計算峰面積增加倍數(shù)。

峰面積增加倍數(shù)=(A2-A1)/A1

(1)

2.3 熒光競爭法測定SC6A與生物堿類化合物的鍵合常數(shù)

2.3.1樣品制備 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)：取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得。RH6G儲備液：精密稱取RH6G 0.48 mg，加PBS緩沖液1 mL溶解，即得。SC6A儲備液：稱取SC6A 2.50 mg，加PBS緩沖液1 mL溶解，即得。生物堿類化合物儲備液：分別稱取荷葉堿2.95 mg、烏頭堿6.46 mg、次烏頭堿6.32 mg、毒扁豆堿2.75 mg、野百合堿3.25 mg、苦參堿2.48 mg、鉤吻堿3.22 mg、士的寧3.34 mg、相思豆堿2.18 mg、莨菪堿2.89 mg、茶堿1.80 mg、奎寧3.24 mg、檳榔堿2.36 mg，加PBS緩沖溶液1 mL，配成10 mmol·L-1的儲備液。

2.3.2樣品測定 用1 mmol·L-1的SC6A儲備液與1 μmol·L-1的RH6G溶液，進行熒光光譜滴定。加1次補償溶液得到1個熒光光譜，最終由于熒光淬滅效應，RH6G的熒光強度逐漸降低，從而得到一系列熒光光譜，用這些光譜作圖，再取最大發(fā)射波長550 nm的熒光強度作圖。用最小二乘法擬合公式進行擬合，得到SC6A和RH6G的鍵合常數(shù)[11-14]。

用9.8 mmol·L-1的荷葉堿補償溶液與1 μmol·L-1的RH6G溶液和20 μmol·L-1的SC6A溶液，進行熒光光譜滴定。每加1次補償溶液得到1個熒光光譜，最終由于荷葉堿與杯芳烴結合釋放出染料分子，熒光池中RH6G的熒光強度逐漸升高，從而得到一系列熒光光譜，用這些光譜作圖。取最大發(fā)射波長550 nm的熒光強度作圖，通過公式擬合得到SC6A和荷葉堿的鍵合常數(shù)(Ks)。其余樣品均用同法測定。

2.4 統(tǒng)計分析

3 結果與分析

3.1 SC6A對中藥單體成分水溶解度的影響

采用HPLC法測定的28個中藥單體成分加入SC6A溶液前后的樣品峰面積，結果見表2。結果表明，除吳茱萸堿外，SC6A對生物堿類單體成分的水溶解性均具有顯著影響；醌類化合物中大黃酸樣品峰面積差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大部分黃酮類、蒽醌類和芳香性有機酸類單體成分峰面積差異無統(tǒng)計學意義。表明SC6A可顯著降低大黃酸的溶解性，顯著增加生物堿類單體成分的溶解性，對其他單體成分無顯著性增溶作用[15-16]。

表2 SC6A對中藥單體成分水溶解度的影響

續(xù)表2

3.2 直觀分析

以未加入SC6A的28個成分的樣品峰面積評分為1，以各成分加入SC6A后峰面積與加入前的比值作為增溶評分值，評分結果見表3。分值越高，說明SC6A對此成分的增溶效果越好。SC6A對15個生物堿類成分的增溶作用中，效果最好的成分是次烏頭堿，增溶效果排序為次烏頭堿>荷葉堿>烏頭堿>吳茱萸次堿>奎寧>莨菪堿>士的寧>吳茱萸堿>苦參堿>野百合堿>相思子堿>鉤吻堿>毒扁豆堿>茶堿>檳榔堿。SC6A對醌類、黃酮類、芳香性有機酸類12種成分增溶評分在1左右，無顯著增溶作用。

表3 SC6A對28個中藥單體成分的增溶評分

3.3 主成分分析(PCA)

PCA為雙線性模型方法，是一種無監(jiān)督的模式識別方法，其利用方差最大原則，對原始數(shù)據(jù)所包含的多個自變量進行線性擬合，以新的低維變量代替原始高維變量(即主成分)，各主成分之間互不相關，從而這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，且所含的信息互不重疊，進而實現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維[17-20]。本實驗選取生物堿類(荷葉堿、烏頭堿、次烏頭堿)、黃酮類(槲皮素、蘆丁、葛根素)、蒽醌類(大黃素、大黃酚、大黃酸)、芳香性有機酸類(咖啡酸、沒食子酸、綠原酸)各3個成分，對加入SC6A前后水溶液中的峰面積進行綜合PCA。再利用PCA分別描述黃酮類、蒽醌類、生物堿類及芳香性有機酸類成分的樣本分布情況，結果見圖2～3。

從圖2中可明顯看出分為4類：加入SC6A的生物堿類成分、加入與未加SC6A的黃酮類成分、加入與未加SC6A的有機酸類成分、加入與未加SC6A的蒽醌類成分和未加SC6A的生物堿類成分。生物堿類成分在加入SC6A前后明顯聚為2類，而黃酮類、蒽醌類、芳香性有機酸類均沒有此特征。說明SC6A僅對生物堿類成分表現(xiàn)出明顯的增溶效果。

圖2 SC6A對4類中藥單體成分溶解度影響的總體PCA

圖3中，生物堿類化合物加入與不加入SC6A的樣本明顯聚為2類，且分類界限明顯；未加SC6A的樣品分布在第二、三象限；加入SC6A的生物堿類樣品分布在第一、四象限。而蒽醌類化合物也表現(xiàn)出明顯聚為2類，但分布的象限與生物堿類相反。這應該是由于SC6A減小了大黃酸的溶解度造成的。黃酮類與芳香性有機酸類未表現(xiàn)出明顯的聚類效果，說明其增溶效果一般。

圖3 SC6A對中藥單體成分溶解度影響的PCA

3.4 生物堿類成分與SC6A的Ks結果分析

如圖4所示，選取RH6G為染料進行滴定，由于鍵合作用，SC6A包裹RH6G后熒光強度下降，從而得到一系列熒光光譜，擬合后得到SC6A和RH6G的Ks為(4.31±0.15)×104。采取競爭的方法測得13個生物堿與SC6A的Ks，見表4，滴定曲線見圖5。結果表明，每個生物堿類化合物都與SC6A有鍵合作用，其大小順序為次烏頭堿>荷葉堿>士的寧>烏頭堿>苦參堿>奎寧>莨菪堿>野百合堿>相思子堿>鉤吻堿>毒扁豆堿>茶堿>檳榔堿。Ks>5×104的，增溶倍數(shù)都能達到10倍以上，超過1×105能達到50倍以上。

注：A.滴定曲線；B.直接滴定熒光圖；圖中曲線是隨著客體濃度增大，熒光池中RH6G的熒光強度逐漸升高。圖4 SC6A及13個生物堿類單體成分直接滴定熒光圖及滴定曲線

表4 SC6A對生物堿類成分的

為了研究SC6A對生物堿類單體成分增溶作用與Ks的關系，本研究以實驗條件下13個生物堿類成分與SC6A的Ks為橫坐標，SC6A對其增溶倍數(shù)為縱坐標，繪制散點圖，見圖5。SC6A對13個生物堿類成分的增溶作用與Ks呈正相關趨勢，即隨Ks增大，SC6A對其增溶作用也增加。但也有個別成分偏離相關曲線，這應該是由于增溶效果除了與Ks相關，還與生物堿自身溶解性有關聯(lián)。

圖5 SC6A對13個生物堿類成分的增溶作用與Ks的關系

4 討論

本實驗采用HPLC分析SC6A對中藥單體成分的增溶作用，采用SPSS分析、直觀分析、PCA方法分析SC6A的增溶效果，采用熒光競爭滴定測定SC6A與生物堿類單體成分的鍵合常數(shù)，分析其與溶解度的關系。研究結果表明，SC6A對生物堿類單體表現(xiàn)出明顯的增溶作用，這可能是由于SC6A上緣的磺酸根與生物堿類的氮原子具有較強的鍵合作用。其對黃酮類、蒽醌類、芳香性有機酸類均未展現(xiàn)出明顯的增溶作用。而SC6A對大黃酸的溶解性有降低作用，可能是因為SC6A溶液呈酸性，抑制大黃酸中-COOH電離而使其溶解性變?nèi)?，但對芳香性有機酸類成分未顯現(xiàn)出降低溶解度的作用。通過Ks的測定發(fā)現(xiàn)，大部分生物堿單體增溶效果與Ks呈現(xiàn)正相關，且與自身溶解度有關，客體成分自身溶解性較好的則增溶效果會降低。本實驗總結出SC6A對中藥單體成分的增溶規(guī)律與機制，以期為SC6A在中藥應用方面的研究提供參考。