沈晨露 葉偉佳 呂柯佳 高碧聰 姚華

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科 杭州 310003

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種口腔黏膜慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)多樣[1]，常累及頰部、舌背、牙齦等部位[2]，多為雙側(cè)、具有對(duì)稱性，病理特征表現(xiàn)為上皮下淋巴細(xì)胞呈帶狀浸潤(rùn)和基底細(xì)胞液化變性[3]。OLP在普通人群中的患病率在0.5%到2.2%之間，好發(fā)于30～70歲人群，且女性更易患病[4-6]，因其慢性的疾病進(jìn)展、潛在的惡變可能[7-8]及難以自愈等特征，給患者身心健康帶來嚴(yán)重影響。目前臨床上尚沒有OLP有效的根治措施，常使用糖皮質(zhì)激素和免疫調(diào)節(jié)藥物來緩解疾病發(fā)展，停留在將疾病控制穩(wěn)定防止癌變階段。為探尋治療OLP的方法，建立理想的OLP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究非常必要。但臨床上OLP特征常與其他口腔黏膜疾病特征重疊在一起，且OLP不具有無限增殖的特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭屑膊√卣魍S時(shí)間延長(zhǎng)而消失，為OLP的研究帶來較大的困難。目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者尚未建立完善的OLP動(dòng)物模型，但仍有不少學(xué)者進(jìn)行了初步的探索，細(xì)胞模型則相對(duì)成熟。因此，本文將對(duì)目前已開展的OLP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行綜述。

1 與OLP相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯楷F(xiàn)狀

1.1 OLP細(xì)胞模型研究現(xiàn)狀

1.1.1 人OLP角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng) 有學(xué)者[9]從組織病理學(xué)確診的OLP患者黏膜組織分離上皮層，酶解消化并于無血清角化細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外原代及傳代培養(yǎng)，成功建立了體外培養(yǎng)人OLP角質(zhì)形成細(xì)胞的方法。后有學(xué)者[5,10]重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)，也成功培養(yǎng)出了體外OLP角質(zhì)形成細(xì)胞，且可成功傳代5～6代而不喪失活力。該建模方法采用直接提取病變組織進(jìn)行培養(yǎng)，保證了培養(yǎng)細(xì)胞的代表性，但細(xì)胞傳代次數(shù)較少，不能模擬OLP的慢性疾病過程，尤其是無法建成為具備黏膜特征的模型。

1.1.2 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（human oral keratinocyte，HOK）/人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（human immortalized keratinocyte，HaCaT） 目前大量OLP細(xì)胞因子相關(guān)研究都使用革蘭氏陰性菌LPS刺激HOK的炎癥模型來進(jìn)行研究。使用LPS作為誘導(dǎo)炎癥因子的介質(zhì)，來研究OLP炎癥細(xì)胞因子的變化[11-12]。此外，HaCaT是人類皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的永生細(xì)胞[13]，因其容易生長(zhǎng)和無限傳代的特點(diǎn)，是口腔角質(zhì)形成細(xì)胞的合適替代品。有學(xué)者選取HaCaT作為研究對(duì)象，將HaCaT在無血清的培養(yǎng)基中饑餓24 h，再在無血清環(huán)境下用不同濃度從大腸埃希菌055:B5中凈化出的LPS處理，來介導(dǎo)模擬局部OLP免疫環(huán)境。該細(xì)胞模型建立方法被應(yīng)用到后期多個(gè)實(shí)驗(yàn)[14-16]中。但LPS處理HOK/HaCaT結(jié)果不定向，模擬環(huán)境可能與OLP免疫環(huán)境存在差異。

1.1.3 角質(zhì)形成細(xì)胞/T細(xì)胞共培養(yǎng)模型 OLP免疫學(xué)機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞主要為角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞，因此有學(xué)者選用這兩者共培養(yǎng)進(jìn)行OLP細(xì)胞模型的建立。基于OLP發(fā)生的首要原因是激活誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生的抗原、超抗原，該學(xué)者[17]采用干擾素（interferon，IFN）-γ刺激純化培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞作為非專職的抗原遞呈細(xì)胞，將原代培養(yǎng)的T細(xì)胞作為免疫細(xì)胞，來模擬OLP病損的免疫應(yīng)答環(huán)境，并將亞適劑量的植物血凝素類多克隆刺激劑（phytohaemagglutinin，PHA）作為抗原刺激物，來推測(cè)OLP患者體內(nèi)特異性免疫應(yīng)答的狀況[18-19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該共培養(yǎng)模型能在一定程度上模擬OLP局部損害的免疫應(yīng)答環(huán)境，雖然可能與機(jī)體OLP局部免疫環(huán)境存在一定的差異，但具有一定代表性。

1.2 OLP動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀

1.2.1 移植法 參考口腔癌動(dòng)物模型中的移植瘤模型[20]，有學(xué)者[21]提出通過移植OLP組織塊來進(jìn)行OLP動(dòng)物模型的建立。早期研究[21]選取裸鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將OLP病變組織移植至裸鼠皮下，但隨后發(fā)現(xiàn)其病理學(xué)特征迅速消失。這可能是因?yàn)槁闶箅m然缺失細(xì)胞免疫系統(tǒng)，但仍保留了比較完整的體液免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致裸鼠對(duì)病變組織的排斥?；谠撗芯浚S后有學(xué)者[22]選取了先天缺乏功能性T、B細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用將患者非糜爛型OLP病損移植到SCID小鼠的舌腹和背部，并于移植術(shù)后第1、2周取出移植物進(jìn)行病理學(xué)檢查，但是移植物的病理學(xué)特征仍逐漸消失。這一方面可能是因?yàn)镾CID小鼠體內(nèi)仍存有大量自然殺傷細(xì)胞，另一方面可能是因?yàn)橐浦参锎笮”恍∈篌w型限制，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子數(shù)量偏少，從而喪失病理學(xué)特征。

1.2.2 局部注射法及針刺劃痕法 董鑫[23]采用不同濃度的OLP組織勻漿進(jìn)行口腔黏膜下及背部皮膚皮下局部注射，4周后病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏膜下層有慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但上皮層與固有層均未見明顯變化。這說明僅皮下注射無法引起上皮及固有層的炎癥?；诰植孔⑸浞ǖ娜毕?，胡維力[24]采用針刺法建立OLP模型，同樣取OLP患者病變組織制成勻漿，再用裝有勻漿的注射器垂直小鼠口腔黏膜反復(fù)刺入、拔出直至針刺部位黏膜表面充血，再在黏膜下注入少許組織勻漿，4周后處死小鼠取病變組織制成病理切片。但病理結(jié)果仍未出現(xiàn)典型的OLP固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)帶，這一方面可能是因?yàn)镺LP不具有無限增殖能力，不能在動(dòng)物體內(nèi)廣泛增殖，另一方面可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)仍存在免疫反應(yīng)。

1.2.3 免疫缺陷小鼠注射人外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建模型法 由于OLP是T細(xì)胞介導(dǎo)的黏膜疾病，胡維力[24]嘗試通過給非肥胖糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID）小鼠腹腔注入人外周血淋巴細(xì)胞（human peripheral blood lymphocyte，Hu-PBL）來建立具有人免疫學(xué)特性的非肥胖糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（human peripheral blood lympho cyte non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，Hu-PBL-NOD/SCID）小鼠模型，以確保T細(xì)胞的聚集，從而快速建立起OLP動(dòng)物模型。但以失敗告終，該學(xué)者發(fā)現(xiàn)如果PBL注射數(shù)量不足，就難以建立起有效的免疫系統(tǒng)；但PBL注射數(shù)量過大，又容易發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)（graft versus host reaction，GVHR）。

2 靶向OLP發(fā)病原因和機(jī)制的動(dòng)物模型構(gòu)建

經(jīng)過學(xué)者們大量的研究，OLP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿〉昧艘恍┛上驳倪M(jìn)展，然而，迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無理想的模型開展OLP診治的體內(nèi)外模型研究。深入探討建立OLP模型將有助于OLP病因?qū)W、診治學(xué)的研究。

2.1 以病因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建OLP模型研究趨勢(shì)

迄今為止，OLP的病因尚未明確，遺傳易感性、免疫機(jī)制、心理疾病、藥物過敏反應(yīng)和感染等都是與OLP相關(guān)的病因因素[25-27]。目前將OLP可能病因主要分為4種：局部或系統(tǒng)因素引起的細(xì)胞介導(dǎo)超敏反應(yīng)、壓力、病毒感染、上皮抗原自身免疫反應(yīng)與外部抗原失調(diào)反應(yīng)[27]。其中尚無確切證據(jù)證明OLP與過敏反應(yīng)、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染有直接關(guān)系。

壓力被認(rèn)為在OLP發(fā)病過程中起著重要作用，據(jù)報(bào)道，與正常對(duì)照組相比，OLP患者更容易出現(xiàn)焦慮和抑郁。急性和慢性心理壓力可以誘導(dǎo)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的顯著變化，這些免疫反應(yīng)變化主要通過下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)-腎上腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌介質(zhì)介導(dǎo)[28]。但心理壓力在實(shí)驗(yàn)室中較難定義和模擬，因此不推薦單獨(dú)使用該病因作為未來OLP動(dòng)物模型構(gòu)建方向，可以作為輔助因素作為模型研究對(duì)象。

因此，目前來看，自身免疫反應(yīng)支持患者自身T細(xì)胞殺死自體角質(zhì)細(xì)胞的理論應(yīng)是未來OLP模型構(gòu)建的主要趨勢(shì)，可以嘗試通過誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)體自身免疫反應(yīng)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)，以此探索OLP的致病因素，起到早期預(yù)防OLP發(fā)生的作用。

2.2 以機(jī)制為基礎(chǔ)構(gòu)建OLP模型

免疫介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有多重機(jī)制，但目前OLP角化細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍不明確。在角質(zhì)形成細(xì)胞/T細(xì)胞共培養(yǎng)模型成功的基礎(chǔ)上，未來研究可以重點(diǎn)探索T細(xì)胞活化上游反應(yīng)機(jī)制。導(dǎo)致T細(xì)胞活化或耐受的專職抗原呈遞T細(xì)胞主要依賴于樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），有研究[29]發(fā)現(xiàn)OLP病損中存在DC、T細(xì)胞交互反應(yīng)引起T細(xì)胞活化。OLP的DC亞群主要包括上皮層中的朗格漢斯細(xì)胞、固有層/間充質(zhì)中的髓樣DC以及漿細(xì)胞樣DC。成熟DC表達(dá)T細(xì)胞活化所需要的全部分子，主要存在于固有層，并與T細(xì)胞成簇分布[30]；漿細(xì)胞樣DC主要產(chǎn)生IFN-α，有研究顯示IFN-α是另一種通過誘導(dǎo)黏病毒抗性蛋白A（my xo virus resistance protein A，MxA）和其他基因表達(dá)刺激Ⅰ型免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子[31-32]，可以啟動(dòng)自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）/T細(xì)胞的殺傷作用或者Fas L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33]。

一方面，雖然引起CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的抗原是未知的，但可以嘗試使用IFN-α來誘導(dǎo)OLP角化細(xì)胞凋亡，探索OLP致病過程的其他通路，有助于OLP的病理機(jī)制研究及靶向藥物開發(fā)。另一方面，DC作為抗原提呈細(xì)胞，誘導(dǎo)了特異性的適應(yīng)性免疫發(fā)生[34]，對(duì)DC的研究將有利于探索OLP炎癥發(fā)生的始動(dòng)因素, 為OLP預(yù)防治療提供理論依據(jù)和參考。

3 小結(jié)

綜上所述，目前OLP細(xì)胞模型已較為成熟，并且多數(shù)已經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，這為OLP病理機(jī)制尤其是特異性免疫應(yīng)答有關(guān)的研究提供了基礎(chǔ)。但國(guó)內(nèi)外尚未建立完善的OLP動(dòng)物模型，目前的OLP動(dòng)物模型可以形成固有層散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等慢性炎癥的病理表現(xiàn)，但還未出現(xiàn)典型的淋巴浸潤(rùn)帶，相對(duì)來說更接近于口腔苔蘚樣變的病理表現(xiàn)[20,35]，其主要難點(diǎn)在于：一是OLP特異性發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性；二是OLP不具有無限增殖的能力，無法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭虚L(zhǎng)期存在。未來的研究可以著眼于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、有效抗原的提取及IFN-α與IFN-γ誘導(dǎo)等方面入手，進(jìn)一步探索OLP動(dòng)物模型的建立。