呂艷杭 吳姍姍 王振常 葉學(xué)勁

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530222，電子郵箱：2917138211@qq.com；2 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科，南寧市 530201)

【提要】 肝纖維化是由各種損肝因素作用于肝臟，導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程，其主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)彌漫性沉積過多所致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少及肝竇毛細(xì)血管化，是各種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌轉(zhuǎn)化的必經(jīng)階段。成功制造出與各種致病因素相似的肝纖維化動(dòng)物模型，可以為臨床深入研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制及治療方法奠定基礎(chǔ)。本文將從肝纖維化動(dòng)物模型造模的方法、效果、用途及優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行闡述。

肝纖維化是一種慢性肝病在修復(fù)過程中的病理狀態(tài)，其中慢性肝病包括慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、膽汁淤積性肝炎以及某些代謝性疾病等，其主要病理改變?yōu)楦蝺?nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。研究表明，肝纖維化作為所有慢性肝病的共同病理階段，是肝硬化甚至肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段[1-3]。大量研究證明，適當(dāng)?shù)闹委煷胧┛赡孓D(zhuǎn)肝纖維化和早期肝硬化病理狀態(tài)，控制肝纖維化的發(fā)展對于肝硬化甚至肝癌的防治具有至關(guān)重要的作用[4-9]。因此，逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療成為眾多慢性肝臟疾病治療的匯聚點(diǎn)。而制造各致病因素動(dòng)物模型是深入研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制及治療藥物的前提基礎(chǔ)。本文將從肝纖維化動(dòng)物模型造模的方法、效果、用途及優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行闡述，為今后研發(fā)治療肝纖維化的藥物提供臨床基礎(chǔ)研究。

1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)的肝纖維化模型

1.1 四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型 四氯化碳法誘導(dǎo)肝纖維化模型是一種經(jīng)典的造模方法，因其具有造模成功率高、方法簡便、費(fèi)用低、時(shí)間短等優(yōu)勢，成為臨床基礎(chǔ)研究中肝纖維化造模的首選方法。皮下注射濃度為40%～60%的四氯化碳聯(lián)合橄欖油是最常用的造模方法，每周注射2～3次，第8周時(shí)可成功制造肝纖維化模型[10]。四氯化碳法誘導(dǎo)肝纖維化模型的原理屬于氧化應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)制是四氯化碳在肝臟內(nèi)代謝生成三氯甲基自由基，產(chǎn)生的自由基誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成的過氧化物包括丙二醛和4-羥基壬烯酸，它們以線粒體為靶點(diǎn)，破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，從而損傷肝細(xì)胞膜，激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)釋放Ⅰ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶，促進(jìn)HSC增生，導(dǎo)致肝纖維化。但四氯化碳毒性較大，大劑量使用可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大量死亡，而小劑量使用又容易導(dǎo)致造模失敗，為了提高造模的成功率，學(xué)者們對傳統(tǒng)的四氯化碳造模法不斷進(jìn)行改良。目前常用的四氯化碳造模法主要包括腹腔注射、皮下注射及灌胃法。孫鵬等[9]通過改良四氯化碳注射濃度(40%)和注射時(shí)間(每3日1次，共14次)，采用四氯化碳大豆油溶液腹部皮下注射聯(lián)合高脂蛋白飼料喂養(yǎng)、60%食用酒灌胃，大大降低了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率，提高造模成功率。王永剛等[11]采用四氯化碳-橄欖油(含40%四氯化碳)3 mL/kg皮下注射(2次/周，共6周)，并以20%乙醇作為唯一飲用水灌胃造模，大大地提高了造模成功率，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。楊鳳蕊等[12]采用3 mL/kg四氯化碳花生油溶液(含40%四氯化碳)聯(lián)合苯巴比妥經(jīng)腹注射也提高了造模成功率。

1.2 二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化模型 二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)也叫亞硝基二甲胺，其分子式為C2H6N2O或(CH3)2NNO，具有巨大的肝毒性，對基因結(jié)構(gòu)及免疫功能也具有一定的損傷作用，其主要作用機(jī)制是使核酸、蛋白質(zhì)發(fā)生甲基化，大劑量使用易導(dǎo)致動(dòng)物死亡，多次小劑量腹腔注射、灌胃及吸入可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞外基質(zhì)增多致使HSC被激活，細(xì)胞表型由上皮型轉(zhuǎn)化成間質(zhì)型，促使HSC轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致肝臟退行性壞死，形成肝纖維化。DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型的成模率高、周期短、死亡率低及可控性高。高雅等[13]給予大鼠1.6 mL/kg DMN溶液腹腔注射，3次/周，42 d時(shí)大鼠出現(xiàn)明顯的肝纖維化，即肝小葉消失、假小葉形成，與四氯化碳法相比大大縮短了建模的時(shí)間。王晶晶等[14]給予大鼠腹腔注射0.5% DMN生理鹽水稀釋液，劑量為2 mL/kg，1～3次/周，共注射28 d，停止使用DMN后肝纖維化不易自行吸收，提示病變穩(wěn)定性強(qiáng)，DMN誘導(dǎo)的肝纖維化模型是研究抗纖維化藥物的理想模型。李偉偉等[15]也通過腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% DMN溶液2 mL/kg，每2 d注射1次，連續(xù)4周，得到穩(wěn)定的肝纖維化模型。

綜上所述，與四氯化碳法相比，DMN法具有周期短、方法簡單的優(yōu)點(diǎn)，停止給藥后肝纖維化不易自行吸收恢復(fù)，但是DMN為致癌物質(zhì)，其除了腹腔注射外，還可通過吸入(呼吸道、皮膚)等途徑產(chǎn)生毒性作用，因此實(shí)驗(yàn)操作者在實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)格外小心謹(jǐn)慎。

1.3 硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝纖維化模型 硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)分子式為CH3CSNH2，其誘導(dǎo)的急性肝損傷機(jī)制是TAA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞色素氧化酶P450氧化后生成自由基，自由基與肝細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)合，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化破壞肝細(xì)胞膜，造成肝細(xì)胞的變性壞死。主要的造模方法有灌胃、腹腔注射、皮下注射等，最常用的是皮下注射。秦冬梅等[16]使用滅菌注射用水將TAA配制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL的溶液，對大鼠進(jìn)行腹腔注射，3次/周，第8周時(shí)肝纖維化模型造模成功。薛改等[17]按160 mg/kg，對大鼠隔天灌胃濃度為3%的TAA，每周稱量體質(zhì)量1次，嚴(yán)格按照體質(zhì)量變化調(diào)整TAA的灌胃量，1周內(nèi)體質(zhì)量下降5%以內(nèi)者維持原用量，1周內(nèi)體質(zhì)量下降5%～10%者用量減少為原用量的1/2，1周內(nèi)體質(zhì)量下降10%以上停止使用以避免死亡，結(jié)果顯示該方法可以降低大鼠的死亡率。張帥等[18]對大鼠皮下注射0.03%的TAA，劑量為200 mg/kg，2次/周，8周時(shí)肝纖維化模型造模成功。綜上所述，TAA造模時(shí)間較短，肝纖維化模型成功率高且相對穩(wěn)定，死亡率低，可廣泛應(yīng)用于臨床基礎(chǔ)研究。但其易揮發(fā)、毒性大、需要加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)。

2 酒精誘導(dǎo)的肝纖維化模型

酒精分子式為C2H6O，進(jìn)入人體內(nèi)的酒精有90%在肝臟中代謝，其肝損傷機(jī)制是酒精進(jìn)入肝臟細(xì)胞，在脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?，促使還原性輔酶Ⅰ與反應(yīng)性輔酶Ⅰ比值升高，抑制線粒體三羧酸循環(huán)，使肝內(nèi)脂肪酸代謝發(fā)生障礙，氧化減弱，使中性脂肪堆積于肝細(xì)胞中，從而引起肝細(xì)胞的炎癥、變性、壞死，誘發(fā)膠原纖維堆積導(dǎo)致肝纖維化。目前主要通過31.5%酒精溶液(95%酒精與水混合制成)灌胃的方法制備酒精性肝纖維化模型[19]。有學(xué)者采用體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精誘導(dǎo)肝纖維化模型，16周時(shí)成功復(fù)制酒精性肝纖維化模型，證明此法操作簡單、經(jīng)濟(jì)低廉[20]。李豐衣等[21]采用“白酒-吡唑-植物油”混合液灌胃法制備乙醇肝纖維化動(dòng)物模型，即每天給予每只大鼠以4.8 g/kg白酒、24 mg/kg吡唑、2 mL/kg玉米油的混合液灌胃，灌胃量隨體重的變化進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)喂養(yǎng)高脂飼料(基礎(chǔ)飼料∶膽固醇∶豬油=79 ∶1 ∶20)，于16周時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠輕度酒精性肝纖維化形成，表明酒精復(fù)合因素灌胃可以成功制備肝纖維化模型，且成功率高、價(jià)格低廉、模型相對穩(wěn)定。

3 非酒精性肝纖維化模型

非酒精性肝纖維化主要是指高脂肪、高蛋白及高膽固醇誘發(fā)的慢性非酒精性脂肪肝。隨著人們生活水平的不斷提高，慢性脂肪肝的患者不斷增加，所以高脂高膽固醇誘導(dǎo)的肝纖維化也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。高脂高膽固醇所致肝纖維化的主要機(jī)制是：肝臟是脂肪代謝的重要場所，它可把血液中的脂肪酸合成為三酰甘油，三酰甘油與載脂蛋白結(jié)合為脂蛋白，并釋放入血液；長期攝入過多的動(dòng)物脂肪、植物油和糖類等高熱量食物，過剩的營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)不能被充分利用，從而轉(zhuǎn)化為脂肪儲(chǔ)存起來，導(dǎo)致脂肪肝，肝臟的細(xì)胞“堆”滿了多余的脂肪，從而形成肝纖維化。楊銀花等[22]的研究表明，高脂飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠能成功復(fù)制非酒精性脂肪肝，且價(jià)格低廉、成模率高、操作簡便，于喂養(yǎng)第8周時(shí)多數(shù)大鼠肝臟肝纖維化形成。綜上所述，高脂因素誘導(dǎo)的肝纖維化，造模周期短，操作方便，能復(fù)制出與人類相似的肝纖維化模型，可以很好地運(yùn)用于人類非酒精性肝纖維化的研究。但喂養(yǎng)量尚未標(biāo)準(zhǔn)化，肝纖維化易自行吸收，模型相對不穩(wěn)定。

4 膽管結(jié)扎性肝纖維化模型

膽管結(jié)扎性肝纖維化模型是通過人為結(jié)扎肝外膽管使其阻塞，形成肝纖維化。其結(jié)扎方法包括肝外膽管結(jié)扎法、膽管結(jié)扎后切斷法和逆行性注入 N-丁基-2-氰基丙烯酸鹽法三種方式。其主要機(jī)制是由膽管漸進(jìn)性破壞、膽汁淤積及肝內(nèi)炎癥持續(xù)存在，導(dǎo)致肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞進(jìn)一步損傷，發(fā)展為肝纖維化。慕永平等[23]采用膽總管結(jié)扎法制備膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)該模型可復(fù)制人類膽管梗阻造成肝纖維化的形態(tài)，且方法簡便，造模周期短，肝纖維化穩(wěn)定可靠，無須與毒性物質(zhì)接觸。

5 自身免疫性肝纖維化模型

自身免疫性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制主要以遺傳因素為主，其他因素是在遺傳易感性基礎(chǔ)上，導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受機(jī)制破壞，從而產(chǎn)生針對肝臟自身抗原的免疫反應(yīng)，誘發(fā)肝臟炎癥壞死并進(jìn)展為肝纖維化。實(shí)驗(yàn)研究中主要以動(dòng)物血清或者人血清蛋白作為抗原，將其注射入動(dòng)物體內(nèi)，復(fù)制肝纖維化動(dòng)物模型。

5.1 動(dòng)物血清誘發(fā)的肝纖維化模型 實(shí)驗(yàn)室一般常選用豬血清、牛血清、馬血清或血吸蟲血清等給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射，引起膠原纖維堆積，導(dǎo)致肝小葉消失，形成假小葉，誘發(fā)肝纖維化。由于豬血清較牛血清價(jià)格便宜，而血吸蟲血清不易提取、價(jià)格昂貴，因此豬血清是實(shí)驗(yàn)室肝纖維化造模的首選試劑。有學(xué)者采用豬血清(0.5 mL/次，2次/周，共12周)對大鼠進(jìn)行腹部注射，在造模期間每周處死1只大鼠，觀察膠原纖維、肝纖維化指標(biāo)及轉(zhuǎn)化生長因子β1，用來判斷大鼠成模情況，結(jié)果顯示，豬血清可成功誘導(dǎo)肝纖維化模型[24-27]。趙宏偉等[28]在傳統(tǒng)豬血清誘導(dǎo)肝纖維化(腹腔注射，0.5 mL/次，共12周)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，加用高脂高膽固醇飼料(80%玉米粉+20%豬大油+0.5%的膽固醇)飼養(yǎng)大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)大鼠出現(xiàn)肝纖維化的現(xiàn)象，提示此法大大縮短了造模時(shí)間，方法簡便，價(jià)格低廉，模型相對穩(wěn)定。

5.2 人血白蛋白誘發(fā)的肝纖維化模型 人血白蛋白所致的肝纖維化分為致敏和攻擊兩個(gè)階段。謝玉梅等[29]對人血白蛋白免疫攻擊法制備大鼠肝纖維化模型進(jìn)行改良，使用生理鹽水稀釋人血白蛋白，與等量的不完全福氏佐乳劑乳化，予尾靜脈注射0.5 mL/次(含人血白蛋白4 mg)，共注射4次，前2次間隔14 d，后2次間隔10 d，并以30%乙醇為唯一飲用水，結(jié)果顯示蘇木精-伊紅染色、V-G膠原染色向肝小葉延伸，交織成網(wǎng)狀；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在攻擊階段由尾靜脈注射改為腹腔注射，或者在注射人血白蛋白的基礎(chǔ)上加用四氯化碳，可增加造模成功率。

5.3 刀豆素蛋白誘發(fā)的肝纖維化模型 刀豆素蛋白誘導(dǎo)肝纖維化的機(jī)制是刺激T細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子α等)的釋放，引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步使肝炎發(fā)展成肝纖維化。有學(xué)者將1 g/L刀豆素蛋白溶于滅菌的磷酸鹽緩沖溶液，按12.5 mg/kg給予每只大鼠進(jìn)行尾靜脈注射，1次/周，第6次注射1周后處死大鼠，取肝組織分析，發(fā)現(xiàn)刀豆素蛋白誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化與人類肝炎病毒肝纖維化接近，隨著刀豆素蛋白劑量的增加，肝損傷加重，此法操作簡單快捷[30-31]。

綜上所述，豬血清誘導(dǎo)肝纖維化模型是免疫性肝纖維化模型中最為經(jīng)典的模型，其操作簡單、價(jià)格便宜、造模周期短，與化學(xué)藥物誘導(dǎo)的肝纖維化模型相比，穩(wěn)定性更高，與臨床肝纖維化最為貼近，可以更好地服務(wù)于臨床基礎(chǔ)研究。

6 其他因素誘導(dǎo)的肝纖維化模型

除了上述的造模方法，還有血吸蟲感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘導(dǎo)肝纖維化、營養(yǎng)缺乏性大鼠肝纖維化模型、基因缺陷性大鼠肝纖維化模型及病毒誘導(dǎo)的肝纖維化模型[32-34]。

7 小 結(jié)

到目前為止，肝纖維化動(dòng)物模型的造模方法越來越多，也越來越完善，這為研究肝纖維化提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由于肝纖維化致病因素具有多樣性，而目前肝纖維化動(dòng)物模型大多是單一因素造模(化學(xué)藥物、免疫肝損、酒精性肝損、高脂高膽固醇等)，無法用人類常見的肝炎病毒復(fù)制肝纖維化模型，仍然沒有找到與人類肝纖維化完全相似的模型，今后應(yīng)從多方面尋找肝纖維化誘導(dǎo)方法，進(jìn)一步探討肝纖維化的機(jī)制及治療方法。