,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 3.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

雜環(huán)胺(HAs)是一系列含有至少一個雜環(huán)的化合物,由碳、氫及氮原子組成,它們是在烹調(diào)富含蛋白質(zhì)的食物如紅肉、家禽和魚類時產(chǎn)生的強(qiáng)致突變物和致癌物[1-2]。影響肉制品中雜環(huán)胺的形成有物理因素和化學(xué)因素,其中物理因素包括肉與肉制品的類型、加熱溫度和時間、加熱方式等;化學(xué)因素包括pH、多糖、氨基酸和肌酸酐、脂肪、脂肪氧化及抗氧化物作用[3-6]。動物實(shí)驗(yàn)研究表明,HAs 能誘導(dǎo)嚙齒類和靈長類動物的多種器官產(chǎn)生腫瘤,并能引起哺乳動物的基因突變、染色體畸變和姐妹染色體互換[7],長期食用含有微量HAs的熟食會引起人體器官的嚴(yán)重疾病,最終導(dǎo)致各種類型的癌癥[8-9],因此,HAs的存在與否和危害成為消費(fèi)者和研究人員關(guān)注的主要問題。國際癌癥研究署將2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx),2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹啉(MeIQ)和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)等幾種類型的HAs列為人類的可能致癌物[10]。目前,已經(jīng)在熱處理食品中檢測到了近30種HAs[11]。我國目前尚未建立HAs相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),也缺乏對鹵肉制品中的HAs含量測定方法研究。為了評價HAs對人類健康的潛在威脅,研究建立檢測食品中雜環(huán)胺的方法很有必要。文獻(xiàn)報(bào)道檢測HAs的方法主要有高效液相(紫外、熒光)檢測法[12-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-18],分析HAs的前處理方法主要有液-液萃取[19]、固相萃取[20-21]。由于雜環(huán)胺是富含蛋白質(zhì)的食品在加工過程中產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì),屬于痕量物質(zhì),因此,對樣品預(yù)處理和檢測器的靈敏度要求很高,高效液相色譜法(紫外檢測器)難以準(zhǔn)確地定性和定量,而熒光檢測器雖然靈敏度較高,但僅能測定可產(chǎn)生熒光信號的雜環(huán)胺,具有一定的局限性。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度較高,是目前測定痕量物質(zhì)的優(yōu)選方法。本文旨在建立鹵肉制品中5種雜環(huán)胺的預(yù)處理方法和LC-MS/MS測定方法,為評定雜環(huán)胺對人類健康的潛在威脅提供基礎(chǔ)保障,為加強(qiáng)食品安全督查提供科學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對照品:MeIQ(2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉,2-amino-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoline,CAS No. 77094-11-2)、MeIQx(2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉,2-amino-3,8-dimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoxaline,CAS No. 77500-04-0)、4,8-DiMeIQx(2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉,2-amino-3,4,8-trimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoxaline,CAS No. 95896-78-9)、7,8-DiMeIQx(2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉,2-amino-3,7,8-trimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoxaline,CAS No. 92180-79-5)、PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]-吡啶,2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]-pyridine,CAS No. 105650-23-5) 純度均≥98%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;樣品采集 在蘭州市超市、個人攤點(diǎn)和專賣店隨機(jī)購買9種新鮮的鹵肉制品(雞肉制品:A、B、C、D、E;豬肉制品:F、G、H、I),剔除筋膜和骨頭、攪碎,每個樣品重復(fù)采樣3次;乙腈、甲酸和甲醇 色譜純,德國Merck公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

LC-MS/MSAgilent 1290 series液相色譜儀,配有G1322A脫氣系統(tǒng)、G1312B SL二元泵、G1357D高精確度自動進(jìn)樣器(HiP ALS SL+),Agilent 6460四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI,G1948B) Agilent Technologies;AB104-N電子天平 Mettler Toledo公司;RE-52 C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州市亞榮儀器有限公司;SUPRA 22K高速離心機(jī) Hanil 公司;KH3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) Millipore公司;固相萃取小柱聚苯乙烯二乙烯苯萃取柱(Poly-Sery PSD,3 mL,500 mg)、Waters Oasis HLB萃取柱(6 mL,500 mg)、Waters Oasis MCX萃取柱(6 mL,500 mg)、Waters C18(3 mL,500 mg) 上海玉博生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 分別稱取5種對照品5 mg(精確到0.01 mg),用甲醇溶解,并定容至25 mL容量瓶中,此貯備液濃度均為200 μg/mL;準(zhǔn)確移取相同體積的各儲備液,用0.0217 mol/L甲酸水溶液-乙腈混合溶液(9∶1,v/v)稀釋成為濃度為10、5、1、0.5、和0.1 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液為空白雞肉和豬肉樣品的提取液。所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色瓶中置于-18 ℃保存。

1.2.2 樣品制備 準(zhǔn)確稱取試樣2 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加10 mL 40 g/L NaOH-甲醇溶液,均質(zhì)1 min,于30 ℃超聲提取10 min后,5000 r/min離心10 min,取上清液,重復(fù)此步驟1次,合并上清液。

固相萃取小柱(Poly-Sery PSD,3 mL,500 mg)依次用2 mL甲醇、3 mL 4 g/L NaOH溶液活化。準(zhǔn)確移取2.5 mL提取液加入固相萃取小柱中,棄去流出液。依次用3 mL 4g/L NaOH-甲醇溶液、2 mL正己烷淋洗,每次淋洗均抽干柱內(nèi)液體,然后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脫3次(2、1、1 mL),洗脫流速小于1 mL/min。洗脫液于35 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,殘?jiān)? mL甲醇渦旋溶解,用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾,待LC-MS/MS測定。

1.2.3 LC-MS/MS分析 液相色譜分離條件:ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,5 μm),柱溫35 ℃,流動相A為0.0217 mol/L甲酸水溶液,流動相B為乙腈,梯度洗脫程序?yàn)?0% A(0～0.5 min)→85% A(0.5～3 min)→80% A(3～3.5 min)→80% A(3.5～6 min)→65% A(6～7 min)→90% A(7～8 min)→90% A(8～9 min),流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細(xì)管電壓+3.2 kV;錐孔電壓+1 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑溫度350 ℃;噴霧氣為氮?dú)?0. 31 MPa);載氣流速10 L/min,溫度350 ℃;鞘氣流速11 L/min,溫度350 ℃;脫溶劑氣流速500 L/h;錐孔反吹氣流速50 L/h;質(zhì)量掃描范圍80～1000 m/z;掃描時間0.05 ms。優(yōu)化后的碎裂電壓、碰撞能量、定性離子和定量離子等參數(shù)見表1。Agilent Mass Hunter工作站(Agilent Technologies,美國)用于控制儀器、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析。

表1 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters optimized of mass spectrometry

1.2.4 方法驗(yàn)證 本研究在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證。在空白雞肉和豬肉提取液中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,經(jīng)LC-MS/MS 測定,以峰面積為縱坐標(biāo)y,以添加濃度為橫坐標(biāo)x建立HAs的線性回歸方程,并以信噪比(S/N)分別為3和10確定方法的定性限(LOD)和定量限(LOQ)?；|(zhì)匹配溶液中的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為:10、5、1、0.5、和0.1 μg/L。方法的準(zhǔn)確度和精密度通過測定日內(nèi)和日間加標(biāo)回收率評價,加標(biāo)濃度為0.5、1和5 μg/kg。日內(nèi)分析時,每個濃度水平重復(fù)測定6次;日間分析時,每個濃度水平重復(fù)測定3次,連續(xù)測定3 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析與圖表均采用Microsoft Excel(2013)軟件完成,雜環(huán)胺含量用平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備

2.1.1 提取溶劑選擇 食品組成成分復(fù)雜,且HAs在食品中的含量很低,有效的樣品制備方法是準(zhǔn)確測定物質(zhì)含量的前提。本文參照文獻(xiàn)方法[11,14-15],并稍作修改,對比了乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙酸乙酯-氨水混合溶液(98∶2,v/v)、乙酸乙酯與正己烷混合溶液(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,v/v,均添加1%氨水)、4 g/L NaOH-甲醇、4 g/L NaOH-乙腈11種溶液的提取回收率。在空白雞肉樣品中(n=6)添加各目標(biāo)化合物1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,PSD固相萃取柱為凈化、富集小柱,依次用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液和2 mL正己烷淋洗,然后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脫。實(shí)驗(yàn)表明,堿性提取溶液的回收率高于其他溶液的回收率,且4 g/L NaOH-甲醇溶液的提取率最高,可達(dá)76%～120%(圖1)。說明堿性條件有利于雜環(huán)胺化合物從肉中析出,可能是由于這類物質(zhì)含有-NH2,具有一定的堿性。因此,本實(shí)驗(yàn)選用4 g/L NaOH-甲醇溶液作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑選擇Fig.1 Determination of extract solution

注:提取溶劑,1：乙酸乙酯;2:乙腈;3:甲醇;4:乙酸乙酯-氨水(98∶2,v/v);5:乙酸乙酯-正己烷(9∶1,v/v)+1%氨水;6:乙酸乙酯-正己烷(8∶2,v/v)+1%氨水;7:乙酸乙酯-正己烷(7∶3,v/v)+1%氨水;8:乙酸乙酯-正己烷(6∶4,v/v)+1%氨水;9:乙酸乙酯-正己烷(5∶5,v/v)+1%氨水;10:4 g/L NaOH-甲醇,11：4 g/L NaOH-乙腈。

2.1.2 固相萃取柱選擇 有效地去除分析檢測中的干擾物質(zhì),得到完全分離、對稱性好的目標(biāo)化合物的色譜峰,是準(zhǔn)確定性和定量的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)參照王敏等[16]方法,并稍作修改,比較了HLB、C18、MCX和PSD 4種固相萃取柱對5種雜環(huán)胺加標(biāo)提取回收率的影響。在空白雞肉樣品中(n=6)添加各目標(biāo)化合物1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以4 g/L NaOH-甲醇為提取溶液,依次用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液和2 mL正己烷淋洗,然后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脫。研究表明,PSD小柱對5種雜環(huán)胺有很好的保留,經(jīng)過淋洗和洗脫,能很好地純化此5種雜環(huán)胺化合物(圖2)。通過方法準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn),準(zhǔn)確度和精密度偏差均小于10%。因此,本實(shí)驗(yàn)選用PSD固相萃取柱為凈化柱。

圖2 固相萃取柱選擇Fig.2 Determination of solid phase extraction column(SPE)

2.1.3 淋洗和洗脫溶劑選擇 淋洗液和洗脫液是影響凈化效果和回收率的重要因素。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[15-16],并稍作修改,在空白雞肉樣品中(n=6)添加各目標(biāo)化合物1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以4 g/L NaOH-甲醇為提取溶液,PSD固相萃取柱為凈化、富集小柱,比較了先用4 g/L NaOH-甲醇或4 g/L NaOH-乙腈溶液淋洗,再用甲醇、正己烷、甲醇-水溶液(1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,v/v)、乙酸乙酯與正己烷混合溶液(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,v/v,均添加1%氨水)等多種溶液分別淋洗,確定最佳淋洗劑后,以乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,v/v)用作洗脫液的凈化效果和回收率。結(jié)果顯示,弱堿性溶液與有機(jī)試劑結(jié)合用作淋洗液洗脫后的雜質(zhì)較少,先用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗,抽干柱內(nèi)液體,然后用2 mL正己烷淋洗,抽干柱內(nèi)液體,最后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脫3次(2、1、1 mL),凈化效果較好,回收率可達(dá)76%～127%(圖3,圖4,圖5)。原因可能是4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗去除了親水性雜質(zhì),正己烷淋洗去除了疏水性雜質(zhì)。

圖3 淋洗液選擇Fig.3 Determination of clean-up solution

注:先用4 g/L NaOH-乙腈溶液淋洗,然后分別用以下溶液淋洗;1:甲醇;2:正己烷;3:甲醇-水溶液(1∶9,v/v);4:甲醇-水溶液(2∶8,v/v);5:甲醇-水溶液(3∶7,v/v);6:甲醇-水溶液(4∶6,v/v);7:甲醇-水溶液(5∶5,v/v);8:乙酸乙酯-正己烷溶液(9∶1,v/v)+1%氨水;9:乙酸乙酯-正己烷溶液(8∶2,v/v)+1%氨水;10:乙酸乙酯-正己烷溶液(7∶3,v/v)+1%氨水;11:乙酸乙酯-正己烷溶液(6∶4,v/v)+1%氨水;12:乙酸乙酯-正己烷溶液(5∶5,v/v)+1%氨水;洗脫溶劑為乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)。

圖4 淋洗液選擇Fig.4 Determination of clean-up solution

注:先用4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗,然后分別用以下溶液淋洗,1:甲醇;2:正己烷;3:甲醇-水溶液(1∶9,v/v);4:甲醇-水溶液(2∶8,v/v);5:甲醇-水溶液(3∶7,v/v);6:甲醇-水溶液(4∶6,v/v);7:甲醇-水溶液(5∶5,v/v);8:乙酸乙酯-正己烷溶液(9∶1,v/v)+1%氨水;9:乙酸乙酯-正己烷溶液(8∶2,v/v)+1%氨水;10:乙酸乙酯-正己烷溶液(7∶3,v/v)+1%氨水;11:乙酸乙酯-正己烷溶液(6∶4,v/v)+1%氨水;12:乙酸乙酯-正己烷溶液(5∶5,v/v)+1%氨水;洗脫溶劑為乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)。

圖5 洗脫液選擇Fig.5 Determination of elution solution 注:乙醇-二氯甲烷溶液的體積比分別為9∶1,8∶2,7∶3,6∶4。

2.2 MRM離子選擇

檢測藥物殘留時,歐盟委員會規(guī)定(Commission Decision 2002/657/EC)[22]至少有4個識別點(diǎn)才能對藥物進(jìn)行確證。LC-MS/MS檢測中,母離子和子離子分別可獲得1個和1.5個識別點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中5種雜環(huán)胺均采用一個母離子和2個子離子進(jìn)行測定,因此,均獲得4個識別點(diǎn)。分別采用各目標(biāo)化合物1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在電噴霧正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,得到化合物的分子離子,以分子離子為母離子,對其進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜,將發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的離子碎片,選取其中信號較強(qiáng)、干擾較小的子離子組成監(jiān)測離子對(響應(yīng)最高的子離子作為定量離子,響應(yīng)次高的離子作為定性離子)。5種雜環(huán)胺的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1,MRM色譜圖見圖6。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限 被分析物的色譜峰峰型對稱、沒有干擾因素時,根據(jù)保留時間可以對被分析物進(jìn)行定性,根據(jù) MRM 色譜峰面積定量。本實(shí)驗(yàn)以信噪比(S/N)分別為3和10時測定各化合物的LODs和LOQs。各化合物的LODs在0.01～0.1 μg/kg,LOQs在0.025～0.25 μg/kg。在空白基質(zhì)提取液中添加系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn) LC-MS/MS分析測定,以化合物的定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo),化合物添加濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。5種雜環(huán)胺在添加濃度水平范圍均有良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)在0.9976～0.9997之間(表2)。

表2 5種雜環(huán)胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線、決定系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 The linear equations,decisive coefficients(R2),LODs and LOQs of 5 kinds of HAs

表3 5種雜環(huán)胺化合物的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of recoveries of 5 kinds of HAs

注:a為加標(biāo)回收率%,b為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差%。

圖6 鹵雞肉空白樣品中添加 5種雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of a blank spiked with 5 kinds of standards of HAs 注:A為總離子色譜圖,B1與B2、C1與C2、D1與D2、E1與 E2、F1與F2分別為MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQxE、 7,8-DiMeIQx和PhIP的提取離子色譜圖。

2.3.2 方法的準(zhǔn)確度和精確度 分別在鹵雞肉和鹵豬肉空白樣品中添加 0.5、1和5 μg/kg 3個水平標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,進(jìn)行提取回收實(shí)驗(yàn),以評價方法的準(zhǔn)確度和精密度。日內(nèi)分析時,每個添加濃度水平進(jìn)行6個重復(fù)測定,日間分析時,每個添加濃度水平進(jìn)行3個重復(fù)測定,連續(xù)3 d重復(fù)測定。5種化合物在空白樣品中的平均添加回收率為76.9%～127.7%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%～9.5%,日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～8.7%(表3),日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求,可用于檢測實(shí)際樣品。

2.4 樣品測定

采用上述建立的方法,對從市場購買的9種鹵肉樣品進(jìn)行測定。在D樣品和I樣品中分別檢測出了MeIQ和MeIQx,含量分別為0.16和0.57 μg/kg,其他樣品均未檢測到雜環(huán)胺。李可等[12]認(rèn)為與超市和專售店相比,個人攤點(diǎn)肉制品中HAs的含量相對較高,且醬鹵雞腿、醬鹵燒雞和叫花雞皮中 HAs 的含量分別是雞肉(不帶皮)HAs 含量的2.8、1.5和1.5倍。邵斌等[19,23]研究發(fā)現(xiàn)牛肉干中HAs總含量為16.65～60.38 ng/g;燒雞雞皮中PhIP含量為7.04 ng/g。潘晗等[24]調(diào)查研究了國內(nèi)不同地區(qū)肉制品中的9種雜環(huán)胺含量,結(jié)果表明華東地區(qū)和西北地區(qū)的肉制品中總HAs含量顯著高于其他地區(qū)。由此可見,富含蛋白質(zhì)的肉類在烹調(diào)過程中產(chǎn)生了危害人們健康的雜環(huán)胺,雖然其含量處于ng級,但是危險性不容忽視。

3 結(jié)論

以鹵肉制品為檢測對象,建立了LC-MS/MS快速檢測MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx和PhIP 5種雜環(huán)胺的方法?；厥章屎拖鄬?biāo)準(zhǔn)偏差均符合國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。GB 5009 243-2016方法中此5種雜環(huán)胺的檢出限為0.1～0.3 μg/kg,定量限為0.5～1.0 μg/kg[25]。本實(shí)驗(yàn)測定方法在信噪比(S/N)分別為3和10時各藥物的LODs在0.01～0.1 μg/kg,LOQs 在0.025～0.25 μg/kg,精密度好,較國標(biāo)方法靈敏度更高,能滿足微量有害物質(zhì)的檢測需求。