劉鴻宇 余新光 陳凌

惡性膠質(zhì)瘤是臨床最為常見的原發(fā)性腦腫瘤，患者預后不良［1］，尤以膠質(zhì)母細胞瘤預后最差，目前的標準治療方案是通過手術最大程度切除腫瘤并輔以同步放化療和替莫唑胺輔助化療，但治療后中位生存期僅14.6個月［2］。盡管近年在膠質(zhì)瘤分子機制方面不斷獲得新的認識并為分子靶向治療付出巨大努力，但治療效果并無明顯改善，因此，迫切需要探索新的有效治療方法。惡性膠質(zhì)瘤預后不良的主要原因包括：（1）對傳統(tǒng)放化療的抵抗性。（2）血?腦屏障的存在。（3）腫瘤浸潤性較強。（4）大腦的相對免疫豁免狀態(tài)。（5）存在具有自我更新能力和對常規(guī)治療抵抗的腫瘤干細胞（TSCs）［3?5］。隨著對惡性膠質(zhì)瘤研究的不斷深入，涌現(xiàn)出針對此類腫瘤基本發(fā)病機制及其免疫微環(huán)境的治療方法，可能是對現(xiàn)有標準治療方案的較好補充［3，6］。

病毒治療惡性腫瘤最早可追溯到一個多世紀以前，De Pace［7］在 1912年的病例報告中描述 1 例宮頸癌患者被犬咬傷接種巴斯德減毒狂犬病疫苗后，病情出現(xiàn)好轉(zhuǎn)；在隨后開展的治療中，有30例接種狂犬病疫苗的黑色素瘤患者病情明顯好轉(zhuǎn)［8?9］。感染天然病毒如麻疹病毒的臨床研究也證實，病毒可使伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤患者的腫瘤細胞消失［10?11］。隨著治療中出現(xiàn)的嚴重不良事件和藥物化療的興起，阻礙了病毒療法早期研究的進一步開展［6］。既往30年重燃對經(jīng)基因工程改造的病毒治療惡性膠質(zhì)瘤的興趣，分子生物學和遺傳學領域的研究進展使對病毒進行合理修飾再治療腫瘤成為可能。病毒療法分為兩種類型，即復制能力較強的溶瘤病毒（OVs）和缺乏復制能力的病毒載體進行治療基因的傳遞［6］。溶瘤病毒通過病毒特異性感染腫瘤細胞，以及釋放病毒后代誘導腫瘤細胞溶解。1991年，Martuza等［12］發(fā)現(xiàn)一種 1型單純皰疹病毒（HSV?1）?胸苷激酶（tk）缺失突變體（dlsptk），其在靜止細胞（如神經(jīng)元）中復制能力較弱，由于tk基因缺失，該病毒需依靠旺盛分裂的細胞為DNA復制提供胸苷激酶，在惡性膠質(zhì)瘤動物模型中顯示出令人振奮的療效。但是，由于tk基因缺失，該病毒對以胸苷激酶為靶點的抗病毒藥物（如阿昔洛韋和更昔洛韋）產(chǎn)生耐藥性，考慮其缺乏安全性，故至今未能進入臨床試驗［1］。盡管如此，該項溶瘤病毒治療膠質(zhì)瘤的動物實驗仍是一件里程碑事件。此后10年，有兩項經(jīng)基因工程改造的HSV?1病毒治療惡性膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果發(fā)表［13?14］，惡性膠質(zhì)瘤的病毒療法逐漸被證實是安全的。上述研究均證實經(jīng)基因改造的病毒治療腫瘤的可行性和實用性，為臨床應用提供了良好的理論依據(jù)。本文擬重點介紹幾種已進入臨床試驗的溶瘤病毒療法（表 1）［13?29］。

表1 溶瘤病毒治療膠質(zhì)瘤的相關臨床試驗Table 1. Clinical trails of OVs in the treatment of glioma

一、1型單純皰疹病毒

HSV?1為大型雙鏈DNA病毒，是常見的人類病原體，長期潛伏于人體內(nèi)并有終身感染的可能［30］。HSV?1病毒是嗜神經(jīng)病毒，參與溶瘤的基因與神經(jīng)毒性基因不同，允許腫瘤細胞有條件地復制和操縱溶瘤基因［1］。HSV?1病毒的附加安全特性是當tk基因完整時，其對阿昔洛韋和更昔洛韋敏感，從而提高該病毒用于臨床試驗的安全性。

自1991年dlsptk病毒在惡性膠質(zhì)瘤動物模型中取得一定成果后［12］，又設計出多種HSV?1病毒突變體并用于降低神經(jīng)毒性，同時保留其感染和裂解分裂活躍的腫瘤細胞的能力［21，31?34］。這些減毒突變體包括刪除雙拷貝的γ134.5基因或?qū)⑼庠椿騦acZ插入UL39基因，γ134.5基因編碼受感染細胞蛋白34.5（ICP34.5），激活磷酸酶，再去磷酸化真核翻譯起始因子 2α（eIF2α），恢復受感染細胞蛋白（ICP）的合成，發(fā)揮神經(jīng)毒性作用［1，31］；刪除γ134.5基因可移除部分延遲激活的轉(zhuǎn)錄本，預防病毒在最初感染后建立潛伏期［1，32］。UL39基因編碼核糖核苷酸還原酶的大亞基ICP6，是神經(jīng)元等有絲分裂后細胞復制所必需的［1］。但在分裂旺盛的細胞中，UL39基因突變體在一些特殊細胞狀態(tài)下（如不分裂細胞或39.5℃以上高溫）嚴重影響病毒復制［33］，從而允許病毒有條件地持續(xù)進行復制［1］。這種核糖核苷酸還原酶突變不僅能夠限制病毒復制至分裂旺盛的細胞，同時可以增加病毒對阿昔洛韋的敏感性，進而提高藥物的安全性［34］。

目前，已有3種HSV?1型溶瘤病毒株（包括HSV1716、G207、G47Δ）在膠質(zhì)瘤患者中完成Ⅰ期臨床試驗，評價另2種HSV?1型溶瘤病毒株（包括M032和QNestin34.5）有效性和安全性的臨床試驗正在進行中［21］。

1.HSV1716 HSV1716（Seprehvir?，美 國 Virttu Biologics公司）是雙拷貝神經(jīng)毒性基因γ134.5缺失的第1代溶瘤性HSV，可在旺盛分裂的細胞中選擇性復制。最早的一項關于HSV1716的Ⅰ期臨床試驗納入9例復發(fā)膠質(zhì)瘤患者，于瘤內(nèi)接種噬菌斑形成單位（PFU）高達100×103的HSV1716，治療期間耐受性良好，未誘發(fā)單純皰疹病毒性腦炎；4例患者治療后生存24個月［14］。另一項針對HSV1716的Ⅰ期臨床試驗納入12例惡性膠質(zhì)瘤患者，予單次瘤內(nèi)接種HSV1716（100×103PFU），治療4～9天后于10例患者的腫瘤遠隔部位檢測到病毒DNA；5例檢測到明顯的HSV特異性IgG和IgM水平升高，表現(xiàn)出特異性免疫應答；3例經(jīng)手術切除聯(lián)合HSV1716治療后達到平均 2 年的臨床穩(wěn)定期［15?16］。

2.G207 G207為雙拷貝γ134.5基因缺失并將外源性基因lacZ插入UL39基因從而使ICP6失活的HSV?1病毒突變體，支持病毒在旺盛分裂的細胞中有條件地復制，有效性在小鼠和非人類靈長類動物實驗中得到較好的驗證［35?37］。2000 年，Markert等［13］首次報告G207治療惡性膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果，21例復發(fā)或進展期膠質(zhì)瘤患者在標準治療方案（最大程度手術切除輔以術后放射治療）后接種G207，最低劑量為1×106PFU接種于單個腫瘤位點、最大劑量為3×109PFU接種于5個腫瘤位點，未見明顯神經(jīng)毒性反應和嚴重不良事件，8例治療后1個月MRI增強掃描可見腫瘤體積縮小。2009年，該項研究團隊發(fā)表另一項Ⅰb期臨床試驗結(jié)果，6例膠質(zhì)瘤患者共接種2次總劑量為1.15×109PFU的G207，治療1個月內(nèi)病情穩(wěn)定，無明顯不良事件和單純皰疹病毒性腦炎，中位生存期為6.6個月；并在所有患者腫瘤樣本中檢測到編碼HSV DNA聚合酶的病毒RNA，但未在血液或唾液中檢測到病毒［17］。2014年，該項研究團隊又公布一項最新的Ⅰ期臨床試驗，旨在探討G207與放射治療聯(lián)合治療復發(fā)膠質(zhì)瘤的有效性，9例患者于放射治療（5 Gy）前24小時瘤內(nèi)接種 G207（1×109PFU），均耐受良好，治療后中位生存期為 7.5 個月［18］。

3.G47Δ G47Δ是在G207中刪除α47基因而構(gòu)建的病毒突變體［19］。目前已完成其治療膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗，但試驗結(jié)果尚未見諸報道。此外，日本的一項關于G47Δ治療殘留或復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者的Ⅱ期臨床試驗正在進行中［38］。

二、溶瘤腺病毒

腺病毒是一種雙鏈、無包膜的DNA病毒，是常見的人類病原體，通常可引起輕度上呼吸道感染癥狀［30］。人腺病毒5型是研究最多的溶瘤腺病毒之一，是多基因工程病毒制劑的關鍵角色。通過E1A和E1B基因缺失可以構(gòu)建條件復制型溶瘤腺病毒。Δ?24?RGD腺病毒（DNX?2401）是在E1A基因中刪除24個堿基對，并且將RGD?motif插入腺病毒Fiber的H?loop區(qū)段中，使病毒可以通過整合素αvβ3或αvβ5（富集于腫瘤細胞）進入腫瘤細胞，從而增強病毒的選擇性復制［20，39］。

ONYX?015是一種E1B基因缺失產(chǎn)物，可以有條件地通過失調(diào)的P53信號轉(zhuǎn)導通路在腫瘤細胞中復 制［40?41］。 2004 年，Chiocca 等［42］首 次 發(fā) 表 一 項ONYX?015治療膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗，納入24例惡性膠質(zhì)瘤患者，通過在10個腫瘤位點接種不同劑量的ONYX?015隨機分為4組，即10×106PFU組、100×106PFU組、1×109PFU組、10×109PFU組，均未發(fā)現(xiàn)嚴重不良事件，但亦未觀察到明顯抗腫瘤效應，中位生存期僅為 6.2 個月。此后，Lang等［22?23］發(fā)表一項DNX?2401治療復發(fā)膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果，25例單次瘤內(nèi)接種DNX?2401［（10～30000）×106VP，A組］，12例經(jīng)永久性植入導管在多個腫瘤位點接種DNX?2401［（10～30000）×106VP，B組］，治療后14天行手術切除腫瘤并移除導管，再次接種相同劑量的DNX?2401。其結(jié)果顯示，A組有5例患者生存期＞3年，其中3例腫瘤體積縮小95%；B組伴隨CD8+T細胞浸潤和跨膜T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子?3（TIM?3）的表達下調(diào)，DNX?2401在腫瘤中很好地復制并誘導腫瘤細胞裂解，表明DNX?2401可在部分膠質(zhì)瘤患者中實現(xiàn)持久的免疫應答，從而證實DNX?2401通過直接細胞裂解和增強免疫應答而發(fā)揮溶瘤作用，并有望未來與其他免疫調(diào)節(jié)治療聯(lián)合應用。目前，有兩項有關DNX?2401聯(lián)合治療的Ⅰ期臨床試驗正在進行中：一項為DNX?2401與替莫唑胺聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤（試驗編號：NCT01956734），另一項為 DNX?2401單純或與干擾素?γ（IFN?γ）聯(lián)合治療復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的Ⅰb期臨床試驗（試驗編號：NCT02197169）。

三、呼腸孤病毒

呼 腸 孤 病 毒（pelareorep，Reolysin?，加 拿 大Oncolytics Biotech公司）是無包膜的雙鏈RNA病毒，通常與人類輕度或亞臨床呼吸道或腸道感染癥狀有關［30］。該病毒具有獨特的雙鏈RNA基因組，通過與蛋白激酶R途徑相互作用，使其對Ras信號上調(diào)的腫瘤具有自然選擇性［24］。在生理狀態(tài)下，病毒的雙鏈RNA激活蛋白激酶R，阻止蛋白質(zhì)合成，促進細胞凋亡；而在多種腫瘤細胞中通過表皮生長因子受體（EGFR）基因突變上調(diào)Ras信號而抑制這一作用［43］。盡管激活的Ras信號對呼腸孤病毒的復制很重要，但其溶瘤機制尚不明確［44］。2008年，F(xiàn)orsyth等［45］首次發(fā)表呼腸孤病毒治療膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果，納入12例復發(fā)膠質(zhì)瘤（WHOⅢ～Ⅳ級）患者，通過立體定向方式將呼腸孤病毒（劑量自10×106TCID50增至1×109TCID50）接種于3個腫瘤位點，治療過程中觀察到Ⅰ～Ⅱ級不良事件，主要為與腫瘤進展相關的運動強度下降，但未達到最大耐受劑量，治療后6周，10例腫瘤進展、1例病情穩(wěn)定，其中位生存期達21周，其中1例甚至生存54個月。2014年，Kicielinski等［25］的多中心臨床試驗共納入15例復發(fā)膠質(zhì)瘤患者，采用“對流增強輸送”的方法即持續(xù)低壓下將病毒經(jīng)導管注射至腫瘤部位，并于瘤內(nèi)接種5種劑量的呼腸孤病毒（0.10×109、0.30×109、1×109、3×109和10×109TCID50），治療期間5例出現(xiàn)Ⅰ～Ⅱ級不良事件如癲發(fā)作，1例出現(xiàn)Ⅲ級不良事件如抽搐發(fā)作；僅在少數(shù)患者中觀察到抗腫瘤效應：2例病情穩(wěn)定、1例達到部分緩解、12例疾病進展，中位生存期為20周。呼腸孤病毒對膠質(zhì)瘤的治療效果可能通過與其他藥物如貝伐單抗等的聯(lián)合應用而改善。

四、副黏病毒

副黏病毒（paramyxovirus）是一種包括麻疹病毒（measles virus）和新城疫病毒（NDV）在內(nèi)的負鏈RNA病毒家族。麻疹病毒是一種具有高度傳染性的人類病原體，可以引起特征性紅斑的斑丘疹，在罕見情況下還可以導致亞急性硬化性全腦炎。NDV病毒主要是一種禽類病原體，在人類中僅引起輕微癥狀［26］。

早在 1955年，F(xiàn)lanagan等［46］即提出，NDV 病毒進入艾氏腹水癌細胞時具有復制和裂解腫瘤細胞的能力。隨后，在各類腫瘤動物模型中開展早期研究，其中在神經(jīng)母細胞瘤和纖維肉瘤中取得令人振奮的療效［47?48］。目前，針對 NDV 病毒的兩種減毒菌株（包括MTH?68/H和NDV?HUJ）均已進入膠質(zhì)瘤的早期臨床試驗階段。（1）MTH?68/H 病毒：1999年，Csatary和 Bakács［49］詳細報告 1 例 14 歲男性復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患兒的治療過程，2年內(nèi)多次靜脈注射MTH?68/H病毒，腫瘤體積明顯縮小。2004年，該研究團隊采用相同方法治療4例難治性高級別膠質(zhì)瘤病例（3例兒童、1例成人），生存期達5～9年；至結(jié)果發(fā)表時，所有患者仍生存并繼續(xù)接受MTH?68/H病毒治療，生活質(zhì)量明顯改善，幾乎未見腫瘤進展相關癥狀與體征［50］。2006 年，Wagner等［51］聯(lián)合應用MTH?68/H病毒和丙戊酸鈉治療1例難治性間變性星形細胞瘤患兒，并首次提供MTH?68/H病毒誘導膠質(zhì)瘤細胞體內(nèi)凋亡的組織病理學證據(jù)，表明溶瘤病毒與丙戊酸鈉聯(lián)合應用可能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。（2）NDV?HUJ病毒：2006 年，F(xiàn)reeman 等［52］開展NDV?HUJ病毒治療復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的Ⅰ期/Ⅱ期臨床試驗，共納入11例患者，第1組每周靜脈注射劑量為（0.10～11.00）×109EID50%的NDV?HUJ病毒，第2組每周靜脈注射11×109EID50%的NDV?HUJ病毒，治療3周，治療期間耐受性良好，5例出現(xiàn)發(fā)熱、癲發(fā)作、昏迷、暈厥、頭痛、腹痛以及高血壓等Ⅰ～Ⅱ級不良事件；中位生存期為33.2周，1例完全緩解。然而，迄今尚無其他研究評價NDV?HUJ病毒在膠質(zhì)母細胞瘤治療中的作用。

五、細小病毒

細小病毒（parvovirus）是包括細小病毒B19（一種人類病原體和傳染性紅斑的病原體）在內(nèi)的小的無包膜單鏈DNA病毒［30］。細小病毒科包括腺相關病毒（細小病毒屬，需輔助病毒才能復制）和自主細小病毒（為細小病毒屬，可以在特定細胞中獨立復制）［27］。自主細小病毒具有在惡性腫瘤細胞中有效復制的特點，其抑制腫瘤的機制可能由直接溶瘤作用和間接免疫反應兩個相互關聯(lián)的作用產(chǎn)生［53?54］，并已為膠質(zhì)瘤動物模型所證實，為早期臨床試驗鋪平了道路［55?56］，使細小病毒在抗腫瘤策略中具有較強的吸引力。Geletneky等［57］進行細小病毒 H?1（ParvOryx）治療惡性膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗，納入18例惡性膠質(zhì)瘤患者，第1組術前單次瘤內(nèi)注射總劑量50%的ParvOryx，術后第10天再于瘤壁注射剩余 50%的 ParvOryx（總劑量分別為 1×106、50×106、1×109和5×109PFU）；第2組術前分5次靜脈注射總劑量50%的ParvOryx，術后第10天再于瘤壁注射剩余50%的ParvOryx（總劑量分別為50×106和1×109PFU），結(jié)果顯示，治療期間所有患者均耐受良好，無劑量依賴性毒性。該項研究的重要性在于，首次證實了ParvOryx可以雙向穿越血?腦屏障和腫瘤屏障；此外，ParvOryx誘導瘤內(nèi)T細胞、小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和少量調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）浸潤，是首個通過檢測Treg細胞和免疫細胞激活標志物（如穿孔素、顆粒酶B、IFN、IL?2、CD40L 和 CD25），詳細闡述溶瘤病毒治療后膠質(zhì)瘤患者腫瘤免疫應答反應的臨床試驗［28］。

六、脊髓灰質(zhì)炎病毒

脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）是具有單股正鏈RNA基因組的人類腸道病毒，是脊髓灰質(zhì)炎的病原體［30］。PV病毒的神經(jīng)毒性可通過內(nèi)部核糖體進入位點突變（IRES）而 減 弱 。Gromeier等［28，58］以 鼻 病 毒 的IRES取代正常PV病毒的IRES，生成PV?1?RIPO病毒，可選擇性殺傷腫瘤細胞且不影響正常細胞，其安全性已經(jīng)膠質(zhì)瘤動物模型證實。PV?1?RIPO病毒重組體保留了對PV病毒受體CD155的天然親和力，該受體通常在高級別膠質(zhì)瘤細胞中過表達［59］。PVS?RIPO病毒是經(jīng)減毒的1型PV病毒（Sabin），主要與PV病毒受體CD155結(jié)合。2018年，Desjardins等［60］發(fā)表于N Engl J Med的一項Ⅰ期臨床試驗共納入61例復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者，分別接種5種劑量的 PVS?RIPO 病毒（0.10×109、0.33×109、1×109、3.30×109和 10×109TCID50），10×109TCID50組 1例出現(xiàn)顱內(nèi)出血的Ⅳ級不良事件；該項研究有52例患者參加了之后的劑量擴增試驗，其中6例接種劑量為0.33×109TCID50、31例為50×106TCID50、15例為10×106TCID50，均未觀察到 PVS?RIPO 病毒的神經(jīng)毒性反應，36.54%（19/52）觀察到PVS?RIPO病毒相關Ⅲ級或更高級別不良事件；治療后24和36個月總生存率為 21%（95%CI：11.000～33.000），高于歷史對照組；且0.10×109TCID50組有1例20歲女性患者經(jīng)治療后腫瘤徹底消失［60］。該項研究證實PV病毒治療膠質(zhì)瘤的有效性和安全性，并為即將開展的Ⅱ期臨床試驗確定了劑量水平（50×106TCID50）。此外，還有應用麻疹病毒CEA（試驗編號：NCT00390299）、Toca 511（試驗編號：NCT02576665）和牛痘病毒TG6002（試驗編號：NCT03294486）等溶瘤病毒的臨床試驗正在進行中。

七、展望

膠質(zhì)瘤的溶瘤病毒治療仍有諸多需要探索的問題，包括作用機制、劑量、接種方式等。溶瘤病毒與傳統(tǒng)標準治療方案及其他藥物如免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合應用也將是進一步研究的熱點。Martinez?Velez等［29］近期公布的研究在彌漫性腦橋膠質(zhì)瘤小鼠模型和兒童高級別膠質(zhì)瘤小鼠模型中聯(lián)合應用Δ?24?RGD腺病毒與放射治療，小鼠存活率顯著增加，表明Δ?24?RGD腺病毒與放射治療聯(lián)合應用可以產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，推測Δ?24?RGD腺病毒可以導致相關DNA損傷修復蛋白表達下調(diào)，使腫瘤細胞對放射治療更加敏感；這種聯(lián)合治療方法尚具有明顯促進免疫細胞（CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞）向腫瘤微環(huán)境（TME）浸潤的作用。該研究團隊與Manzano團隊在后續(xù)公布的研究結(jié)果中，再次證實Δ?24?RGD腺病毒可以通過溶瘤作用和提高抗腫瘤免疫反應提高療效，為即將開展的Ⅰ期/Ⅱ期臨床試驗（試驗編號：NCT03178032）提供了理論依據(jù)［61］。

此外，溶瘤病毒還可以作為多用途的先天佐劑以增強獲得性抗腫瘤免疫反應，與其他形式的免疫治療方法聯(lián)合應用共同改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境。Saha等［62］的研究顯示，G47Δ?mIL?12［表達小鼠IL?12，可以促進輔助性T細胞1（Th1）的促炎癥反應作用，以及促進自然殺傷（NK）細胞和T細胞產(chǎn)生IFN?γ］與細胞程序性死亡蛋白 1（PD1）/細胞程序性死亡蛋白配體1（PDL1）單克隆抗體相結(jié)合，在膠質(zhì)瘤小鼠模型中療效顯著，減少FoxP3+Treg細胞數(shù)目并增加CD8+T細胞和M1型腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）數(shù)目。Jiang等［63］研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用包含OX40配體的Δ?24?RGD腺病毒與抗PD1抗體可以促進抗腫瘤CD8+T細胞增殖，進而促進抗腫瘤特異性免疫反應，增加膠質(zhì)瘤小鼠模型存活率。類似研究在呼腸孤病毒和麻疹病毒的動物實驗中也取得了一定成果［64?65］，均證實溶瘤病毒是聯(lián)合免疫治療的理想藥物。未來，溶瘤病毒及相關聯(lián)合治療策略對提高膠質(zhì)瘤治療效果充滿希望。

利益沖突無