李芳蓉，田永峰，陳 鑫，張建軍

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)教學(xué)部，甘肅 定西 743000)

紅芪(radix hedysari)是甘肅省重要的道地特產(chǎn)名貴藥材，系豆科植物多序巖黃耆(原變種)的干燥根[1]，性微溫，味甘，歸脾、肺二經(jīng)，具有固表止汗、升陽益氣、排毒利尿消腫、排膿和斂瘡生肌等功效[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明：紅芪能夠強(qiáng)心利尿、抗病毒、提高免疫力[4-5]、抗自由基等[6-7]，同時還具有抑制金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌及降壓作用。相關(guān)藥理活性研究多集中于免疫調(diào)節(jié)[8]、抗衰老、對心血管和內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)、減輕糖尿病并發(fā)癥、降血糖、強(qiáng)心利尿、抗炎、抗自由基[9]、抗病毒、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]等藥理作用。紅芪有滋補(bǔ)作用，自古除藥用外，還用于做湯、燉肉、泡酒等，開發(fā)利用價值十分可觀[12]。

目前，惡性腫瘤已成為威脅人類生命的頭號惡性疾病。因此，醫(yī)藥學(xué)研究者都在尋找天然優(yōu)質(zhì)、療效確切、低毒無副作用的抗腫瘤藥物。紅芪多糖(Hedysarum polysaccharide，HPS)，低毒且免疫活性強(qiáng)[13-14]，是紅芪主要活性成分，備受醫(yī)者青睞。紅芪在抗腫瘤和提高免疫力[15]方面應(yīng)用前景廣闊。紅芪的抑瘤效應(yīng)主要由紅芪多糖產(chǎn)生，抑瘤作用的基本機(jī)制皆通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)揮作用[1, 16]。紅芪多糖對糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、色素上皮細(xì)胞衍生因子(pigment epithlium-derived facto, PEDF)及血清C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)表達(dá)具有影響，能夠改善視網(wǎng)膜受損的程度[17]。HPS可以通過調(diào)控氧化應(yīng)激的方式改善db/db小鼠的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)心肌損傷。其機(jī)理是通過增加Nrf2的表達(dá)影響抗氧化酶類的表達(dá)[18]。隨著老齡化社會的來臨，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的發(fā)病率日漸升高，極大危害了老年人身心健康，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量，加重社會與家庭的生活及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。HPS具有良好保護(hù)AD細(xì)胞模型存活率下降的作用[19]。Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y受HPS作用后可以使多種蛋白表達(dá)量變化明顯，這些蛋白質(zhì)可能是HPS發(fā)揮抗AD作用的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)。這方面的研究，在蛋白質(zhì)水平上可為HPS的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制探討和中藥新藥HPS及其衍生物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持[20]。HPS在抗腫瘤和阿爾茨海默病治療中的應(yīng)用，使得有關(guān)提取與分子修飾的研究具有極其重要的意義。

本文綜述了近年來有關(guān)超聲波技術(shù)在紅芪多糖的提取和分子修飾方面的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，總結(jié)現(xiàn)階段研究的成果與不足，展望了未來的研究方向和發(fā)展趨勢，旨在為超聲波技術(shù)在紅芪多糖的提取和分子修飾方面應(yīng)用和進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。

1 中藥有效成分超聲波提取及其特點(diǎn)

1.1 中藥有效成分的超聲波提取

超聲波的聲學(xué)頻率為2×104～109Hz，頻率高、波長短、穿透力強(qiáng)、方向性好[21]。超聲波有許多物理性能比較特殊，且安全性高，沒有任何化學(xué)殘留，操作簡便高效[22-23]，故其在醫(yī)療衛(wèi)生、生物技術(shù)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)等方面應(yīng)用廣泛且意義重大[24]。

天然藥物有效成分超聲波提取是先根據(jù)需要將中藥材切碎或粉碎，放入已加入提取介質(zhì)(或稱溶媒，如H2O、CH3CH2OH或其他有機(jī)溶劑等)且外壁粘接換能器振子的容器內(nèi)；當(dāng)超聲波發(fā)生器開啟時，超聲波由換能器振子振動發(fā)出進(jìn)入提取介質(zhì)，高強(qiáng)度的超聲傳播伴隨著一系列高強(qiáng)度剪切波和壓縮，又產(chǎn)生沖擊波。沖擊波在提取介質(zhì)中產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械攪拌作用、超聲空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)等。一方面，沖擊波下壓力陡降形成微型空腔，導(dǎo)致外溢巨大能量，將藥材的細(xì)胞壁有效破碎，使中藥材有效成分呈游離狀態(tài)釋放，并溶入提取介質(zhì)，提取效率提高[25-26]；另一方面，可使提取介質(zhì)分子運(yùn)動速度加快，穿透力增強(qiáng)，使藥材中的有效成分與提取介質(zhì)相互快速接觸并混合、溶合[27]。因此，簡言之，超聲輔助提取是通過超聲波的強(qiáng)烈而高速的攪拌作用及空化效應(yīng)，使中藥植物細(xì)胞壁易于破碎，有利于有效成分的溶出和釋放，提取效率提高[28]。

1.2 中藥有效成分超聲波提取的特點(diǎn)

超聲波提取具有的特點(diǎn)[29-30]：①提取充分、效率高。獨(dú)特的物理性能使得超聲波足以使植物細(xì)胞組織變形甚至破壁，從而充分提取中藥有效成分，較傳統(tǒng)工藝提取率顯著，提高率達(dá)1～10倍。②提取處理量大，耗時短。通常超聲波輔助強(qiáng)化中藥有效成分提取獲得最佳提取率僅需24～40 min，提取時間較傳統(tǒng)方法大大縮短，超過2/3，能夠大量處理藥材原材料。③提取溫度低、能耗小，對藥材有效成分具有保護(hù)作用。超聲提取中藥材的最佳溫度僅高于室溫15～45 ℃，能夠大量節(jié)省能源，同時對藥材有效成分中熱穩(wěn)定差、易氧化或水解的組分具有良好的保護(hù)作用。④提取適應(yīng)性廣泛。超聲波輔助提取的中藥材成分不受分子大小及極性的限制，絕大多數(shù)種類中藥材和各類成分的提取均可適用。⑤提取物易于分離和純化。超聲提取過程中藥液未摻入雜質(zhì)，提取后的有效成分易于分離、純化。⑥提取成本低、經(jīng)濟(jì)效益高。超聲提取中藥材有效成分工藝運(yùn)行成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著。⑦常壓提取，安全性好，操作簡便，設(shè)備易于保養(yǎng)維護(hù)。超聲提取在自然壓力下進(jìn)行，操作安全，操作工藝簡單，操作方便易行，超聲提取設(shè)備的保養(yǎng)、維護(hù)都很簡便[31]。

2 中藥多糖的分子修飾及超聲波的分子修飾作用

2.1 中藥多糖的分子修飾

國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果均表明，多糖的生物活性決定于多糖的分子量、分子結(jié)構(gòu)、取代基種類、數(shù)目及其位置關(guān)系[32]。中藥多糖分子修飾是以物理、化學(xué)和生物等手段對多糖的主、側(cè)鏈的功能基團(tuán)或某些特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造，使多糖的某些理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以增強(qiáng)其生物活性[33-34]。多糖修飾通常包括降解修飾和接枝修飾兩類，所謂降解修飾即采取的方法使多糖分子結(jié)構(gòu)中的部分基團(tuán)脫落以制備較低分子量的多糖；而接枝修飾正好相反，即對多糖經(jīng)進(jìn)行修飾改造，在其分子中增加功能基團(tuán)，增大相對分子質(zhì)量。經(jīng)過中藥多糖的分子修飾能得到各種結(jié)構(gòu)類型和不同生物活性的多糖衍生物，奠定了分析多糖分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)。其研究成果可直接為多糖分子修飾指明方向，為未來多糖類藥物的研究、設(shè)計(jì)和開發(fā)獲取理論依據(jù)[35]。經(jīng)修飾可引起多糖分子的空間結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量，取代基類型、數(shù)目及位置等的改變[36]，從而影響多糖的理化性質(zhì)及生物活性，故優(yōu)選適當(dāng)方法進(jìn)行多糖分子結(jié)構(gòu)的修飾，以改善其理化性質(zhì)，增強(qiáng)其固有的生物活性或增加新生物活性，為研究多糖結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

2.2 超聲波對多糖的分子修飾作用

超聲波修飾多糖的作用屬于物理降解修飾，是高效、綠色的方法，操作簡單，條件可控性好。與其他方法相比較，超聲波降解修飾法具有節(jié)能省時、操作程序簡化、反應(yīng)速率快、有機(jī)溶劑使用量減少，降解過程中對多糖分子中的活性基團(tuán)破壞少，對環(huán)境造成的危害顯著降低等優(yōu)點(diǎn)[37]。現(xiàn)有研究認(rèn)為超聲波降解修飾多糖主要機(jī)理是自由基氧化還原反應(yīng)與機(jī)械斷鍵作用。自由基氧化還原作用指超聲波在溶劑中傳播時，在足夠大的聲強(qiáng)和負(fù)壓作用下，使溶劑的平均分子間距增大至超過極限距離后破壞其結(jié)構(gòu)完整性，形成空穴并爆裂產(chǎn)生溫度劇變和局部性高壓[29]，提供自由基產(chǎn)生所需能量?？昭ㄡ尫诺臎_擊波能量使聚合物降解[38]。熱效應(yīng)和自由基對低分子量物質(zhì)較有效；機(jī)械效應(yīng)對高分子物質(zhì)更有效，且隨物質(zhì)分子量的增加而增加。不同自由基由不同類型的溶劑形成，造成的超聲波的反應(yīng)結(jié)果也不相同；而機(jī)械性斷鍵作用則是指在彈性機(jī)械波超聲波的作用下，溶劑分子產(chǎn)生激烈而快速變化的機(jī)械運(yùn)動，從而提供足夠能量并對多糖分子的共價鍵進(jìn)行剪切斷鍵，降解多糖分子[39-40]。

3 超聲波提取紅芪多糖及對其分子修飾作用的研究情況

超聲波的強(qiáng)烈、高速的攪拌作用和空化效應(yīng)，使超聲提取多糖時，中藥材細(xì)胞壁易于破碎和多糖溶出，提取效率較高[20]。與傳統(tǒng)的提取技術(shù)相比，超聲波提取技術(shù)具有快速、省時、節(jié)能、高效、環(huán)保等獨(dú)特優(yōu)勢。因其屬低溫操作，更有利于保護(hù)有效成分[41]，故其在中藥有效成份的提取中的使用呈逐漸上升的趨勢。

超聲波提取技術(shù)在HPS的提取和修飾上也有應(yīng)用研究。楊秀艷等[42]以HPS得率與含量為測定綜合指標(biāo)，采用復(fù)合酶聯(lián)合超聲波提取技術(shù)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化篩選最佳提取組合，同時對復(fù)合酶聯(lián)合超聲提取多糖(HPS-MC)的各種組分與熱水浸提多糖(HPS-R)的理化特性及體外抗氧化活性進(jìn)行了對比分析。所得最優(yōu)條件是復(fù)合酶配比1∶1、酶解pH5，超聲功率105 W、時間1 h，多糖得率13.37%～14.65%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.98%～93.92%。相較于HPS-R，HPS-MC的絕對黏度、相對分子質(zhì)量及蛋白質(zhì)含量均降低，但糖醛酸含量增加，HPS-MC 比 HPS-R的抗氧化活性高；故復(fù)合酶聯(lián)合超聲波提取技術(shù)操作簡便、環(huán)保經(jīng)濟(jì)，提取所得HPS具有明顯的抗氧化活性。胡燕等[43]以正交實(shí)驗(yàn)法對HPS的提取工藝進(jìn)行研究。最佳工藝條件是超聲功率128 W，超聲時間0.5 h，溫度80 ℃，料液比1∶30。結(jié)論是此超聲波提取HPS的方法簡單、快捷、高效?？軐幍萚44]分別采用常規(guī)熱水浸提、超聲輔助及微波輔助從紅芪中提取HPS，再進(jìn)行脫蛋白、冷凍干燥等步驟后得到3種方法提取的HPS-H、HPS-C和HPS-M。同時，將3種HPS進(jìn)行了凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)測定和紅外光譜分析，以及清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和還原力測定的體外抗氧化活性試驗(yàn)。結(jié)果表明：重均分子量分別為5.13×105、4.56×105和6.29×105，HPS-M的體外抗氧化活性要明顯高于HPS-C和HPS-H，結(jié)論是HPS提取可首選微波輔助法。劉寶劍等[45]對超聲波-微波聯(lián)合與常規(guī)法提取HPS進(jìn)行了對比研究。所得HPS以苯酚-硫酸比色法測定其含量。結(jié)果表明兩種方法所得多糖含量差別較大，超聲波-微波法與常規(guī)法所得多糖含量分別為8.98%和4.19%。超聲波-微波法提取HPS具有高效、省時，儀器簡單，操作簡便快捷的明顯優(yōu)勢，亦可避免其分解。王新玲等[46]采用超聲輔助提取紅芪根中HPS，其含量以紫外-可見分光光度法測定。結(jié)果表明HPS含量為9.01%。方法操作簡便，靈敏度高，可作為HPS的提取和含量測定方法。

4 現(xiàn)狀和存在的問題

利用超聲波技術(shù)提取紅芪多糖的研究主要集中在：通過超聲波的不同功率、溫度組合以及一定的料液比組合以提高紅芪多糖的提取率、縮短提取時間和節(jié)約能源方面，缺少關(guān)于超聲波提取中超聲波的作用機(jī)理及其對HPS的分子修飾作用等方面的研究；各研究者使用的儀器不統(tǒng)一，實(shí)際工作中，按照文獻(xiàn)描述進(jìn)行操作的結(jié)果重現(xiàn)性較差；超聲波的功率、頻率、溫度及提取液的pH值組合與所提取HPS分子量大小的關(guān)系研究相對較少；缺少用超聲波對鮮紅芪和干燥紅芪中多糖提取的比較研究；較少進(jìn)行不同條件下利用超聲波提取所得HPS的藥理活性的比較研究。

5 應(yīng)用前景與趨勢

超聲波輔助提取是一種重要的提取方法，具有提取率高、用時較短、溫度較低、溶劑消耗較少的優(yōu)勢，且所得多糖抗氧化能力較強(qiáng)。將超聲波技術(shù)應(yīng)用于中藥紅芪中HPS的提取尚處于初期發(fā)展階段，對其作用機(jī)理和分子修飾作用僅有零星的研究，此方面的應(yīng)用研究前景廣闊。與微波輔助及復(fù)合酶等多種技術(shù)聯(lián)用可以使2種或多種技術(shù)優(yōu)勢互補(bǔ)，相得益彰。在提高提取效率的同時對HPS進(jìn)行選擇性的分子修飾，從而提取出用途更加廣泛、藥理活性更高、治療效果更加顯著的紅芪多糖或其復(fù)方藥劑，從而更加充分地發(fā)揮其在惡性腫瘤、阿爾茨海默病等重大疾病治療中的獨(dú)特優(yōu)勢。因此，進(jìn)行超聲波提取與多種技術(shù)聯(lián)合和對分子修飾作用的研究和調(diào)控，以及所得HPS分子量大小及藥理活性的對應(yīng)關(guān)系的研究，將是超聲波技術(shù)在中藥紅芪HPS提取中應(yīng)用的重要研究方向。同時，研究各頻段、不同功率組合的超聲波與提取效率、分子修飾作用、所得HPS分子量大小及藥理活性的對應(yīng)關(guān)系，研制提取特定成分的標(biāo)準(zhǔn)超聲波提取儀器等，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。