孫 艷 綜述,多麗波審校

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，黑龍江哈爾濱 150086)

腸桿菌科細(xì)菌是社區(qū)和醫(yī)院感染中的常見病原菌之一，20世紀(jì)80年代以來，碳青霉烯類抗菌藥物一直被認(rèn)為是對抗產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶腸桿菌感染的最有效手段，但近年來臨床上抗菌藥物的過度使用導(dǎo)致耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的產(chǎn)生，并在全球范圍內(nèi)呈廣泛流行的趨勢。2017年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，腸桿菌科細(xì)菌對3種碳青霉烯類藥物的耐藥率已接近10.0%，而肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率已上升至20.9%和24.0%[1]?？寺鞑ゼ巴ㄟ^質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播使CRE感染發(fā)病率持續(xù)升高，進而使臨床上應(yīng)用抗感染藥物治療的困難逐年上升。CRE耐藥機制主要包括以下幾個方面：(1)產(chǎn)碳青霉烯酶；(2)外膜蛋白的缺失或合并產(chǎn)AmpC酶或ESBLs；(3)青霉素結(jié)合蛋白對碳青霉烯類藥物親和力下降；(4)藥物外排泵高度表達。研究CRE的耐藥機制及實驗室早期檢測對臨床上治療其感染具有重要指導(dǎo)意義。

1 CRE定義

2015年美國疾病控制中心(CDC)對CRE定義為對任意一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，或產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌。此外，對亞胺培南天然非敏感的細(xì)菌，如摩根摩根菌、變形桿菌、普羅威登斯菌，需對其他碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。

2 CRE耐藥機制

2.1產(chǎn)碳青霉烯酶 產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物耐藥的最重要機制。根據(jù)Ambler分類，碳青霉烯酶主要分為A、B和D類。其中A類碳青霉烯酶和D類碳青霉烯酶屬絲氨酸酶，主要通過水解絲氨酸活性位點使藥物失活；B類碳青霉烯酶又叫金屬酶，其活性中心需結(jié)合金屬鋅離子才能發(fā)揮催化活性。

2.1.1A類碳青霉烯酶 至今發(fā)現(xiàn)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的A類碳青霉烯酶包括KPC、GES、IMI、SME及SFC等，最常見的是KPC，其他酶在我國相關(guān)報道尚少，在其他國家腸桿菌科細(xì)菌中有檢出或流行。A類碳青霉烯酶可水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物，包括碳青霉烯類藥物、青霉素類藥物、氨曲南，其活性可被含酶抑制劑部分抑制，被硼酸完全抑制，不能被乙二胺四乙酸抑制。

肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPCs)是A類碳青霉烯酶中最重要的酶，由質(zhì)粒編碼，既可通過克隆菌株垂直傳播，也可通過遺傳性移動元件如轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等水平傳播，KPCs可水解所有β-內(nèi)酰胺類藥物，產(chǎn)KPCs型CRE僅對替加環(huán)素、多黏菌素及氨基糖苷類抗菌藥物敏感。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)22種KPCs[2]，各種KPCs顯示出高度同源性，并通過非同義突變而不同，KPC-2和KPC-3在全球范圍內(nèi)最常見，我國華東地區(qū)KPC-2檢出率較高，而在我國臺灣KPC-2及KPC-17檢出率較高。

含有不同質(zhì)粒，但具有相同遺傳結(jié)構(gòu)的不同克隆Tn4401被認(rèn)為是blaKPC在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的起源。有研究發(fā)現(xiàn)，blaKPC-2位于Tn4401轉(zhuǎn)座子上，其上游為Tn4401-tnpR、Tn4401-tnpA、ISKpn7序列,下游為ISKpn6序列[3]。與上述研究不同，2014年，LUO等[4]通過對從北京某醫(yī)院獲得的12株CRE攜帶的blaKPC-2遺傳背景研究發(fā)現(xiàn)，blaKPC-2位于基于轉(zhuǎn)座子Tn3和部分Tn4401區(qū)段的整合結(jié)構(gòu)上，其中ISKpn8代替了ISKpn7。

2.1.2B類碳青霉烯酶 B類碳青霉烯酶為金屬酶，主要包括5種：VIM、IMP、NDM、GIM和SPM，最常見的是IMP、NDM、VIM。B類碳青霉烯酶能水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類藥物，不能水解氨曲南，可被乙二胺四乙酸抑制而不受含酶抑制劑的影響。

2010年，在印度發(fā)現(xiàn)的NDM-1引起廣泛關(guān)注，產(chǎn)NDM-1細(xì)菌對除替加環(huán)素與多黏菌素之外的抗菌藥物均耐藥，部分細(xì)菌甚至表現(xiàn)為泛耐藥。GRUBER等[5]通過建立體內(nèi)感染產(chǎn)NDM-1黏質(zhì)沙雷菌小鼠模型，證明產(chǎn)NDM-1菌不僅廣泛耐藥，其半數(shù)致死量比非產(chǎn)NDM-1菌高出許多。NDM-1主要流行于印度、巴基斯坦等南亞國家，跨境旅行是NDM-1在國際間傳播的重要原因，而國內(nèi)報道的NDM-1案例多無國外旅居史，因此，我國被認(rèn)為是繼印第安次大陸和巴爾干半島之后的第三大NDM傳播源。目前，已發(fā)現(xiàn)24種NDM，在腸桿菌科細(xì)菌中檢出21種，主要由肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌產(chǎn)生。與NDM-1相比，各亞型通過單個或多個氨基酸的替換而不同，進而酶穩(wěn)定性和活性也不同，NDM-4、NDM-5及NDM-7的水解活性強于NDM-1[6]。blaNDM-1位于轉(zhuǎn)座子Tn125上兩個插入序列ISAba125之間，Tn125能促進blaNDM-1表達而增強菌株對碳青霉烯類藥物的水解活性，blaNDM-1下游存在bleMBL基因，能夠穩(wěn)定NDM-1基因，其他變異型中也存在兩種序列，表明遺傳環(huán)境并未發(fā)生變化。

VIM是金屬酶中水解碳青霉烯類藥物能力最強的酶，2003年，MIRIAGOU等[7]從希臘1例患者尿液標(biāo)本中分離的大腸埃希菌檢出VIM-1，隨后，VIM在意大利、法國和俄羅斯等歐洲國家均有檢出，主要由肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌產(chǎn)生，blaVIM常定位于Ⅰ類整合子。目前，發(fā)現(xiàn)至少46種VIM，VIM-2在全球最常見，2013年，我國WEI等[8]首次從蕪湖一家醫(yī)院分離的弗氏檸檬酸桿菌中檢出VIM-4。

IMP-1首次發(fā)現(xiàn)于日本黏質(zhì)沙雷菌的整合子上，之后日本廣泛傳播產(chǎn)IMP-1型CRE。目前至少檢出52種IMP，主要分布在日本、巴西等國家，國內(nèi)IMP-4和IMP-8較常見，且相繼在上海、湖北、廣東和臺灣等地有檢出。

2.1.3D類碳青霉烯酶 D類碳青霉烯酶又稱苯唑西林酶(OXA)，對青霉素類藥物水解作用強而水解碳青霉烯類藥物弱，不能水解超廣譜頭孢菌素類藥物，不被克拉維酸和乙二胺四乙酸抑制，常合并其他耐藥機制而增強菌株耐藥性：如合并其他產(chǎn)碳青霉烯酶表達，外膜蛋白改變，由作為啟動子的IS元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄增加，基因拷貝數(shù)增加，以及外排泵作用。

目前，發(fā)現(xiàn)D類碳青霉烯酶400余種，腸桿菌科細(xì)菌最常見為OXA-48及亞型。OXA-48最初于2004年在土耳其分離的CRKP中被報道[9]，隨后在包括黎巴嫩、突尼斯、埃及及摩洛哥等許多環(huán)地中海國家相繼被分離并報道。2013年美國首次報道了兩株攜帶OXA-48的CRKP之后，在美國OXA-48檢出率逐年上升[10]。國內(nèi)產(chǎn)OXA-48腸桿菌科細(xì)菌的傳播和暴發(fā)報道較少，目前，在我國臺灣、北京及浙江等地有報道，2015年，MA等[11]首次報道了分離自我國臺灣地區(qū)的4株攜帶OXA-48的CRKP。2016年，GUO等[12]報道了產(chǎn)OXA-48肺炎克雷伯菌在北京一家醫(yī)院呼吸科的暴發(fā)。

blaOXA-48攜帶于60×103大小的InCl/M型接合質(zhì)粒(JN626286)的Tn1999復(fù)合轉(zhuǎn)座子上兩個插入序列IS1999之間，其下游是可編碼調(diào)節(jié)蛋白的lysR基因。意大利學(xué)者GIANI等[13]通過對大腸埃希菌攜帶的blaOXA-48基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子Tn1999的變異亞型Tn1999.2(JN714122)于blaOXA-48上游插入了IS1R元件，而Tn1999.3(HE617182)則在blaOXA-48上下游均有IS1R元件插入，IS1R可充分激活blaOXA-48，使blaOXA-48過度表達。

除OXA-48還發(fā)現(xiàn)多種亞型，最常見的是OXA-181，其次包括OXA-162、-204、-232、-244、-245、-370、-436、-438和-484，以及不水解或弱水解碳青霉烯類藥物的OXA-163、-247和-405。

2.2外膜蛋白的缺失或合并產(chǎn)AmpC酶或ESBLs 細(xì)菌耐藥機制之一是產(chǎn)生外膜屏障，即通過改變膜孔蛋白結(jié)構(gòu)使其與抗菌藥物的結(jié)合降低。2012年，F(xiàn)INDLAY等[14]對1株產(chǎn)CTX-M-15肺炎克雷伯菌進行研究，通過十二烷基硫酸鈉-脈沖場凝膠電泳(SDS-PFGE)發(fā)現(xiàn)該菌缺乏OmpK35及OmpK36，且顯示對美羅培南耐藥，最小抑菌濃度(MIC)值為8 μmol/L。2013年，我國學(xué)者SHI等[15]報道了產(chǎn)DHA-1型AmpC酶合并OmpK36蛋白缺失的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥，但該菌不產(chǎn)碳青霉烯酶。以上研究表明，外膜蛋白缺失或合并產(chǎn)AmpC酶或ESBLs可介導(dǎo)腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物的耐藥。

2.3青霉素結(jié)合蛋白(PBP)對碳青霉烯類藥物親和力下降 碳青霉烯類藥物可與細(xì)菌內(nèi)膜表面的PBP結(jié)合，如PBP2和PBP3，破壞細(xì)胞壁合成，使細(xì)菌溶解。2013年，有學(xué)者通過將大腸埃希菌的MutS及toiC基因敲除，構(gòu)建了1株P(guān)BP2高突變率，且無外排泵活性的大腸埃希菌(ΔmutSΔtolC)，發(fā)現(xiàn)PBP2不同位置的突變可導(dǎo)致菌株對不同類型的碳青霉烯類藥物耐藥[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，編碼PBP2和PBP3的基因mrdA和基因fstⅠ的突變可分別導(dǎo)致PBP2和PBP3對美羅培南和厄他培南的親和力下降，進而增強菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥性[17]。

2.4藥物外排泵的高度表達 外排泵過度表達與CRE的產(chǎn)生密切相關(guān)。我國臺灣YANG等[18]曾報道，通過抑制外排泵AcrAB-TolC的活性，可使陰溝腸桿菌對厄他培南敏感性增加。巴西ROSA等[19]從耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌中檢出AcrAR基因，而在耐碳青霉烯類產(chǎn)氣腸桿菌未檢出該基因，但通過加入泵抑制劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)，證明外排泵活性存在，表明存在其他未知的外排泵。

3 CRE的實驗室檢測

由CRE引起的感染流行是全球健康問題，早期檢測CRE對指導(dǎo)臨床抗菌治療及控制感染具有重要意義。目前，可用于碳青霉烯酶的檢測方法主要包括表型檢測、分子技術(shù)及免疫層析法。

3.1表型檢測方法

3.1.1改良霍奇試驗(MHT)及相關(guān)試驗 將指示菌與待測菌共同孵育，結(jié)果指示菌在待測菌接種線與抑菌環(huán)相交處出現(xiàn)增強生長，即判斷為MHT陽性。MHT檢測A類碳青霉烯酶和D類碳青霉烯類酶的靈敏度及特異度均超過90%，但檢測NDM的靈敏度低于50%。2016年P(guān)ASTERAN等[20]在此基礎(chǔ)上進行改良，通過加入非離子表面活性劑Triton X-100(可釋放固定于膜上的脂蛋白-NDM)，對145株產(chǎn)酶株和40株非產(chǎn)酶株進行研究，檢測NDM的靈敏度高達90%。但若存在其他耐藥機制(如產(chǎn)ESBLs或產(chǎn)AmpC酶聯(lián)合膜孔蛋白缺失)，MHT會出現(xiàn)假陽性，TAKAYAMA等[21]發(fā)現(xiàn)通過加入氯唑西林可消除假陽性。MHT所用試劑價格便宜，操作簡便，2010年美國和臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦MHT為CRE的表型確證試驗，但其耗時長，難以解釋某些結(jié)果，不能區(qū)分酶類型，2018年已從CLSI M100-S28文件中刪除。

3.1.2Carba NP(CNP)試驗及相關(guān)試驗 CNP試驗原理是碳青霉烯酶水解β-內(nèi)酰胺酶，使pH下降，指示劑酚紅由紅色變?yōu)辄S色。其對A類碳青霉烯酶及B類碳青霉烯酶檢測的靈敏度及特異度高達100.0%和94.4%，但對OXA-48的檢測靈敏度低于75.0%。隨后，研究者對CNP試驗進行系列改進，聯(lián)合他唑巴坦及乙二胺四乙酸開發(fā)的CNP Ⅱ試驗可區(qū)分產(chǎn)碳青霉烯酶類型，且靈敏度及特異度均為100.0%[22]。改良的BYG Carba試驗通過檢測電化學(xué)信號判斷結(jié)果，使結(jié)果更具有客觀性，且檢測OXA-48的靈敏度高達93.2%[23]。CNP試驗快速、準(zhǔn)確，2015年CLSI M100-S25文件推薦其為檢測CRE的表型確證試驗，用于流行病學(xué)和醫(yī)院感染的監(jiān)控。但CNP試驗操作繁雜，需特殊試劑，不適合在常規(guī)實驗室開展。

3.1.3碳青霉烯滅活試驗(CIM)及相關(guān)試驗 CIM首次由VAN DER ZWALUW等[24]報道，其原理是將浸泡過待測菌液的美羅培南紙片與標(biāo)準(zhǔn)菌共同培養(yǎng)，通過抑菌環(huán)大小來判定產(chǎn)酶與否，且該研究報道檢測CRE的結(jié)果與PCR一致。隨后,改良碳青霉烯類失活法(mCIM)試驗出現(xiàn)，用營養(yǎng)肉湯代替水制備菌懸液，并延長孵育時間，檢測CRE靈敏度更高。eCIM加入金屬酶抑制劑乙二胺四乙酸，其與mCIM聯(lián)合應(yīng)用可初步區(qū)分絲氨酸酶與金屬酶，2018年CLSI推薦二者聯(lián)合使用作為鑒定產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)腸桿菌科細(xì)菌的方法。CIM操作簡單，價格低廉，試劑易獲得，目前已在微生物實驗室開展應(yīng)用。

3.1.4流式細(xì)胞術(shù)(FC) FC是一種快速、準(zhǔn)確分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其功能參數(shù)的高通量技術(shù)，近年來，F(xiàn)C被應(yīng)用于CRE的檢測。FC原理是藥物作用于細(xì)菌，細(xì)胞膜通透性改變，利用熒光染料染色，通過FC測得熒光強度的變化而反映藥物的抗菌活性。2016年，SILVA等[25]通過加入一種細(xì)胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料DiBAC4(3)，并結(jié)合不同產(chǎn)碳青霉烯酶抑制劑，建立了一種基于FC可區(qū)分不同類型產(chǎn)碳青霉烯酶的表型檢測方法，其檢測CRE靈敏度及特異度均為100.0%。FC具有可定量分析、簡便、耗時短等優(yōu)點，但其所需設(shè)備昂貴，未在常規(guī)實驗室開展。

3.1.5基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS) 近年來，MALDI-TOF-MS廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)菌耐藥性，其原理是將待檢菌與抗菌藥物共同孵育，通過MALDI-TOF-MS檢測抗菌藥物水解或脫羧產(chǎn)物相對于其原始相對分子質(zhì)量的變化，判斷是否產(chǎn)生水解該抗菌藥物的酶。2015年，LASSERRE等[26]以亞胺培南作為反應(yīng)底物，以亞胺培南與其產(chǎn)物峰面積的比值定義產(chǎn)酶株，檢測結(jié)果靈敏度為99.0%，特異度為100.0%。由于OXA類酶水解活性弱，采用MALDI-TOF-MS檢測OXA類酶的靈敏度僅為76.0%，PAPAGIANNITSIS等[27]加入NH4HCO3，將反應(yīng)液pH調(diào)至7.0，使MALDI-TOF-MS檢測OXA-48的靈敏度達98.0%。MALDI-TOF-MS是一種快速、低成本、高通量的CRE檢測方法，但其只能檢測產(chǎn)酶CRE，且質(zhì)譜儀價格昂貴，方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化。

3.2分子檢測方法 上述表型檢測方法均不能確定CHLBs基因型，結(jié)果仍需分子檢測技術(shù)確證基因型。傳統(tǒng)PCR實驗耗時長、效率低，且產(chǎn)物易污染，基于PCR，臨床上開發(fā)了更為快速、高效、準(zhǔn)確的分子檢測方法。

3.2.1環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP) LAMP檢測原理為針對靶基因上的6個區(qū)域設(shè)計4條引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下擴增，通過觀察白色沉淀判斷靶基因的存在。CHENG等[28]利用Bst聚合酶擴增基因，以SYBR為指示劑檢測CHLBs基因(NDM、KPC、IMP及VIM)，結(jié)果與傳統(tǒng)PCR完全一致?；贚AMP的試劑盒也相繼開發(fā)，eazyplexw?SuperBug CRE系統(tǒng)有很高的通用性和準(zhǔn)確性，可快速檢測含有各種CHLBs耐藥決定簇的菌株，該系統(tǒng)可檢測的基因型包括VIM(1-37)、NDM(1-7)、KPC(2-15)、OXA-48家族(OXA-48、-162、-204和-244)、CTX-M-1及CTX-M-9 ESBL家族[29]。

3.2.2二代測序(NGS) NGS即高通量測序，是一種全基因組測序，具有高輸出量和高解析度的特性，可提供豐富的遺傳學(xué)信息，KHONG等[30]利用NGS對33株CRE測序，發(fā)現(xiàn)一種新型NDM質(zhì)粒-pSg1-NDM，表明NGS可檢出突變或新型基因型。NGS還可檢測整合子和轉(zhuǎn)座子等，發(fā)現(xiàn)其他耐藥機制如外膜蛋白缺失，外排泵過度表達等。NGS可同時完成菌株流行病學(xué)和耐藥機制的研究，對院內(nèi)感染控制提供指導(dǎo)，但NGS成本高，需專業(yè)技術(shù)及設(shè)備，未能得到廣泛應(yīng)用。

3.3免疫學(xué)方法 最近發(fā)展起來的一種抗體介導(dǎo)的檢測產(chǎn)碳青霉烯酶的免疫分析方法，利用CHLBs免疫小鼠獲得單克隆抗體，進而通過抗原抗體特異反應(yīng)檢測待測菌，基于此原理開發(fā)的試劑盒Carba5可同時檢測5種產(chǎn)碳青霉烯酶，包括：NDM-1(-4、-5、-6、-7、-9)、KPC-2(-3)、IMP-1(-8、-11)、OXA-48(-162、-181、-204、-232、-244、-517、-519、-535)及VIM-1(-2、-4、-19)，特異度和靈敏度均為100.0%[31]。Carba5可直接檢測單個菌落、尿液標(biāo)本或血培養(yǎng)標(biāo)本，檢測下限為106CFU/mL，快速(15 min)，易于實施，可在常規(guī)實驗室中進行，但此方法只能檢測產(chǎn)酶CRE。

4 結(jié) 語

近幾十年來，CRE在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶基因的水平傳播是CRE流行激增的主要原因，目前常見的產(chǎn)碳青霉烯酶為KPC、VIM、NDM、IMP和OXA家族，國內(nèi)以KPC、NDM及IMP為主，OXA-48報道尚少，但也有零星報道及暴發(fā)流行[11-12]，應(yīng)引起重視。另外，產(chǎn)酶菌株已從產(chǎn)單一碳青霉烯酶發(fā)展到產(chǎn)多種碳青霉烯酶，研究發(fā)現(xiàn)同時產(chǎn)多種產(chǎn)碳青霉烯酶會增加菌株耐藥性，進而增加臨床用藥難度。面對CRE的快速傳播，實驗室應(yīng)根據(jù)本地區(qū)CRE流行特點，選擇高靈敏度及高特異度的檢測方法對CRE早期檢測，以期在一定程度上控制CRE的感染和流行，同時，對CRE耐藥機制的深入研究將有助于指導(dǎo)臨床合理用藥及新型藥物的研發(fā)。