魏徵霄 綜述,李青峰 審校

(四川省成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心,四川成都 610066)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于冠狀病毒屬，是一種陽(yáng)性單鏈RNA病毒,主要通過(guò)呼吸道傳播的RNA病毒,具有極高傳染性,被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一。但鑒于目前尚無(wú)特異性的靶向殺滅SARS-CoV-2的藥物，而認(rèn)識(shí)SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)、感染機(jī)制和實(shí)驗(yàn)室檢查可能有助于開(kāi)發(fā)有效的治療方法，故本文就SARS-CoV-2特征、感染的臨床表現(xiàn)及其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展予以綜述，以期為更好地防控、診斷和治療COVID-19提供參考。

1 病毒學(xué)特征與流行病學(xué)特點(diǎn)

冠狀病毒是球形或橢圓形的,有包膜,基因組為線性單股正鏈的RNA,在自然界中廣泛存在的一類病毒。它們的宿主范圍很廣,包括鳥(niǎo)類、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、寵物、駱駝和蝙蝠,主要引起呼吸道和胃腸道疾病。直到1975年,世界病毒命名委員會(huì)對(duì)其進(jìn)行正式命名,其目、科屬的關(guān)系才真正弄清楚:它們屬于巢病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)和正冠狀病毒亞科(Orthocoronaviridae)。冠狀病毒有四個(gè)屬,分別是Alphacoronavirus、Betacoronavirus、Deltacorona和Gammacoronavirus[1-3]。SARS-CoV-2屬于Betacoronavirus。

在2019年12月之前,科學(xué)界共發(fā)現(xiàn)有6種致病性的冠狀病毒,它們是屬于Alphacoronavirus屬的HCoV-229E和HCoV-NL63,以及屬于Beta冠狀病毒屬的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV[1-2]。其中有4種冠狀病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)較常見(jiàn),容易引起兒童和成人發(fā)生類似普通感冒的輕微呼吸道癥狀,致病性較低,醫(yī)學(xué)重視性不高。另外急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征的冠狀病毒(MERS-CoV)可以產(chǎn)生嚴(yán)重的下呼吸道感染,這兩種冠狀病毒都能導(dǎo)致人畜共患病,SARS和MERS的冠狀病毒曾大規(guī)模暴發(fā),在感染者中造成極高病死率(分別為10%、37%),構(gòu)成了重大的公共衛(wèi)生威脅和重大生命財(cái)產(chǎn)損失[1,4]。

ZHU等[5]研究報(bào)道通過(guò)對(duì)肺炎患者樣本進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了一種新的β冠狀病毒屬(β-coronavirus)病毒,命名為2019年新型冠狀病毒肺炎(COVID-19),該病毒與中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)不同,成為可以感染人類的冠狀病毒科的第7個(gè)成員。

中國(guó)疾控中心(CDC)團(tuán)隊(duì)在患者下呼吸道取得樣本,通過(guò)測(cè)序獲得病毒的完整基因序列。將基因組序列、引物、標(biāo)準(zhǔn)操作程序與WHO共享,有助于開(kāi)發(fā)靈敏的RT-PCR檢測(cè)技術(shù),實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。病毒株的獲取也有利于推動(dòng)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù),以期開(kāi)發(fā)更靈敏的檢測(cè)標(biāo)志物。

2 SARS-CoV-2感染:COVID-19及其臨床表現(xiàn)

2.1 傳播方式 研究者通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒最密切相關(guān),甚至在nsp7和E蛋白中與Bat-SL-CoVZC45表現(xiàn)出100%的氨基酸相似性,整體基因組序列一致性為96.2%,通過(guò)對(duì)蝙蝠中多種SARS樣冠狀病毒的鑒定,推斷蝙蝠可能是這些病毒的天然宿主[6-7]。但是,由于首次報(bào)告該病時(shí)市場(chǎng)上有多種其他動(dòng)物在售,因此需要更多的調(diào)查來(lái)確定SARS-CoV-2的天然宿主和中間宿主。

SARS-CoV-2過(guò)呼吸道進(jìn)入人體[8],感染導(dǎo)致COVID-19,其主要傳播方式以呼吸道飛沫為主,普通人群易感,平均潛伏期為5.2 d,基本繁殖數(shù)(R0)為2.2。大多數(shù)COVID-19患者為臨床輕度病例。也有研究者指出患有基礎(chǔ)疾病(包括高血壓、糖尿病、心臟病和/或腎病等)的老年男性死亡風(fēng)險(xiǎn)更高[7]。

有研究者從COVID-19感染者的糞便樣本中分離出SARS-CoV-2,證實(shí)了糞便中的確存在活病毒[9],但是,SARS-CoV-2的感染是否存在糞口傳播途徑還有待于科學(xué)界進(jìn)一步證實(shí)。

目前也有新生兒出生30 h后發(fā)生COVID-19的病例,母嬰傳播是否真實(shí)存在,尚待進(jìn)一步明確。而且有研究指出，減少人群聚集,并對(duì)潛在感染人群采取隔離等措施能有效預(yù)防或減少傳播的可能[10-11]。

2.2 感染機(jī)制 有研究表明SARS-CoV-2主要通過(guò)Spike蛋白(S蛋白)與宿主細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體結(jié)合來(lái)介導(dǎo)病毒的入侵,冠狀病毒S蛋白S1亞單位的N端結(jié)構(gòu)域(S1-NTD)和C端結(jié)構(gòu)域(S1-CTD)都能作為受體結(jié)合域(RBD)[12-13]。一般認(rèn)為S1-NTD結(jié)合糖類受體,S1-CTD結(jié)合蛋白類受體。

病毒通過(guò)S蛋白中的Arg426與ACE2中的Gln325/Glu329之間的氫鍵相互作用,來(lái)感染人的呼吸道上皮細(xì)胞,進(jìn)入細(xì)胞后,病毒RNA釋放出來(lái),并整合到宿主的遺傳物質(zhì)中,不斷地繁衍復(fù)制,并通過(guò)胞吐作用將病毒顆粒從被感染的細(xì)胞中釋放出來(lái)；同時(shí)SARS-CoV-2和細(xì)胞表面的ACE2一同過(guò)入胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞表面ACE2蛋白減少,ACE2蛋白的主要生理功能是擴(kuò)展血管,調(diào)節(jié)血壓,與高血壓、糖尿病、冠心病等代謝病密切相關(guān),這也從側(cè)面解釋了具有基礎(chǔ)疾病的人群COVID-19的易感性。COVID-19的感染機(jī)制還有很多未知,某些假設(shè)或推斷亟待科學(xué)界繼續(xù)深入研究以獲取更多更可靠的證據(jù)。

2.3 臨床表現(xiàn) COVID-19以發(fā)熱、干咳、乏力為主要特征,伴或不伴有發(fā)熱,部分伴有鼻塞、流涕、咽痛等類似感冒癥狀。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳、國(guó)家中醫(yī)藥管理局辦公室印發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》，重癥患者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥休克、代謝性酸中毒、凝血功能障礙及多器官衰竭等,并出現(xiàn)明顯的肺部影像學(xué)變化。

在一項(xiàng)針對(duì)41名住院患者的研究中,大多數(shù)患者均報(bào)告有發(fā)燒、干咳、肌肉酸痛和疲勞癥狀,很少出現(xiàn)咳嗽、頭痛、咯血和腹瀉的癥狀[14]。根據(jù)該研究,這些患者中約有一半患有合并癥,例如潛在的糖尿病,高血壓和心血管疾病。此外,患者入院后平均約8 d出現(xiàn)呼吸困難并伴有異常胸廓CT和肺炎,與病毒性肺炎相似,患者的X射線或胸部CT圖像顯示單側(cè)或雙側(cè)肺部受累。臨床并發(fā)癥包括急性呼吸窘迫綜合征、急性心臟損傷、繼發(fā)感染和氣胸等,這也與CHEN等[15]關(guān)于99例病例的回顧性分析的臨床表現(xiàn)大致相同。

COVID-19感染者血細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示白細(xì)胞減少和淋巴細(xì)胞減少,部分患者出現(xiàn)部分生化指標(biāo)的異常,ICU患者的凝血酶原、D-二聚體和細(xì)胞因子處于較高水平[14]。因?yàn)镃OVID-19輕癥的臨床表現(xiàn)與流行性感冒相似缺乏特異性,所以無(wú)法僅從患者的臨床表現(xiàn)診斷SARS-CoV-2感染,在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》將實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性或病毒基因測(cè)序作為金標(biāo)準(zhǔn)。

3 SARS-CoV-2感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

COVID-19的臨床診斷必須依據(jù)患者相關(guān)的流行病學(xué)史(兩周內(nèi)的活動(dòng)或旅行地區(qū)為武漢或14 d內(nèi)有SARS-CoV-2感染者的接觸史)、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果等予以綜合性判斷,目前確診以實(shí)驗(yàn)室檢查為準(zhǔn),改變的是判讀的方式。對(duì)SARS-CoV-2感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有病原學(xué)和血清學(xué)等檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)的樣本可以是疑似患者的鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等。

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1 基因測(cè)序 病毒的全基因組測(cè)序是研究病毒進(jìn)化、毒力因子變異的基礎(chǔ)。在COVID-19暴發(fā)的初期,有研究通過(guò)二代測(cè)序獲得了該病毒的整個(gè)基因組序列,并對(duì)7個(gè)保守的非結(jié)構(gòu)蛋白序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與SARS-CoV同源性(79.5%)[16]。同樣的有研究者也發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-2與NC_004718、bat-SL-CoVZC45和蝙蝠中檢測(cè)到的冠狀病毒(bat/Yunnan/RaTG13/2013)具有極高的基因組序列相似度(80%、88%、96%)[17]?；跀?shù)據(jù)共享理念,國(guó)家生物信息中心(CNCB)/國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(NGDC)建立了2019新型冠狀病毒信息庫(kù)(2019nCoVR https://bigd.big.ac.cn/ncov),為檢測(cè)試劑盒研發(fā)、抗病毒藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)等相關(guān)研究提供了支持。

3.1.2 核酸檢測(cè) 病毒核酸可用于早期檢測(cè)。根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第2版)》，現(xiàn)已建立的SARS-CoV-2特異性核酸檢測(cè)技術(shù)其病毒目標(biāo)片段是病毒ORF1ab和N基因,采用一步法、磁珠法或柱提法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)或?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR技術(shù)[13]。

與普通PCR相比,實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR利用信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,可以對(duì)初始模板量進(jìn)行定量檢測(cè)分析。具有靈敏、特異、準(zhǔn)確、快捷且重復(fù)性好等諸多優(yōu)勢(shì),深受臨床檢驗(yàn)工作者青睞。CORMAN等[18]在沒(méi)有病毒基因組核酸物理來(lái)源的情況下,建立了一種基于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù),基于網(wǎng)絡(luò)公布的2019新型冠狀病毒數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)計(jì)的特異性引物檢測(cè)RdRP基因、E、N基因,以此檢測(cè)SARS-CoV-2,并進(jìn)一步將SARS-CoV-2與SARS-CoV區(qū)別開(kāi)來(lái)。ZHOU等[13]開(kāi)發(fā)了一種基于刺突基因受體結(jié)合域的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,應(yīng)用于當(dāng)時(shí)7例病毒感染者血液、咽拭子及肛拭子樣本的檢測(cè),能夠?qū)ARS-CoV-2與包括人類在內(nèi)的所有其他冠狀病毒分開(kāi)。CHU等[19]報(bào)道了兩種用于檢測(cè)SARS-CoV-2的單步實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。兩種測(cè)定法靶向病毒基因組的Orf1b和N區(qū),發(fā)現(xiàn)N檢測(cè)比靶向Orf1b的檢測(cè)更為靈敏。筆者建議將前者用作篩選測(cè)定,而將后者用作診斷測(cè)定。

3.1.3 病毒的分離與培養(yǎng) 病毒的分離與培養(yǎng)是病毒感染實(shí)驗(yàn)診斷的經(jīng)典技術(shù),也是病原學(xué)鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。對(duì)于SARS-CoV-2,病毒研究機(jī)構(gòu)可以通過(guò)經(jīng)典的科赫氏法則對(duì)該病毒進(jìn)行初步鑒定,并通過(guò)電子顯微鏡觀察其形態(tài)[20]。

ZHOU等[13]以哺乳動(dòng)物細(xì)胞系Vero、Vero E6和Huh7為感染材料進(jìn)行了SARS-CoV-2的分離與培養(yǎng),并通過(guò)RT-PCR證實(shí)了病毒的存在。但是病原體的分離與培養(yǎng)需要時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)條件要求高,不宜于快速診斷,但分離的純培養(yǎng)毒株對(duì)于病原體的生物學(xué)特征、感染機(jī)制、治療藥物及疫苗的研究等都是不可或缺的。

3.2 免疫血清學(xué)檢測(cè) 由于分子診斷和病毒培養(yǎng)受限制條件較多,開(kāi)發(fā)血清學(xué)檢測(cè)試劑引起了科學(xué)界極大的興趣。已報(bào)道對(duì)MERS-CoV檢測(cè)的血清學(xué)方法包括中和試驗(yàn)(NT)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光(IFA)、蛋白質(zhì)微陣列(PM)、免疫印跡(Western-blot)等[21]。整體來(lái)說(shuō),血清學(xué)檢測(cè)相比核酸檢測(cè),易于快速操作,但靈敏度和特異度較低[22-23]。

ELISA基于抗原與抗體特異結(jié)合特點(diǎn),利用酶的催化與信號(hào)放大作用,來(lái)判斷樣本的陰陽(yáng)性,是目前血清學(xué)檢測(cè)通用的方法之一[24]。在ELISA早期方法建立中,主要以滅活病毒株為抗原制備單克隆抗體[25]。大多數(shù)冠狀病毒具有相似的病毒結(jié)構(gòu),相似的感染途徑和相似的S蛋白結(jié)構(gòu)[26],這表明相似的研究也可能適用于SARS-CoV-2。QIU等[27]用含有S蛋白的可溶性重組RBD免疫野生型小鼠,然后將小鼠進(jìn)行人源化分離,或直接免疫轉(zhuǎn)基因小鼠以獲得人源化的抗體,用于治療MERS-CoV感染。

有研究使用編碼冠狀病毒刺突蛋白的基因,證實(shí)了假病毒中和抗體測(cè)試(ppNT),具有很高的靈敏度和特異度[28-29]。這也為將來(lái)開(kāi)發(fā)鑒定SARS-CoV-2的相關(guān)抗原和單克隆抗體提供了借鑒。JIANG等[30]證明了SARS-CoV S蛋白中的RBD是SARS患者中和抗體的主要靶標(biāo),并且能夠在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)高效的中和抗體應(yīng)答和長(zhǎng)期保護(hù)性免疫,它包含6個(gè)不同的構(gòu)象的中和表位,能產(chǎn)生了一系列具有不同中和活性的小鼠單克隆抗體(mAb),該小組還表明,這些SARS-CoV-RBD特異性中和單克隆抗體可以交叉中和蝙蝠SL-CoV,例如蝙蝠SL-CoV-W1V1[31],從一定程度上表明這些抗體也可以交叉中和SARS-CoV-2。

有研究者針對(duì)98例SARS患者的研究發(fā)現(xiàn)一般在感染7 d后可以發(fā)現(xiàn)IgM陽(yáng)性,并在發(fā)病3周后陽(yáng)性最高,15 d左右出現(xiàn)IgG陽(yáng)性,60 d左右陽(yáng)性最高,且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)[32]。ZHANG等[33]使用SARSr-CoV Rp3 NP作為抗原開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)SARS-CoV-2的IgG和IgM ELISA試劑盒,連續(xù)監(jiān)測(cè)15例COVID-19患者IgG和IgM的滴度變化,發(fā)現(xiàn)采樣第5天IgG的陽(yáng)性率(81%～100%)和IgM的陽(yáng)性率(50%～81%)都大幅增加,這與核酸相對(duì)較低的陽(yáng)性檢出率(50%)相反。蛋白印跡比ELISA更加特異,但由于過(guò)程繁瑣,更適用于驗(yàn)證抗體的存在,不適用于大批量樣本篩查[21]。

4 總結(jié)及展望

SARS-CoV-2與SARS-CoV和MERS-CoV同源,它們都屬于Beta冠狀病毒。由于SARS-CoV-2在全球范圍內(nèi)傳播,這對(duì)臨床管理構(gòu)成重大挑戰(zhàn),對(duì)公共健康構(gòu)成了巨大威脅。目前尚沒(méi)有疫苗或針對(duì)性藥物治療SARS-CoV-2感染,所以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段的加強(qiáng)能夠縮短檢出時(shí)間,在一定程度上減少甚至遏制病毒的傳播。

目前雖然已經(jīng)有許多實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法可以用于SARS-CoV-2的檢測(cè)。病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)樣本保存要求較高,限制了在實(shí)際工作中的應(yīng)用。核酸檢測(cè)可以在P2級(jí)實(shí)驗(yàn)室中將病毒滅活后進(jìn)行檢測(cè),在目前的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用較為廣泛,抗原抗體檢測(cè)方法由于操作簡(jiǎn)便易行,在時(shí)間工作中更易于推廣。

在疫情暴發(fā)的當(dāng)下,鑒于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果在疾病診斷中的重要作用,呼吁多種檢測(cè)方法聯(lián)合使用,更快更準(zhǔn)確地對(duì)疾病進(jìn)行診斷。由于SARS-CoV-2的高度傳染性,操作簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣本用量少、能快速現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)的試劑開(kāi)發(fā)是今后SARS-CoV-2檢測(cè)的發(fā)展方向。