杜 霞,周少潼,李春美

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

桑葚和樹莓均屬于聚合型漿果,果實(shí)柔軟多汁,口感酸甜[1],營(yíng)養(yǎng)豐富,富含礦物質(zhì)及多酚類物質(zhì)[2]。成熟桑葚的總花色苷含量可高達(dá)185 mg/100 g[3],而樹莓中的花色苷含量在400～1230 μg/g之間[4],是制備花色苷的良好原料。研究表明:花色苷可以有效降低冠狀動(dòng)脈硬化、心臟病等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]。此外,花色苷還具有抗氧化[6]、抗炎癥[7]、調(diào)節(jié)血脂、降血糖[8-9]等多種健康效應(yīng)。隨著對(duì)花色苷研究的進(jìn)一步深入,對(duì)高純度的花色苷制品需求也越來越大,然而目前市售的花色苷標(biāo)準(zhǔn)品種類單一[10],價(jià)格昂貴。因此,建立高效快速制備高純度花色苷的方法顯得尤為重要。

花色苷的分離純化多采用高速逆流色譜[11]、凝膠色譜[12-14]、半制備高效液相色譜[15]等方法,這些方法多存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、效率低、成本高、制備量小等問題,使在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量高純度花色苷單體成為難題。中壓快速分離系統(tǒng)具有單次上樣量大、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、效率高、經(jīng)濟(jì)效率高等優(yōu)點(diǎn)[16-18],被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離和純化。目前通過中壓快速分離系統(tǒng)可從黑豆皮[19]和黑米[20]等材料中獲得較高純度的矢車菊素-3-葡萄糖苷,但其它結(jié)構(gòu)的花色苷尚無報(bào)道。本文利用中壓快速分離系統(tǒng)建立了分離桑葚和樹莓中3種不同結(jié)構(gòu)花色苷的方法,并用高效液相色譜和質(zhì)譜對(duì)所得的3種花色苷的純度及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn),旨在為花色苷資源的深入研究和開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓品種為小悟紅 購(gòu)于湖北省孝昌小悟鄉(xiāng)凍藏于-20 ℃?zhèn)溆?桑葚 購(gòu)買于寶桑園健康食品有限公司,凍藏于-20 ℃?zhèn)溆?矢車菊素3-葡萄糖苷 純度≥95%,上海源葉生物科技有限公司;AB-8大孔吸附樹脂 南開大學(xué)化工廠;甲醇、乙醇、甲酸、乙酸乙酯 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃鹽酸、硫酸 分析純,信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠;甲醇、甲酸 色譜級(jí),美國(guó)Fisher公司。

ML204電子天平梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司;SKG榨汁機(jī) 廣東艾詩(shī)凱奇智能科技有限公司;Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)沃特斯公司;高效液相色譜儀 日本島津公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;1100 Series LC/MSD Trap液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)沃特斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚和樹莓花色苷的提取 分別稱取定量的桑葚和樹莓果肉打漿,以1∶2的料液比(v/v)加入95%工業(yè)甲醇(含0.1%的鹽酸),在40 ℃下超聲提取30 min,濾渣再次用同樣的料液比重復(fù)提取3次,合并提取液,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃真空濃縮除去甲醇至無醇味。將上述濃縮液經(jīng)布氏漏斗抽濾后,pH調(diào)至1～2,上樣至裝填有AB-8大孔樹脂填料的層析柱,吸附60 min后,用體積分?jǐn)?shù)為0.1%鹽酸去離子水溶液除去糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),待硫酸-苯酚法[21]檢測(cè)洗脫液無色,再用pH為2.5的60%乙醇(含0.1%鹽酸)洗脫花色苷,收集洗脫液,再次減壓濃縮至無醇味。將經(jīng)過AB-8大孔樹脂除雜后的兩份濃縮液用等體積的乙酸乙酯萃取三次,去除黃酮類等物質(zhì),合并水相,真空濃縮后凍干得到桑葚和樹莓兩種花色苷粗提物凍藏于-20 ℃?zhèn)溆肹22]。

1.2.2 桑葚和樹莓花色苷粗提物高效液相檢測(cè)分析

1.2.2.1 矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)品的分析 方法參考李夢(mèng)麗[22]并做少許改動(dòng),取定量矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)品用甲醇溶液(含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%HCl)溶解,配制成一定濃度的矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)液,再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾到棕色液相小瓶用于液相分析。采用Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速1 mL/min,流動(dòng)相A:5%甲酸水,流動(dòng)相B:甲醇,梯度洗脫條件:0～10 min,5%～20% B;10～15 min,20%～20% B;15～30 min,20%～25% B;30～35 min,25%～25% B;35～40 min,25%～33% B;40～42 min,33%～5% B;42～47 min,5%～5% B;進(jìn)樣量10 μL;PAD檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm。矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1、2、4、8 μL,每個(gè)體積重復(fù)3次,計(jì)算出平均峰面積。以質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2000000x-37973(R2=1)。

1.2.2.2 桑葚和樹莓花色苷含量檢測(cè) 將桑葚和樹莓花色苷粗提物分別取定量用甲醇溶液(含有體積分?jǐn)?shù)為0.1% HCl)溶解,取1 mL溶解液用0.45 μm濾膜過濾轉(zhuǎn)移至棕色的液相小瓶?jī)?nèi)用于液相分析,液相條件同1.2.2.1,檢測(cè)波長(zhǎng)為280和520 nm,得到峰面積代入1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行定量計(jì)算。

1.2.3 中壓快速分離系統(tǒng)分離桑葚及樹莓花色苷條件的優(yōu)化 分別取300 mg兩種花色苷粗提物用2 mL分析純甲醇超聲溶解,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用,A相為一定濃度的甲酸水，B相為有機(jī)相，梯度洗脫條件為:0～2 min,20% B;2～22 min,20%～30% B;22～32 min,30%～40% B,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,flash C18(80 g,20～35 μm,100 A)制備柱,兩支串聯(lián),切峰收集到每根試管中,每根試管收集體積為10 mL。

根據(jù)以往研究數(shù)據(jù)[23],分別考察了有機(jī)酸濃度、有機(jī)相種類以及流速的大小對(duì)中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的影響。

1.2.3.1 有機(jī)酸濃度 研究表明在酸性條件下花色苷較為穩(wěn)定,甲酸的加入可有效的減少拖尾的情況并能很好地改善分離效果[24],控制流速30 mL/min,B相甲醇,分別考察0.5%、2%和5%的不同甲酸濃度的水相體系。

1.2.3.2 有機(jī)相種類 控制流速30 mL/min,A相2%甲酸水,考察以甲醇和乙腈為有機(jī)相分別對(duì)中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的影響。

1.2.3.3 流速的選擇 控制A相2%甲酸水,B相甲醇,考察20、30、40 mL/min 3種流速對(duì)中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的影響[10]。

1.2.4 HPLC-MS對(duì)其結(jié)構(gòu)的鑒定 色譜條件:同1.2.2.1。

質(zhì)譜條件:采用正離子模式;電噴霧電離離子源;掃描粒子范圍:m/z 50～800;霧化器壓力:45 psi;干燥器氣流流速:12 L/min;干燥器溫度:350 ℃[22]。

農(nóng)業(yè)作為我國(guó)第一產(chǎn)業(yè)，主要是指利用植物的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，通過人工培育來獲得產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)中占據(jù)重要位置。農(nóng)村經(jīng)濟(jì)合作組織，又可以稱之為“農(nóng)業(yè)合作社”，主要是指以家庭經(jīng)營(yíng)為主的農(nóng)業(yè)小生產(chǎn)者聯(lián)合組成的組織形式，力求維護(hù)和改善各自的生產(chǎn)及生活條件，具有服務(wù)性、盈利性、民主性以及雙層次性等諸多特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)發(fā)展中起到重要作用?；诖?，本文就農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展對(duì)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)合作組織的要求進(jìn)行闡述，并提出推進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效對(duì)策。

1.2.5 樣品的純度檢測(cè) 純度的計(jì)算公式為:

純度(%)=峰面積帶入標(biāo)曲算出的質(zhì)量濃度(mg/mL)/進(jìn)樣前目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度(mg/mL)×100

經(jīng)中壓快速分離系統(tǒng)純化得到的桑葚的1峰和2峰及樹莓的1峰和2峰四份凍干樣品分別取定量用甲醇溶液(含有體積分?jǐn)?shù)為0.1% HCl)溶解,取1 mL溶解液用0.45 μm濾膜過濾轉(zhuǎn)移至棕色的液相小瓶?jī)?nèi)用于液相分析,得到峰面積代入1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行定量分析。液相條件同1.2.2.1。

圖1 桑葚及樹莓花色苷粗提物高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of crude extracts of mulberry and raspberry anthocyanins 注:A、C:桑葚花色苷粗提物;B、D:樹莓花色苷粗提物。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚和樹莓粗提物的花色苷含量檢測(cè)

高效液相檢測(cè)桑葚和樹莓花色苷粗提物結(jié)果如圖1所示,在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下,圖1C和圖1D兩種花色苷粗提物分別有兩個(gè)主要的峰,在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下,圖1B樹莓花色苷粗提物在兩種花色苷主峰前有較多雜質(zhì)峰,以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算桑葚中矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷的含量分別為22%、6%,樹莓中矢車菊素-3-槐糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量為3.9%、4.1%。

2.2 中壓快速分離系統(tǒng)最佳條件的確定

2.2.1 有機(jī)酸濃度的確定 如圖2所示,當(dāng)甲酸濃度為0.5%時(shí),桑葚和樹莓中壓色譜峰拖尾明顯,且分離效果也差于2%和5%的甲酸水相體系。洗脫液中甲酸濃度為2%和5%時(shí)中壓分離圖譜均不存在峰型拖尾現(xiàn)象,且分離效果相近,考慮到經(jīng)濟(jì)環(huán)保問題,最終確定2%的甲酸水為A相。

2.2.3 流速大小的選擇 由圖4可知,當(dāng)流速為20 mL/min時(shí),樣品中目標(biāo)組分在中壓柱上保留性較強(qiáng),洗脫峰寬且響應(yīng)值偏低,每次進(jìn)樣只能得到少量的花色苷單體;而以40 mL/min洗脫時(shí),目標(biāo)峰易于洗脫,峰型集中且較尖銳,但經(jīng)液相檢測(cè)目標(biāo)物與雜質(zhì)未能有效分離,且流速越大,柱壓越高,影響柱子壽命。當(dāng)流速調(diào)整為30 mL/min時(shí),三種花色苷單體與雜質(zhì)的分離度能達(dá)到要求,且柱壓在正常范圍內(nèi)。因此確定最佳流速為30 mL/min。

圖2 不同甲酸濃度時(shí)桑葚和樹莓花色苷粗體物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.2 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different formic acid concentrations

圖3 不同有機(jī)相種類時(shí)桑葚和樹莓花色苷粗體物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.3 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different organic phase species

圖4 不同流速時(shí)桑葚和樹莓花色苷粗體物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.4 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different flow rates at different flow rates

綜上所述,中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷的最佳條件為:A相2%甲酸水,B相甲醇,流速30 mL/min。

2.2.4 最佳洗脫條件的驗(yàn)證 在上述確定的最佳洗脫條件下獲得的桑葚和樹莓的中壓快速分離系統(tǒng)的色譜圖分別如圖5中A、B所示,A圖是桑葚花色苷粗提物中壓圖譜,由圖5A可知,桑葚花色苷粗提物中在280 nm下組分單一,所以對(duì)應(yīng)的中壓圖譜雜質(zhì)峰較少,僅有兩個(gè)主要的色譜峰,B圖為樹莓花色苷粗提物的中壓分離圖譜,由圖5B可知,在280 nm下,樹莓花色苷粗提物組分較復(fù)雜,對(duì)應(yīng)在中壓分離圖譜上主要有4個(gè)峰,前兩個(gè)峰的洗脫液經(jīng)液相檢測(cè)在520 nm并無吸收峰,因此上述接出的洗脫液為非花色苷物質(zhì)可舍棄。分別收集上圖所示的4個(gè)流出峰,4個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間分別為A118～21 min,A223～25 min;B121～25 min,B226～30 min,將所收集的4個(gè)峰洗脫液進(jìn)行減壓濃縮、凍干后進(jìn)行下一步的純度及結(jié)構(gòu)鑒定。

圖5 最優(yōu)條件時(shí)桑葚和樹莓花色苷粗提物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.5 Chromatogram of rapid separation system for crude extracts of mulberry and raspberry anthocyanins under optimal conditions

2.3 所得級(jí)分的HPLC分析及質(zhì)譜結(jié)果鑒定

采用高效液相色譜分析中壓快速分離系統(tǒng)所獲得級(jí)分的色譜圖如圖6所示。圖A為桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰1的液相色譜圖。在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下,譜圖中僅可見保留時(shí)間為22.5 min的色譜峰,無其它雜峰。經(jīng)質(zhì)譜分析,由圖7A可知,桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰1的分子離子峰為m/z 449,碎片離子峰為m/z為287,由分子離子峰m/z 449丟失一分子己糖所致,結(jié)合參考文獻(xiàn)[25]可確定桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰1的花色苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷;經(jīng)中壓快速分離系統(tǒng)純化后,以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品,桑葚中的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量由粗提物中的22%提升至95%,相比于桑葚級(jí)分峰1,所得桑葚級(jí)分峰2譜圖中有少許雜峰,由圖7B可知,桑葚級(jí)分峰2的分子離子峰為m/z 595,碎片離子峰m/z 287,由分子離子峰m/z 595丟失一分子鼠李糖所致,結(jié)合參考文獻(xiàn)[25]可確定桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰2的花色苷為矢車菊素-3-蕓香糖苷;以矢車菊素-3-葡萄糖苷,桑葚中的矢車菊素-3-蕓香糖苷含量由粗提物中的6%提升至41%。比較而言,樹莓花色苷提取物經(jīng)中壓快速分離系統(tǒng)分離后所得兩個(gè)級(jí)分色譜圖均呈現(xiàn)單一、尖銳的峰,說明分離純化效果較好,經(jīng)質(zhì)譜分析,由圖7C可知,樹莓中壓快速分離系統(tǒng)峰1的分子離子峰為m/z 611,碎片離子峰為m/z 287,由分子離子峰m/z 611丟失一分子槐糖所致,結(jié)合參考文獻(xiàn)[25]可確定圖7C中的花色苷為矢車菊素-3-槐糖苷;由圖7D可知,樹莓中壓快速分離系統(tǒng)峰2的分子離子峰為m/z 449,碎片離子峰為m/z 287,結(jié)合參考文獻(xiàn)[25]可確定圖7D中的花色苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷,以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品,樹莓中的矢車菊素-3-槐糖苷含量由粗提物的3.7%增加到60%,矢車菊素-3-葡萄糖苷含量由粗提物的4.1%提升至75%。有文獻(xiàn)表明,花色素B環(huán)的3碳位被雙糖苷取代相較于被單糖苷取代的吸光度會(huì)大幅度下降,且在相同溶劑體系內(nèi),矢車菊素-3-單糖苷的吸光度可比矢車菊素-3-雙糖苷的吸光度高3.8倍[26]。由此可知,桑葚和樹莓花色苷粗提物經(jīng)中壓快速分離系統(tǒng)純化后,矢車菊素-3-蕓香糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷的純度理應(yīng)較41%和60%更高。

圖6 不同級(jí)分的HPLC分析圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of the fractions obtained from the medium pressure rapid separation system

圖7 經(jīng)中壓快速分離系統(tǒng)純化后的桑葚及樹莓的1峰和2峰質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrometry of 1 and 2 peaks of mulberry and raspberry purified by medium pressure rapid separation system 注:A:桑葚1峰;B:桑葚2峰;C:樹莓1峰;D:樹莓2峰。

2.4 與已有其他方法的對(duì)比分析

綜上所述,將現(xiàn)有文獻(xiàn)中花色苷的常用制備技術(shù)在上樣量、制備時(shí)間、一次進(jìn)樣所獲得單個(gè)花色苷量以及純度等參數(shù)與本研究對(duì)比,結(jié)果見表1。高速逆流色譜每次可進(jìn)樣200 mg,單次洗脫就可得到15.0 mg純度為95.5%的花色苷單體,但其耗時(shí)久,且需要多種揮發(fā)性有機(jī)溶劑,如乙醚、石油醚等;半制備高效液相色譜是目前分離純化花色苷粗提物最常用的方法,雖然能在30.0 min的洗脫時(shí)間內(nèi)能得到純度為98.0%的花色苷單體,但每次進(jìn)樣量只有2.00 mg,單次處理量低且對(duì)流動(dòng)相要求為色譜純;葡聚糖凝膠柱層析雖然簡(jiǎn)單易操作,但上樣量小,洗脫時(shí)間長(zhǎng),效率低,所獲得的花色苷純品量少且樣品純度低。

表1 本研究方法與已有方法對(duì)花色苷純化效果的比較Table 1 Comparison of the current method and previous methods of purification of anthocyanins

相比較于以上幾種分離純化方法,中壓快速分離系統(tǒng)具有上樣量大、耗時(shí)短、經(jīng)濟(jì)、易操作等優(yōu)點(diǎn),其不僅分離效率高,在32.0 min的洗脫程序內(nèi),進(jìn)樣量可達(dá)300 mg,一次性可獲得30.0 mg純度為95.0%的矢車菊素-3-葡萄糖苷,可實(shí)現(xiàn)矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)品的大批量制備。

3 結(jié)論

本文以桑葚和樹莓為原料大量制備不同結(jié)構(gòu)的花色苷,確定了中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的條件為流動(dòng)相A為2%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為甲醇,最大進(jìn)樣量300 mg,流速為30 mL/min,梯度洗脫條件為:0～2 min,20% B;2～22 min,20%～30% B;22～32 min,30%～40% B。桑葚花色苷粗提物經(jīng)中壓快速分離系統(tǒng)純化后的兩種花色苷分別是矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷,其中矢車菊素-3-葡萄糖苷由粗提物中的22%提升至純度為95%,矢車菊素-3-蕓香糖苷由粗提物中的6%提升至41%;樹莓純化后的兩種花色苷為矢車菊素-3-槐糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷,分別由粗提物中的3.7%和4.1%提升至純度分別為60%和75%。其中桑葚中的矢車菊素-3-葡萄糖苷的純度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品要求,中壓快速分離系統(tǒng)具有上樣量大、分離速度快、分離效果好等優(yōu)點(diǎn),有望實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)花色苷單體的快速分離與制備。