阮慶婷，張羽，黃美禎，潘春曲，謝勝

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

功能性便秘(FC)是指由非器質(zhì)性原因引起的便秘，主要表現(xiàn)為排便困難、排便次數(shù)減少或有排便不盡感[1-2]。隨著生活方式和飲食習(xí)慣的改變、社會(huì)老齡化以及過度使用瀉藥等情況發(fā)生，F(xiàn)C的發(fā)病率越來(lái)越高[3-4]。當(dāng)代醫(yī)學(xué)對(duì)FC發(fā)病機(jī)制的研究較多，可能與腸道菌群失調(diào)[5]、腸道水液代謝[6-7]、腸神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)[8]等多種因素有關(guān)。

小承氣湯(Xiaochengqi Decoction)出自《傷寒論》，由大黃、厚樸、枳實(shí)3味藥組成，具有輕下熱結(jié)的功效。從方劑組成和用量來(lái)說(shuō)，小承氣湯較大承氣湯少芒硝之品，厚樸、枳實(shí)量亦減，其治痞滿燥實(shí)堅(jiān)未全者，除芒硝，欲其無(wú)傷下焦真陰也。適用于腑實(shí)已成而未甚之小熱小實(shí)證[9-10]。方中大黃所含的蒽醌類衍生物可通過增加腸黏膜蠕動(dòng)，抑制腸內(nèi)水分吸收，從而促進(jìn)排便[11]。厚樸所含的厚樸酚可改善胃腸運(yùn)動(dòng)障礙[12]。枳實(shí)主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等成分，對(duì)胃腸道平滑肌具有興奮作用[13]，其中所含的揮發(fā)油類可提高結(jié)腸的推進(jìn)率，可起到破氣除脹、消積導(dǎo)滯的作用[14-15]。上述諸藥配合成方，具有較好的瀉下作用[16]。胡時(shí)友[17]研究發(fā)現(xiàn)，卒中后便秘患者運(yùn)用小承氣湯配合中藥穴位貼敷治療后，可有效地改善患者的FC癥狀。李娜等[18]通過臨床試驗(yàn)觀察到，糖尿病合并實(shí)熱便秘的患者在使用加味小承氣湯治療后取得了較好的療效。

中藥成分具有多樣性、復(fù)雜性的特點(diǎn)，其作用機(jī)制仍待探索，因而以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在中藥研究中得到了廣泛的應(yīng)用[19-20]，在闡釋中藥及中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用方面提供了系統(tǒng)性支持[21-22]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子網(wǎng)絡(luò)水平系統(tǒng)探索小承氣湯治療FC的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 小承氣湯關(guān)鍵化學(xué)成分篩選

通過借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php)檢索小承氣湯的所有有效成分，藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(oral bioavail-ability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[23]。最后得到的成分作為小承氣湯的活性成分。

1.2 小承氣湯-FC共同作用靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索小承氣湯關(guān)鍵化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)查詢與靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的人類基因名稱，再與通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www. genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.omim. org/)篩選出的FC的蛋白靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，利用基迪奧生物平臺(tái)(https：//www.omicshare.com/)對(duì)小承氣湯化學(xué)成分靶標(biāo)與FC相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行分析，得到99個(gè)共同作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的可視化

將1.1項(xiàng)下得到的小承氣湯活性成分及1.2項(xiàng)下得到的小承氣湯-FC共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，得到藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以節(jié)點(diǎn)表示關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)，以邊來(lái)表示節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將小承氣湯與FC的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/version 11.0)，使用“Multiple proteins”功能，物種設(shè)為“Homo sapiens(人類)”，設(shè)置最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)0.4，并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，分別以Png、TSV格式保存。紅色連線代表基因融合證據(jù)，藍(lán)色連線代表基因共進(jìn)化證據(jù)，黃色連線代表文本挖掘證據(jù)等。再利用Cytoscape里的Centiscape 2.2插件計(jì)算度(degree)值，根據(jù)度值≥39作為篩選節(jié)點(diǎn)條件，并繪制柱狀圖。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//bioconductor.org/bioc Lite.R)查詢藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因的ID。利用R語(yǔ)言安裝Bioconductor平臺(tái)相關(guān)安裝包[24]，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析(P≤0.05)，輸出結(jié)果并繪制相關(guān)柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 小承氣湯有效成分篩選

共檢索到小承氣湯中269個(gè)化合物，其中大黃92個(gè)、厚樸139個(gè)、枳實(shí)65個(gè)。根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選后得到的40個(gè)化合物，其中大黃16個(gè)、厚樸2個(gè)、枳實(shí)22個(gè)。根據(jù)OB值排序，前30個(gè)化合物來(lái)源及其OB和DL值見表1。

表1 小承氣湯化學(xué)成分(根據(jù)OB排序前30位)

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索40個(gè)關(guān)鍵化合物的靶點(diǎn)信息(共158個(gè))，再通過UniProt進(jìn)行基因ID的注釋(有的關(guān)鍵化合物的靶點(diǎn)信息在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)找不到對(duì)應(yīng)的symbol則剔除)。通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與FC相關(guān)的靶點(diǎn)基因，去重后共4556個(gè)。進(jìn)一步得到小承氣湯化學(xué)成分靶標(biāo)與FC相關(guān)靶標(biāo)的交集，共99個(gè)靶點(diǎn)基因，得到相應(yīng)的韋恩圖，見圖1。

注：橙色為FC靶點(diǎn)；綠色為小承氣湯靶點(diǎn)；黃色為共有靶點(diǎn)。圖1 小承氣湯與FC作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

小承氣湯與FC作用靶點(diǎn)相關(guān)的關(guān)鍵化學(xué)成分有26種，見表2。再將疾病-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，見圖2。

注：紫色圓形代表藥物；黃色圓形代表26個(gè)關(guān)鍵化學(xué)成分；紅色圓形代表疾?。痪G色圓形代表99個(gè)靶點(diǎn)。圖2 小承氣湯藥物、活性成分與FC關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 小承氣湯“成分-靶點(diǎn)”

續(xù)表2

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將小承氣湯-FC共有的99個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)，共涉及98個(gè)節(jié)點(diǎn)、1421個(gè)邊，平均節(jié)點(diǎn)度為28.7。運(yùn)用Centiscape 2.2軟件計(jì)算該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值，利用R語(yǔ)言軟件，選取度值前30位的節(jié)點(diǎn)繪制柱狀圖(見圖4)。這30個(gè)核心蛋白是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的靶心，是小承氣湯治療FC的潛在靶點(diǎn)。

注：節(jié)點(diǎn)表示蛋白；邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)。圖3 小承氣湯治療FC相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 小承氣湯治療FC相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)

2.5 GO富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示，共獲得108條GO生物過程，排名前20的生物學(xué)功能主要為核受體活性(8個(gè)靶點(diǎn)：AR、ESR2、ESR1、PGR、PPARG、RXRA、PPARA、SREBF1)、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合(8個(gè)靶點(diǎn)：AR、ESR2、ESR1、PGR、PPARG、RXRA、PPARA、SREBF1)、磷酸酶結(jié)合(12個(gè)靶點(diǎn)：BCL2、PPARG、AKT1、MAPK3、MAPK1、SOD1、HMGCR、PPARA、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14)、類固醇激素受體活性(7個(gè)靶點(diǎn)：AR、ESR2、ESR1、PGR、PPARG、RXRA、PPARA)、細(xì)胞因子活性(11個(gè)靶點(diǎn)：TNFSF15、IL1B、ADIPOQ、TIMP1、VEGFA、IL10、IL6、IL2、IFNG、IL4、CD40LG)、蛋白磷酸酶結(jié)合(9個(gè)靶點(diǎn)：BCL2、PPARG、AKT1、SOD1、HMGCR、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14)；泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(12個(gè)靶點(diǎn)：SCN5A、JUN、BCL2、CASP8、CDKN1A、CCNB1、RELA、GS3KB、EGFR、RB1、NFKBIA、MDM2)等，見圖5。結(jié)果表明，小承氣湯可以通過參與多種生物學(xué)調(diào)控過程而發(fā)揮治療FC的作用。

圖5 小承氣湯活性成分治療FC關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過程富集分析

2.6 KEGG富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，小承氣湯治療FC的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)共獲得158條富集結(jié)果，主要富集的通路共有35條，其中顯著性最大的前20條通路見圖6。主要涉及白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路(PI3K/Akt signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等，表明小承氣湯的有效成分可以通過不同的靶點(diǎn)作用于不同的通路治療FC。而乙型肝炎(hepatitis B)、前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、大腸癌(colorectal cancer)等通路提示小承氣湯不僅可以治療FC，也還可以拓展治療其他疾病，體現(xiàn)了異病同治的原則。

圖6 小承氣湯對(duì)FC作用靶點(diǎn)的KEGG分析

3 討論

FC在中醫(yī)學(xué)當(dāng)中屬于“便秘”“秘結(jié)”等范疇，早在西漢末年，《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有關(guān)于便秘的記載，其描述為“大便難”“后不利”。此病與大腸傳導(dǎo)失常及肺、肝、腎、脾、胃等臟腑的功能失調(diào)有關(guān)[25]。臨床上FC常與其他疾病并見，如焦慮、抑郁[26]、心絞痛、心律失常、肝性腦病、腦卒中等[27-30]。

《傷寒論》第213條記載：“陽(yáng)明病，其人多汗，以津液外出，胃中燥，大便必硬，硬則譫語(yǔ)，小承氣湯主之。若一服譫語(yǔ)止者，更莫復(fù)服?！毙〕袣鉁菑堉倬爸髦侮?yáng)明腑實(shí)燥熱輕癥之經(jīng)典方。方中大黃為君，味苦，性寒，長(zhǎng)于瀉下攻積、瀉熱通便、蕩滌腸胃邪熱積滯；厚樸味苦，性溫，能除滿消脹；枳實(shí)味苦，性微寒，可行氣導(dǎo)滯除痞[31]?！侗静菅芰x》指出：“枳實(shí)、枳殼，一物也。小則其性酷而速，大則其性詳而緩。故張仲景在承氣湯中用枳實(shí)，取其疏通決泄、破結(jié)實(shí)之義。”[32]。小承氣湯中三藥聯(lián)合加速積滯排泄，臨床應(yīng)用小承氣湯加減治療FC效果頗佳，然而其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。本研究通過對(duì)小承氣湯的有效成分、靶點(diǎn)、FC疾病靶點(diǎn)、GO及KEGG通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)不同成分之間存在多靶點(diǎn)協(xié)同作用。

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到的主要活性成分有大黃酸、蘆薈大黃素、異橙黃酮、柚皮苷、新橙皮苷等。蘆薈大黃素是存在于大黃等中藥植物中的主要生物活性蒽醌類化合物，已有證據(jù)表明，蘆薈大黃素具有多種藥理作用，包括抗癌、抗病毒、抗炎、抗菌、抗寄生蟲、保護(hù)神經(jīng)和保護(hù)肝臟等作用。黃志芳等[33]經(jīng)研究表明，P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)可作為胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中重要的興奮性和抑制性胃腸肽，廣泛分布在胃腸道中。王健等[34]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可能是通過增加FC模型小鼠肌間的神經(jīng)叢SP、血管活性腸肽的含量，增強(qiáng)了FC小鼠的腸道動(dòng)力，從而改善便秘的癥狀。然而亦有研究報(bào)道蘆薈大黃素有肝毒性和腎毒性等不良反應(yīng)[35]。新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷具有促胃排空和提高小腸動(dòng)力作用，其中橙皮苷發(fā)揮作用的機(jī)制可能與其增加胃動(dòng)素的分泌有關(guān)[36]。研究表明，橙皮苷可通過5-羥色胺4受體/環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路(5-hydroxytryptamine 4R/cAMP signaling pathway)改善FC模型大鼠的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)[37]。大黃酸、大黃素不僅具有均有較好的緩解便秘的作用[38-39]，其還能夠清除氧自由基，通過抑制光誘導(dǎo)單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，表明大黃素和大黃酸有作為抗動(dòng)脈粥樣硬化劑的潛力。因此可推測(cè)大黃在發(fā)揮通便作用的同時(shí)，亦可能起到了預(yù)防心血管事件發(fā)生的作用[40]。

通過PPI分析，找到30個(gè)關(guān)系密切的核心基因，說(shuō)明這些靶點(diǎn)基因密切參與了小承氣湯對(duì)FC的治療。其中PTGS2和各活性成分關(guān)系較為密切，PTGS又叫環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)，是生物體內(nèi)前列腺素合成起始步驟的關(guān)鍵酶，是生物活性脂類調(diào)節(jié)物包括前列環(huán)素、前列腺素和血栓烷素等各家族的前體。PTGS2即為誘導(dǎo)型COX-2，其是PTGS的同工酶之一，與腸道運(yùn)動(dòng)功能存在密切聯(lián)系。研究表明，在結(jié)腸不完全機(jī)械性腸梗阻大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)梗阻近端擴(kuò)張的腸環(huán)行平滑肌收縮活性明顯下降時(shí)，COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)；免疫組化研究顯示，COX-2在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中被選擇性誘導(dǎo)，體外拉伸結(jié)腸肌條或培養(yǎng)平滑肌能顯著誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，而在COX-2基因缺陷型小鼠中，結(jié)腸梗阻中肌肉收縮力的損害減弱[41-42]。然而，小承氣湯是否通過調(diào)節(jié)COX從而發(fā)揮治療FC的作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase，MAPK1)、MAPK3、MAPK8、MAPK14是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)中重要的信號(hào)分子。當(dāng)細(xì)胞表面受到各種不同的刺激后，MAPK信號(hào)通路被激活，將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核內(nèi)部，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，引起細(xì)胞反應(yīng)。p38 MAPK是MAPKs家族成員之一[43-44]，p38 MAPK信號(hào)通路可能與水通道蛋白3(AQP3)、水通道蛋白9(AQP9)的表達(dá)有關(guān)聯(lián)，而AQP可影響結(jié)腸對(duì)水分的吸收和腸液分泌，從而導(dǎo)致便秘的發(fā)生[45-46]。

KEGG通路富集結(jié)果表明，小承氣湯治療FC主要與乙型肝炎信號(hào)通路、前列腺癌信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路等有關(guān)。研究表明當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制時(shí)，Cajal細(xì)胞凋亡減少，可起到治療慢傳輸型便秘的作用[47]。孫宇等[48]研究發(fā)現(xiàn)，化瘀通便湯對(duì)慢傳輸型便秘大鼠PI3K-Akt信號(hào)通路具有一定的調(diào)控作用，說(shuō)明PI3K-Akt信號(hào)通路在治療慢傳輸型便秘的過程中扮演了重要的角色。AGEs是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的非酶促糖基化和氧化產(chǎn)生的一組復(fù)雜的化合物，這主要是由于衰老和某些病理狀況(如高血糖癥)引起。具有最佳化學(xué)特征的AGEs包括N-ε-羧基-甲基-賴氨酸(CML)、N-ε-羧基-乙基-賴氨酸(CEL)和咪唑酮等。AGEs的主要受體稱為RAGE或AGER，屬于免疫球蛋白超家族，已被描述為模式識(shí)別受體。AGE-RAGE信號(hào)傳導(dǎo)引起涉及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活，然后引發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的活化。NF-κB促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α)以及多種與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因(包括血管細(xì)胞黏附分子-1、組織因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和晚期糖基化終產(chǎn)物受體)的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，這些信號(hào)通路與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)[49]。已有研究表明，糖尿病患者因體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖，可導(dǎo)致胃腸神經(jīng)功能紊亂，從而引發(fā)FC[50-51]。藥理研究表明，小承氣湯具有保肝的作用[52]，而本研究KEGG富集的主要通路之一是乙肝信號(hào)通路，推測(cè)小承氣湯可能通過乙肝信號(hào)通路發(fā)揮乙肝和FC的作用，表明了小承氣湯療效的多樣性。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)驗(yàn)證了小承氣湯多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，不僅預(yù)測(cè)了小承氣湯治療FC的主要作用機(jī)制，還拓寬了其臨床的用藥思路，為后續(xù)研究提供參考。