孫丹雄

云南省第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,昆明650000

γ-干 擾 素 釋 放 試 驗 (interferon-γ release assays,IGRA)通過早期分泌抗原靶 (ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)等特異性抗原 (有些產(chǎn)品還增加了TB7.7抗原多肽),體外刺激機體特異性效應(yīng)T 淋巴細胞,然后檢測γ-干擾素 (interfer on-γ,IFN-γ)水平或計數(shù)分泌IFN-γ的特異性T 淋巴細胞,從而判斷是否存在結(jié)核感染。檢測方法主要有兩種： (1)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IFN-γ水平,商業(yè)產(chǎn)品主要是澳大利亞Cellestis 公司的QFT-GIT (Quanti FERON-TB Gold In-Tube)、QFT-G(QuantiFERON-TB Gold)以及QFT (QuantiFERON-TB)。(2)采用酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測并計數(shù)分泌IFN-γ的特異性T 淋巴細胞,商業(yè)產(chǎn)品主要是英國牛津Immunotech公司生產(chǎn)的T-SPOT.TB。ESAT-6 和CFP-10 主要存在于結(jié)核桿菌復(fù)合群,在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺失,所以IGRA 診斷結(jié)核感染的特異度明顯高于PPD 試驗,但是其不能區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染。有研究顯示,在中、低收入國家以及結(jié)核病高負擔地區(qū)不建議使用IGRA 來診斷活動性結(jié)核病。國內(nèi)進行的一項大規(guī)模、多中心、回顧性研究顯示,IGRA 診斷活動性肺結(jié)核的特異度僅為56.37%,在沒有肺結(jié)核的肺病患者中T-SPOT.TB的陽性率高達43.6%。由此可見,在結(jié)核病高負擔國家,IGRA 的臨床價值更在于利用其陰性結(jié)果并結(jié)合其他臨床表現(xiàn)來進一步排除活動性結(jié)核感染。但諸多研究顯示,很多因素會造成IGRA 假陰性[1-2],臨床上應(yīng)注意綜合分析。本文就IGRA 假陰性的原因及相關(guān)機制作一綜述。

1 患者的全身狀態(tài)

1.1 年齡 大多數(shù)研究均顯示,年齡是IGRA 假陰性的獨立影響因素,特別是對于成年人,隨著年齡的增長,假陰性逐漸增多。歐洲肺結(jié)核網(wǎng)絡(luò)實驗小組進行了一項國際多中心橫斷面回顧性研究 (TBNET 研究)[3],來自25 個研究中心的664例經(jīng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)和/或結(jié)核桿菌特異性核酸檢測確診的活動性結(jié)核病患者納入分析,Logistic回歸分析顯示,年齡是QFT-GIT 假陰性的唯一顯著變量 (OR=1.04,95%CI：1.02～1.07,P<0.01)。其機制可能是隨著年齡增長,ESAT-6或CFP-10引起的IFN-γ濃度逐漸減少,從而出現(xiàn)假陰性。在兒童患者中,年齡與假陰性的關(guān)系不明確。有學者研究發(fā)現(xiàn)年輕兒童的IGRA 假陰性結(jié)果發(fā)生率更高[4],但Velasco-Arnaiz等[5]的研究則顯示對于5歲以下的兒童,年齡與抗原刺激引起的IFN-γ反應(yīng)之間沒有相關(guān)性。

1.2 營養(yǎng)狀態(tài) 有研究顯示,體質(zhì)量指數(shù)過高、過低均與IGRA 假陰性相關(guān)。Matsushita等[6]研究發(fā)現(xiàn)低體質(zhì)量指數(shù)在假陰性QFT-IT 患者中更常見。Hang等[7]研究顯示消瘦 (體質(zhì)量指數(shù)<16.0 kg/m2)與IGRA 假陰性顯著相關(guān)(OR=5.42,95%CI：1.48～19.79)。Pan 等[8]的研究則顯示超重 (體質(zhì)量指數(shù)≥25 kg/m2,OR=2.43,95%CI：1.05～5.63)是假陰性T-SPOT.TB的獨立危險因素。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)低蛋白血癥對IGRA 的檢測結(jié)果沒有影響[9]。營養(yǎng)狀態(tài)與IGRA 假陰性的關(guān)系及相關(guān)機制有待進一步研究。

1.3 等位基因和種族 少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)等位基因和種族與IGRA 假陰性相關(guān)。Hang等[7]對543例新診斷的涂片陽性肺結(jié)核患者進行研究,Logistic回歸分析顯示,患者所攜帶的HLA-DRB1*0701等位基因數(shù)目增加與QFT-GIT 假陰性顯著相關(guān) (OR=5.09,95%CI：2.31～11.22),其機制可能是HLA-DRB1*0701等位基因的遺傳變異性可引起ESAT-6和CFP-10的結(jié)合減少,當抗原較少提呈給T 細胞時,可能會出現(xiàn)免疫反應(yīng)失效,IFN-γ 濃度減少。Matsushita等[6]在后來的研究中也發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0701等位基因在QFT-GIT 假陰性的肺結(jié)核患者中更常見。Nguyen等[10]對1 527例培養(yǎng)確診的結(jié)核病患者進行研究,多變量分析顯示非西班牙裔白人/種族與IGRA (包括QFT-GIT 及T-SPOT.TB)假陰性相關(guān)。

2 基礎(chǔ)疾病與免疫功能

2.1 人類免疫缺陷病毒 (hu man i mmunodeficiency vir us,HIV)感染 諸多研究發(fā)現(xiàn)HIV 感染與IGRA 假陰性密切相關(guān),HIV 陽性患者的敏感度顯著降低。Hang等[7]研究顯示合并HIV感染是IGRA假陰性的獨立危險因素(OR=6.38,95%CI：1.78～22.92)。HIV 患者假陰性結(jié)果增加可能與其低水平的CD4+T 淋巴細胞計數(shù)有關(guān)[11-12]。

2.2 糖尿病 目前,糖尿病與IGRA 假陰性的關(guān)系仍不明確。有學者研究發(fā)現(xiàn)嚴重的糖尿病會導致IGRA 假陰性,空腹血糖水平升高與結(jié)核桿菌特異性IFN-γ 水平呈負相關(guān)[12-13]。但 也 有 研 究 顯 示, 不 管 是 QFT-IT 還 是T-SPOT.TB,糖尿病均與假陰性無關(guān)[14]。國內(nèi)學者Yang等[15]進行的研究也顯示糖尿病不是假陰性T-SPOT.TB檢測結(jié)果的顯著預(yù)測因素。

2.3 惡性腫瘤 惡性腫瘤與IGRA 假陰性的關(guān)系亦不明確。Kwon等[16]進行一項多中心回顧性隊列研究顯示,合并惡性腫瘤與QFT-GIT 假陰性顯著相關(guān) (OR=2.42,95%CI：1.30～4.49)。但國內(nèi)學者Yang等[15]進行的大樣本回顧性研究則顯示,合并惡性腫瘤不是T-SPOT-TB假陰性結(jié)果的顯著預(yù)測因素。

2.4 淋巴細胞 很多研究發(fā)現(xiàn)IGRA 受CD4+T 細胞免疫缺陷的影響[17]。Kwon 等[16]研究發(fā)現(xiàn),QFT-GIT 假陰性結(jié)果與淋巴細胞高度相關(guān) (淋巴細胞總數(shù)<1.0×109/L,OR=1.86,95%CI：1.21～2.87)。但在Syed Aha med Kabeer等[18]的研究中,Logistic回歸分析顯示QFT-G 假陰性與CD4+T 淋巴細胞計數(shù)無關(guān),不過在CD4+計數(shù)<200個/μl的個體中更容易出現(xiàn)不確定結(jié)果。淋巴細胞與IGRA 假陰性的關(guān)系爭議頗多,有待進一步研究,國內(nèi)學者Yang等[15]進行的大樣本研究也顯示,T-SPOT.TB假陰性與CD4+T 淋巴細胞計數(shù)及血淋巴細胞絕對值均無關(guān)系。

2.5 藥物 影響機體免疫功能的藥物可能會導致IGRA 假陰性。Keystone等[19]研究發(fā)現(xiàn),炎癥性疾病 (類風濕關(guān)節(jié)炎、脊柱炎或克羅恩病)患者經(jīng)過14周抗腫瘤壞死因子α治療及CFP-10 刺激后,既往患肺結(jié)核的患者釋放IFN-γ的CD4+T 淋巴細胞減少。Lai等[20]研究發(fā)現(xiàn),類固醇的使用在假陰性IGRA 患者中更常見。

目前,基礎(chǔ)疾病及免疫功能低下與IGRA 假陰性的關(guān)系仍不明確。在TBNET 研究[3]中,免疫功能低下 (至少存在以下一種：HIV 感染,免疫抑制藥物治療,糖尿病,類風濕性關(guān)節(jié)炎,惡性腫瘤和/或?qū)嶓w器官或干細胞移植史)不是假陰性IGRA (包括QFT-GIT 及T-SPOT.TB)的危險因素。

3 炎癥指標

Kwon等[16]研究發(fā)現(xiàn)C-反應(yīng)蛋白是QFT-GIT 假陰性結(jié)果的預(yù)測因素,且QFT-GIT 假陰性和不確定結(jié)果的概率隨著C-反應(yīng)蛋白水平的升高而增加。但Yang等[15]的研究則顯示C-反應(yīng)蛋白、ESR 等均與T-SPOT.TB假陰性無關(guān)。炎癥指標在IGRA 假陰性中的預(yù)測價值有待商榷。

4 結(jié)核病情

4.1 病程 結(jié)核病的病程與IGRA 假陰性可能有關(guān)。Pan等[8]對肺結(jié)核進行研究,多變量分析顯示,患者住院前的較長病程 (>6個月,OR=2.46,95%CI：1.24～4.92)是假陰性T-SPOT.TB的獨立危險因素。

4.2 痰菌情況 痰菌陰性的患者可能更容易出現(xiàn)IGRA 假陰性。國內(nèi)學者Yang等[15]對4 964例患者 (2 425例活動性結(jié)核病,2 539例非結(jié)核病呼吸道疾病)進行回顧性研究,Logistic回歸分析顯示痰抗酸桿菌涂片陰性 (OR=1.821,95%CI：1.338～2.477)、分枝桿菌培養(yǎng)陰性 (OR=1.379,95%CI：1.043～1.824)與T-SPOT.TB假陰性增加有關(guān),機制不詳。

4.3 合并肺外結(jié)核 國內(nèi)學者Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn),未合并肺外結(jié)核會增加T-SPOT.TB的假陰性 (OR=1.291,95%CI：1.026～1.623)。但Syed Aha med Kabeer等[18]的研究則顯示,與肺結(jié)核相比,肺外結(jié)核患者QFT-G 的敏感度并不遜色。TBNET 研究[3]也顯示,肺外結(jié)核不是假陰性IGRA 的影響因素。由此可見,肺外結(jié)核并不一定會增加IGRA 假陰性發(fā)生率。

4.4 肺結(jié)核病變范圍 肺結(jié)核的病變范圍與IGRA 假陰性可能有一定關(guān)系。Kwon等[16]進行一項多中心回顧性隊列研究,1 264例培養(yǎng)確診的成年結(jié)核病患者納入研究,胸部影像學顯示雙側(cè)病變 (OR=1.75,95%CI：1.13～2.72)與QFT-GIT 假陰性顯著相關(guān)。

4.5 結(jié)核的治療情況 抗結(jié)核治療病情好轉(zhuǎn),部分患者IGRA 結(jié)果會出現(xiàn)轉(zhuǎn)陰的情況。有研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ的定量水平在治療期間逐漸下降,特別是在活動性結(jié)核病中,其機制不詳,可能與抗原負荷減少有關(guān)[21]。Lee等[22]對59例免疫功能正常的新診斷為活動性結(jié)核病的士兵進行研究,抗結(jié)核治療前以及治療后的第1、3、6個月QFT-GIT 的陽性率分別為96.6%、89.8%、71.2%、66.1%,IFN-γ 水平則分別為 (5.31±5.34)、 (3.95±4.30)、 (1.82±2.14)、(1.50±2.12)IU/ml,均隨著治療時間的延長而逐漸降低。Par k等[23]研究發(fā)現(xiàn),抗結(jié)核治療后T-SPOT.TB定量分析結(jié)果顯著下降?？菇Y(jié)核治療與IGRA 結(jié)果的關(guān)系比較復(fù)雜,具體的影響情況尚不清楚,目前爭議較多。有學者報道,兒童患者在治療的第1個月中表現(xiàn)為對ESAT-6的反應(yīng)增加,隨后對ESAT-6 和CFP-10 的反應(yīng)逐漸減少[24]。在Matsushita等[6]的研究中,19例QFT-IT 陰性的肺結(jié)核患者 (涂片陽性或經(jīng)培養(yǎng)證實)中有8例在抗結(jié)核治療后 (第2個月或第7個月)反而轉(zhuǎn)為陽性。TBNET 研究[3]則顯示,抗結(jié)核治療不是假陰性IGRA 試驗結(jié)果的危險因素。國內(nèi)也有研究顯示,結(jié)核化療不是導致治療前后IFN-γ水平變化的主要原因[25]。

5 檢測方法及影響因素

5.1 檢測方法 檢測方法與IGRA 假陰性可能也有一定關(guān)系,但爭議頗多。Lai等[20]等研究發(fā)現(xiàn),與T-SPOT.TB相比,QFT-GIT 更容易導致假陰性和不確定結(jié)果,尤其是在免疫功能低下的患者中 (惡性腫瘤、糖尿病和使用類固醇等)。在TBNET 研究[3]中,年齡是QFT-GIT 假陰性的唯一顯著變量,但不是T-SPOT.TB假陰性的預(yù)測因子,其機制可能是隨著年齡增長,ESAT-6或CFP-10引起的IFN-γ濃度逐漸減少,T-SPOT.TB需要特定數(shù)量的外周血單核細胞,即使較少量的IFN-γ也可檢測到,但QFT-GIT 使用全血而沒有任何單核細胞數(shù)量的標準化,年齡增長引起的IFN-γ濃度減少導致了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。Nguyen等[10]的研究則相反,T-SPOT.TB檢測與IGRA 假陰性相關(guān) (校正OR=1.58,95%CI：1.12～2.24)。另外,Wang 等[26]研究則顯示,對于活動性結(jié)核病的診斷,IGRA-ELISA 與T-SPOT.TB在敏感度方面并無差異。

5.2 檢測影響因素 IFN-γ的釋放受多種因素的影響。有學者通過酶聯(lián)免疫斑點法檢測到IFN-γ可能存在自發(fā)釋放現(xiàn)象,導致檢測結(jié)果不可避免的出現(xiàn)各種偏差[27]。Tebr uegge等[28]對英國倫敦一家大型診斷服務(wù)提供商進行的31 932次QFT-GIT 結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn),不確定結(jié)果的比例在秋季 (8.2%)顯著高于春季 (6.2%,P<0.000 1)、夏季 (4.8%,P<0.000 1)和冬季 (6.2%,P<0.000 1),提示季節(jié)引起的宿主和環(huán)境因素也有可能影響檢測結(jié)果。

6 吸煙

Altet等[29]對175例活動性肺結(jié)核患者和350例來自接觸者追蹤研究的患者進行研究,Logistic回歸分析顯示吸煙是IGRA 假陰性的主要因素 (校正OR=3.35,95%CI：1.47～7.61,P<0.05),非吸煙者的IFN-γ應(yīng)答明顯高于吸煙者,吸煙可直接引起IFN-γ 反應(yīng)減弱,且吸煙量和IFN-γ反應(yīng)呈劑量依賴性。但TBNET 研究[3]中,吸煙不是假陰性IGRA 試驗結(jié)果的危險因素。吸煙與IGRA 的關(guān)系有待更多的研究證實。

IGRA 存在著不可避免的假陰性結(jié)果,因為其臨界值是在與健康對照的研究中人為劃定的最佳臨界值,而診斷活動性結(jié)核的定量界值則是在與未合并活動性結(jié)核的患者的對照研究中根據(jù)最大約登指數(shù)計算出來的,倘若為減少假陰性而升高敏感度,則不可避免地造成特異度下降[30]。IGRA 通過檢測IFN-γ水平判斷結(jié)核感染,但人體免疫系統(tǒng)極其復(fù)雜,任何影響免疫功能的因素都可能或多或少的影響到IFN-γ的釋放,由此推測IGRA 的影響因素眾多,每個因素的影響程度大小各異,這就造成了在不同的研究中,研究對象很難同質(zhì)化,研究結(jié)果也不盡相同甚至相反。另外,IGRA 的操作過程復(fù)雜,對操作者的要求較高,檢測過程中任何不規(guī)范行為以及標本采集過程中存在任何差錯,均可能導致結(jié)果不準確。

綜上所述,年齡增長、HIV 感染、抗結(jié)核治療等可導致IGRA 假陰性。另外,患者的營養(yǎng)狀態(tài) (體質(zhì)量指數(shù))、等位基因及種族等亦可能導致IGRA 假陰性,合并糖尿病及惡性腫瘤、淋巴細胞下降、結(jié)核的病程、痰菌陰性、合并肺外結(jié)核、肺部病灶范圍較廣、吸煙、檢測方法及環(huán)境、影響免疫功能藥物的使用等均可能造成IGRA 假陰性,但爭議頗多,有待更多的研究進一步證實。在實際臨床工作中,遇到IGRA 陰性結(jié)果不可輕易排除結(jié)核感染,需要考慮到年齡、合并癥、抗結(jié)核治療、營養(yǎng)狀態(tài)以及免疫功能等各種可能導致假陰性的影響因素,結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)綜合分析。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突