高健偉 肖輝 張旻

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科200080

黏蛋白1(mucin-1,MUC1)是一種高度糖基化的跨膜蛋白,它存在于多數(shù)呼吸道、泌尿生殖道和消化道的上皮細(xì)胞表面。在多種癌癥中,腫瘤相關(guān)MUC1的異常表達(dá)和糖基化使得其有別于正常細(xì)胞中的MUC1。MUC1被認(rèn)為參與腫瘤細(xì)胞的形成和轉(zhuǎn)移,它同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性,因而成為一個(gè)潛在的免疫治療靶點(diǎn)[1-2]。

長期以來,疫苗接種一直被視為一種潛在的抗腫瘤策略。它通常具有較好的耐受性、價(jià)格低廉且可誘導(dǎo)持久的抗腫瘤反應(yīng),已經(jīng)廣泛用于臨床試驗(yàn)。靶向MUC1的疫苗可分為4類:多肽疫苗、多糖疫苗、病毒載體疫苗和樹突狀細(xì)胞疫苗。目前,研究焦點(diǎn)逐漸從簡單的多肽和多糖疫苗轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^使用改良的病毒載體、體外合成靶向MUC1樹突狀細(xì)胞疫苗等方法,以更好地誘導(dǎo)出有效的、適合的抗腫瘤免疫反應(yīng)[3-4]。

1 MUC1介紹

MUC1屬于黏蛋白家族的成員之一。黏蛋白是糖基化蛋白質(zhì),主要由上皮細(xì)胞合成,為其提供保護(hù)和和潤滑作用。高度O-糖基化串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域(variable number of tandem repeats,VNTR)的存在是黏蛋白的特征性標(biāo)志。黏蛋白分為2個(gè)亞科,分泌型和膜結(jié)合型。MUC1屬于膜結(jié)合型黏蛋白,主要由龐大的細(xì)胞外區(qū)域(包含VTNR結(jié)構(gòu)域)、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)組成。MUC1細(xì)胞外區(qū)域的部分可在胞膜的基礎(chǔ)上向外延伸200～500 nm,它由大量重復(fù)的20個(gè)氨基酸序列組成,這種序列在跨膜區(qū)非常罕見,因而產(chǎn)生了可觀的抗原異質(zhì)性。其在細(xì)胞外區(qū)域的MUC1-N端亞基可由上皮細(xì)胞脫落,在血漿中形成腫瘤標(biāo)志物CA153。MUC1在正常細(xì)胞中有多種作用。它是上皮表面黏膜形成和維持的關(guān)鍵、可以直接防護(hù)病原微生物感染,并具有細(xì)胞間黏附及抗黏附的特性。MUC1也是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要節(jié)點(diǎn),如生長因子受體結(jié)合蛋白2、絲裂原活化蛋白激酶、表皮生長因子受體和β連鎖蛋白[5]。

惡性腫瘤相關(guān)的MUC1與正常上皮細(xì)胞中常見類型有顯著的差異,主要體現(xiàn)在表達(dá)水平、分布和糖基化模式方面。MUC1通常為低水平表達(dá),但在腫瘤細(xì)胞發(fā)展過程中由于失去細(xì)胞極性,即在整個(gè)細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可表達(dá)MUC1。這種過度表達(dá)和異常定位與腫瘤轉(zhuǎn)移和較差的生存期相關(guān)。此外,腫瘤細(xì)胞還在MUC1-O-糖基化的程度、部位和組成方面表現(xiàn)出異常。根據(jù)上皮細(xì)胞類型與生理狀態(tài)的不同,糖基化水平為50%～80%。但是在癌癥中,糖基化水平大大減少,連接的寡糖鏈更短,這提示MUC1的免疫特異性多肽序列通常被大量的糖基化掩蓋。除了暴露的多肽序列外,異常的糖基化也會(huì)導(dǎo)致新的聚糖的產(chǎn)生,這些同樣可以作為腫瘤相關(guān)抗原。如sialyl-Tn(S-Tn)、sialyl-Lewisx等[2,6]。

MUC1在腫瘤生物學(xué)中具有免疫刺激和免疫抑制的雙重作用,其復(fù)雜且雙向的免疫刺激和免疫抑制作用確立了MUC1在癌癥中的重要地位。一方面,多種機(jī)制介導(dǎo)的免疫抑制以及黏蛋白遮蔽腫瘤相關(guān)表位的空間位阻作用促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展和擴(kuò)散；另一方面,腫瘤細(xì)胞MUC1異常表達(dá)或異常糖基化導(dǎo)致腫瘤特異性B和T細(xì)胞抗原表位的產(chǎn)生,為疫苗設(shè)計(jì)提供可能。此外,在生存期較長的腫瘤患者中可檢測(cè)到新抗原活性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞克隆的存在,這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了抗黏蛋白適應(yīng)性免疫的保護(hù)作用[2]。

2 基于MUC1的腫瘤疫苗臨床研究

2.1 多肽疫苗 最初MUC1疫苗以MUC1-VNTR多肽序列作為靶點(diǎn),自MUC1多肽疫苗的臨床安全性被確定后[7],多項(xiàng)臨床試驗(yàn)致力于評(píng)估其有效性。早期試驗(yàn)表明抗MUC1的適應(yīng)性免疫可能是可誘導(dǎo)出來的,但臨床反應(yīng)性較為少見,這可能與非最佳免疫原性、受試者處于疾病晚期、過于簡單的疫苗研究方案等有關(guān)[3,8]。

盡管面臨上述挑戰(zhàn),非糖基化多肽疫苗L-BLP25最終進(jìn)入大型Ⅲ期試驗(yàn)階段[9]。L-BLP25(tecemotide,Stimuvax)是一種靶向MUC1的脂質(zhì)體疫苗,它由25氨基酸MUC1-VNTR序列、BL25脂肽、TLR4受體激動(dòng)劑單磷酰基脂質(zhì)A和3種脂質(zhì)佐劑組成。Ⅱb期臨床試驗(yàn)在171例經(jīng)治的ⅢB期和Ⅳ期NSCLC患者中評(píng)估L-BLP25的安全性及對(duì)生存期的影響,88例被分配到L-BLP25聯(lián)合最佳支持性治療(best supportive care,BSC),另外83例僅接受BSC。結(jié)果顯示,疫苗相比BSC組的平均生存期延長4.4個(gè)月[10-11]。隨后更新數(shù)據(jù)顯示,疫苗組平均生存時(shí)間為17.2個(gè)月,而BSC組為13.0個(gè)月(HR=0.745,95%CI:0.533～1.042),2組的3年生存率分別為31%比17%(P=0.035)[12]。

基于這些結(jié)果,一項(xiàng)Ⅲ期隨機(jī)臨床試驗(yàn)在接受放化療后未進(jìn)展的不可切除Ⅲ期NSCLC患者中進(jìn)一步檢測(cè)L-BLP25對(duì)比安慰劑的療效(START試驗(yàn))[9]。1 513例患者按2∶1隨機(jī)分配到L-BLP25組或安慰劑組。L-BLP25組患者提前3 d接受低劑量環(huán)磷酰胺治療以減少抑制性T細(xì)胞的活性。L-BLP25組患者的中位總生存期(overall survival,OS)是25.8個(gè)月,安慰劑組為22.4個(gè)月(HR=0.89,95%CI:0.77～1.03,P=0.111)。該試驗(yàn)中2組OS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但對(duì)于其中538例同時(shí)接受L-BLP25和放化療的患者,其中位總生存期相比安慰劑組顯著延長(29.4個(gè)月比20.8個(gè)月,HR=0.81,95%CI:0.68～0.98,P=0.026)[13]?；谶@一發(fā)現(xiàn),一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)(START2試驗(yàn))評(píng)估L-BLP25聯(lián)合放化療對(duì)OS的影響,但因一項(xiàng)在日本開展的設(shè)計(jì)相似臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示患者不能從中獲益,HR近似1,START2試驗(yàn)提前終止[14]。

2.2 多糖疫苗 腫瘤細(xì)胞上MUC1的異常糖基化也是重要的抗原表位。S-Tn碳水化合物是由MUC1表達(dá)重要多糖抗原之一,臨床前研究提示針對(duì)S-Tn抗原的疫苗可抑制腫瘤生長、延長生存期,早期臨床試驗(yàn)提示STn-KLHDetox-B疫苗耐受性較好,可能有一定臨床療效[3]。但一項(xiàng)納入1 028例轉(zhuǎn)移性乳腺癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中,患者并未能從該疫苗中獲益,2組的OS和疾病進(jìn)展時(shí)間(time to progress,TTP)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。

一些早期研究嘗試使用多價(jià)疫苗以克服腫瘤的異質(zhì)性,如一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)在30例晚期前列腺癌患者中使用一種KLH連接的六價(jià)疫苗(由MUC1-32mer、Globo H、GM2 Lewis、TN和TF組成),患者體內(nèi)可檢測(cè)到一定水平的抗體,但各抗原反應(yīng)程度不一,且抗體水平低于單一抗原誘導(dǎo)水平,該疫苗并沒有明顯的臨床療效[16]。隨后一項(xiàng)Ⅰ期試驗(yàn)在11例晚期卵巢上皮癌患者使用七價(jià)疫苗(添加STn),患者體內(nèi)可檢測(cè)到一定程度的免疫反應(yīng),該七價(jià)疫苗的療效仍需進(jìn)一步臨床評(píng)估[17]。

2.3 病毒載體疫苗 TG4010(MVA-MUC1-IL-2)是一種以減毒的安卡拉痘苗病毒為載體的腫瘤疫苗,它是由編碼人MUC1抗原和IL-2的重組修飾牛痘病毒懸濁液組成。MVA感染的細(xì)胞可表達(dá)MUC1全長蛋白從而提供腫瘤相關(guān)MUC1抗原表位,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng)。TG4010可同時(shí)編碼IL-2,其在細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)中均有重要作用。

一項(xiàng)TG4010的Ⅰ期臨床試驗(yàn)納入13例肺癌、乳腺癌、腎癌等晚期實(shí)體瘤患者,這部分患者腫瘤組織的MUC1免疫組織化學(xué)染色均為陽性(H23抗體染色陽性率大于50%的腫瘤細(xì)胞)。安全性評(píng)估顯示該疫苗具有較好的耐受性,不良事件主要包括注射部位局部反應(yīng)及流感樣癥狀。其中4例患者獲得長達(dá)6～9個(gè)月的穩(wěn)定期,1例肺癌患者在注射疫苗后起初表現(xiàn)為疾病進(jìn)展,但在終止治療后6個(gè)月表現(xiàn)為病灶明顯縮小且維持14個(gè)月[18]。

多項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了TG4010用于前列腺癌、腎癌及肺癌中的療效。Dreicer等[19]納入40例經(jīng)手術(shù)或放療后僅前列腺特異抗原(prostate specific antigen,PSA)出現(xiàn)升高而尚無復(fù)發(fā)證據(jù)的前列腺癌患者,皮下注射TG4010,預(yù)設(shè)終點(diǎn)指標(biāo)為PSA相比基線水平下降50%,盡管該試驗(yàn)并未達(dá)到終點(diǎn)指標(biāo),但有30%的患者PSA倍增時(shí)間顯著延長。γ-干擾素ELISpot法用于檢測(cè)MUC1 CD8+特異性反應(yīng),53%的患者在基線水平(接種疫苗前)顯示出MUC1特異性反應(yīng),7例患者在接種疫苗后表現(xiàn)出MUC1特異性反應(yīng),其中6例的PSA倍增時(shí)間高于平均水平。另一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)評(píng)估了TG4010用于MUC1陽性的轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌患者一線治療的療效和耐受性,患者接受TG4010或是TG4010聯(lián)合IFNa2a、IL-2,但沒有1例患者表現(xiàn)出客觀緩解,TG4010組僅5/27例,TG4010聯(lián)合細(xì)胞因子組僅6/20例維持大于6個(gè)月的疾病穩(wěn)定期。該試驗(yàn)中患者的總生存期為19個(gè)月,其中TG4010聯(lián)合細(xì)胞因子組為22個(gè)月。在這項(xiàng)研究中進(jìn)一步檢測(cè)了血漿樣本中抗MVA抗體,所有患者均顯示出MVA抗體反應(yīng)。有趣的是,對(duì)于基線抗MVA抗體低于平均水平的患者,可表現(xiàn)出輕微的生存優(yōu)勢(shì)。這可能反映這部分患者中和抗體的缺乏。MUC1和MVA特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)一步通過增殖試驗(yàn)被評(píng)估。在外周血單個(gè)核細(xì)胞中沒有檢測(cè)到基線MUC1 CD4+T活性,而在5例接種疫苗后的患者中檢測(cè)到MUC1特異性CD4+T細(xì)胞增殖,但僅為短暫的,且與臨床結(jié)局沒有相關(guān)性。MVA特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)存在于2例基線水平患者和16例疫苗接種患者,但均與臨床結(jié)局沒有相關(guān)性。MHC1結(jié)合多肽ELIspot用于檢測(cè)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。MUC1特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)在3例患者的基線水平和4例疫苗接種患者中被檢測(cè)到。同樣的,CD8+T細(xì)胞反應(yīng)均為短暫的,但是這些體內(nèi)存在CD8+T細(xì)胞反應(yīng)患者的OS相比總體中位OS顯著延長[20]。盡管以上有關(guān)前列腺癌和腎癌的兩項(xiàng)研究并沒有達(dá)到預(yù)設(shè)的終點(diǎn)指標(biāo),但在部分患者中可以檢測(cè)MUC1或MVA特異性T細(xì)胞反應(yīng),且免疫反應(yīng)的存在提示這部分患者可能從中獲益。

TG4010在肺癌患者中表現(xiàn)一定的療效。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)納入65例MUC1陽性的晚期NSCLC患者,TG4010聯(lián)合順鉑及長春瑞濱作為一線治療方案,其中44例同時(shí)接受疫苗和化療(組1),21例接受先疫苗后化療貫序療法(組2)。組1中13例患者達(dá)到部分緩解,中位OS 12.7個(gè)月,1年生存率53%；組2中僅2例接種疫苗后獲得6個(gè)月以上穩(wěn)定期,其中后續(xù)化療后1例完全緩解,另1例部分緩解,中位無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)14.9個(gè)月,中位OS 14.9個(gè)月,1年生存率60%[21]。值得注意的是,CD8+T細(xì)胞反應(yīng)在10例患者基線水平和10例接種后患者中被檢測(cè)到,盡管這些反應(yīng)均為微弱、瞬時(shí)的,但CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的存在提示更好的臨床結(jié)局。隨后一項(xiàng)Ⅱb期臨床試驗(yàn)納入148例MUC1陽性(陽性率大于25%的腫瘤細(xì)胞)的ⅢB期和Ⅳ期NSCLC患者,按1∶1隨機(jī)分配接受TG4010+順鉑/吉西他濱或單用順鉑/吉西他濱。TG4010組相比對(duì)照組的6個(gè)月PFS為43.2%比35.1%(P=0.307),客觀緩解率為41.9%比28.4%(P=0.082)。此外,該試驗(yàn)提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中活化的自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK,CD16+CD56+CD69+細(xì)胞)可能是預(yù)測(cè)TG4010療效的生物標(biāo)志物。在基線水平,26.8%的患者相比健康對(duì)照組有更高比例的活化NK細(xì)胞。對(duì)于NK細(xì)胞比例正常的患者,疫苗組比單獨(dú)化療組臨床結(jié)局更佳,客觀緩解率為54.2%比28.3%,中位TTP為6.3個(gè)月比4.7個(gè)月。而對(duì)于NK細(xì)胞比例較高的患者,疫苗組相比單獨(dú)化療組臨床結(jié)局則較差,OS為5.3個(gè)月比10.5個(gè)月(P=0.041)[22]。

以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步推動(dòng)了一項(xiàng)Ⅱb/Ⅲ期臨床試驗(yàn)(TIME)的展開。TIME試驗(yàn)Ⅱb期招募222例MUC1陽性的初治Ⅳ期NSCLC患者,按1:1分配到TG4010+化療和安慰劑+化療組。該試驗(yàn)同時(shí)評(píng)估了CD45陽性淋巴細(xì)胞中CD16+CD56+CD69+三陽性細(xì)胞(Tr PAL)比例的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果顯示,TG4010相比安慰劑組顯著改善PFS(5.9個(gè)月比5.1個(gè)月,HR=0.74,P=0.019)。TG4010在TrPAL基線值較低、非鱗癌患者中優(yōu)勢(shì)更為明顯,PFS為6.0個(gè)月比4.9個(gè)月(HR=0.59,P=0.003 3),OS為15.1個(gè)月比10.3個(gè)月(HR=0.59,P=0.007 2)。此外,腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1表達(dá)可能與疫苗獲益相關(guān),研究者在72%的患者中評(píng)估了腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá),在62%患者中評(píng)估了腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中PD-L1表達(dá)。對(duì)于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1低表達(dá)的患者,可從TG4010獲益[23-24]。

2.4 樹突狀細(xì)胞疫苗 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)作為強(qiáng)力的抗原提呈細(xì)胞(ancigen presenting cells,APCs),可連接固有和適應(yīng)性免疫。早期臨床前和臨床研究使用DCs負(fù)載腫瘤抗原以提高T細(xì)胞免疫反應(yīng)。DCs以3種方式負(fù)載抗原:多肽脈沖、腫瘤細(xì)胞融合及RNA轉(zhuǎn)染。多項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)提示DC疫苗可成功傳遞抗原,誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,顯示出一定臨床療效[4]。

Cvac TM是一種使用MUC1甘露聚糖多肽抗原的自體DCs疫苗,其在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出較好耐受性,可誘導(dǎo)有效T細(xì)胞反應(yīng),有望改善卵巢癌患者的PFS[25]。一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)在20例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者中評(píng)估DC-MUC1-PADRE疫苗的作用,其中PADRE可作為T輔助細(xì)胞表位以提高細(xì)胞毒性作用,3例患者達(dá)到客觀緩解,11例患者中可檢測(cè)到MUC1特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[26]?；贛UC1 RNA轉(zhuǎn)染的疫苗在一項(xiàng)30例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者的Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)顯示出一定療效,患者接種裸mRNA(編碼MUC1、CEA、HER2、端粒酶、survin和MAGE-1),1例患者達(dá)到部分緩解,15例達(dá)疾病穩(wěn)定期[27]。

盡管上述早期試驗(yàn)提示DCs疫苗有望提高M(jìn)UC1特異性的T細(xì)胞反應(yīng),使患者獲得臨床受益。但在一項(xiàng)卵巢癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中,接種DCs疫苗的患者并未獲益,與多肽疫苗類似,早期臨床試驗(yàn)預(yù)見的臨床受益在進(jìn)一步大型臨床試驗(yàn)中并未得以驗(yàn)證,這提示我們需要進(jìn)一步探尋有效促進(jìn)DCs體內(nèi)激活的方法[3]。

此外,近年來逐漸興起一些新技術(shù)用于基于MUC1的免疫治療,包括DCs/腫瘤融合技術(shù)、過繼T細(xì)胞免疫治療、嵌合抗原受體T細(xì)胞療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CART)等。其中一個(gè)方法是將人源性骨髓瘤細(xì)胞與DCs融合,同時(shí)聯(lián)合GM-CSF,Ⅰ期試驗(yàn)顯示在24例晚期多發(fā)性骨髓瘤患者中,使用該疫苗后可在11例患者中檢測(cè)到MUC1特異性T細(xì)胞反應(yīng),并表現(xiàn)為疾病穩(wěn)定期[28]。過繼T細(xì)胞免疫治療涉及體外篩選、擴(kuò)增及MUC1特異性T細(xì)胞的回輸。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)在4例卵巢癌患者中嘗試過繼T細(xì)胞療法,將體外誘導(dǎo)擴(kuò)增分泌IL-10和γ-干擾素的MUC1特異性CD4+T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后,T細(xì)胞表現(xiàn)出記憶細(xì)胞表型,存活能力增強(qiáng),患者的OS明顯延長[29]。CART技術(shù)在臨床前研究中可提高靶向細(xì)胞毒性,促進(jìn)T細(xì)胞增殖。MUC1 Tn特異性CART細(xì)胞在動(dòng)物移植瘤模型中顯示出潛在的特異性細(xì)胞毒性及對(duì)T細(xì)胞白血病、胰腺癌的抑制作用。但目前尚未有MUC1特異性CART用于臨床試驗(yàn)[2]。

3 結(jié)語

近年來,免疫治療是逐漸興起的腫瘤治療策略。腫瘤相關(guān)MUC1的異常表達(dá)和糖基化為腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)提供了新的、潛在的抗原表位,MUC1為靶點(diǎn)的免疫治療策略有望使腫瘤患者獲益。多種以MUC1為靶點(diǎn)的腫瘤疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,其中最令人注目的是病毒載體疫苗TG4010,它可使聯(lián)合化療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者顯著獲益。同時(shí),NK細(xì)胞、PD-L1及特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)等免疫學(xué)指標(biāo)可作為預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物篩選出可從腫瘤疫苗中獲益的特定人群,更多的臨床試驗(yàn)需進(jìn)一步評(píng)估預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的有效性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突