陳曉林 舒磊 馮旰珠

1南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院呼吸內(nèi)科211166;2南京醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院呼吸內(nèi)科210011

由結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結核病是全球十大 “致死性疾病”之一。研究表明,Mtb屬胞內(nèi)寄生菌,其感染、致病及預后等在很大程度上取決于宿主免疫與病原體之間的相互作用的結果[1],巨噬細胞則是該過程中的關鍵免疫效應細胞。Mtb感染肺組織時主要由巨噬細胞攝取,且其致病的關鍵過程均發(fā)生在巨噬細胞內(nèi)環(huán)境中,被活化的巨噬細胞產(chǎn)生活性氧、活性氮中間產(chǎn)物,使之與吞噬體融合,從而發(fā)揮抗菌作用。然而,在長期的演化進程中,Mtb已經(jīng)進化出包括產(chǎn)生毒力因子等在內(nèi)的有效的方法來抵御這些宿主免疫細胞的殺滅效應。

與其他一些細菌病原體產(chǎn)生特定的毒力因子不同,Mtb是通過毒力相關因子和宿主防御反應的復雜免疫過程導致病理損傷,因此對Mtb毒力的深入研究有助于了解涉及結核病發(fā)病的不同階段的相關因子。早在2003年人們通過鑒定194種Mtb基因,首次粗略評估了Mtb毒力因子的全基因組[2]。通過轉座子定點雜交技術對小鼠感染模型研究顯示:有126個基因是Mtb與宿主巨噬細胞作用過程中必需的[3]。新近研究推斷可能有超過400種其他基因在Mtb與宿主巨噬細胞作用過程中是必需的[4]。這些研究結果為Mtb的毒力基因的定義提供了初步框架,其中許多基因是參與Mtb本身編碼基礎代謝的毒力蛋白,但更多單個基因在致病過程中的確切作用尚待研究。目前有關MtbESX/Ⅶ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的分子及細胞膜的幾種類型的復合脂質組分與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關系研究相對較為集中,本文擬就該領域的相關研究進展進行綜述。

1 Ⅶ型分泌系統(tǒng)

致病菌可將毒力因子分泌到胞外或定位于細菌表面存在Ⅰ～Ⅶ型分泌系統(tǒng)。研究表明,Mtb的培養(yǎng)濾液中缺少經(jīng)典的信號蛋白序列,但存在新的蛋白分泌系統(tǒng),該系統(tǒng)被命名為ESX/T7SS分泌系統(tǒng),即Ⅶ型分泌系統(tǒng)。

1.1 ESX-1分泌系統(tǒng)Mtb基因組編碼5種Ⅶ型分泌系統(tǒng)(ESX-1～ESX-5),專門用于跨細胞膜運輸選定的蛋白質底物[5]。編碼分泌機制的核心組分 (ESX保守組分,Ecc)的基因在5個基因座中均為保守,其中ESX-4具有編碼最簡單和最早的Ⅶ型分泌系統(tǒng)的最小基因組。ESX-1被認為是發(fā)病機制中最重要的分泌系統(tǒng)之一。通過對Mtb、卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)、自然減毒株田鼠分枝桿菌的基因組比較研究發(fā)現(xiàn):構建BCG和田鼠分枝桿菌的RD1區(qū)的敲入株,均能編碼分泌蛋白早期分泌抗原靶6 000蛋白(early secretary antigentic target 6kDa protein,ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10,其長期以來均被認為是有效的T細胞抗原。而通過構建MtbH37Rv的RD1缺失突變株也證實了其分泌的抗原ESAT-6和培養(yǎng)濾液蛋白10是Mtb毒力所必需的。

Mtb作為一種胞內(nèi)病原體,當其被巨噬細胞吞噬后,可通過干擾或延遲吞噬體向吞噬溶酶體的分化,或通過控制吞噬體酸化作用,促使吞噬體膜的破裂[6],從而避免了水解酶在宿主酸性環(huán)境下對Mtb的活性氧和活性氮的殺滅作用,該過程被認為是Mtb的免疫逃避策略。吞噬體破裂可反復地與ESX-1相關聯(lián),而MtbESX-1缺陷菌株及BCG都沒有這種作用,即不能引起吞噬體破裂,提示ESX-1在抵抗Mtb宿主巨噬細胞的免疫過程中發(fā)揮了重要作用。利用對細菌表面β-內(nèi)酰胺酶活性敏感的熒光探針和熒光共振能量轉移的研究發(fā)現(xiàn),在感染的后期階段,Mtb可將胞內(nèi)組分轉運到巨噬細胞細胞質中,表明Mtb感染后能與宿主巨噬細胞存在聯(lián)系[6]。最重要的是,由于BCG菌株中的RD1區(qū)缺失,導致吞噬體破裂不能完成,從而導致隨后的免疫逃避信號傳導中斷,限制了疫苗的保護功效。因此,開發(fā)更有效的疫苗株的方法之一是設計具有功能性ESX-1系統(tǒng)的重組BCG菌株。盡管包含有RD1區(qū)域的BCG菌株確實提高了毒力作用,存在安全風險,但作為替代方案,制備具有生物安全水平2級的ESX-1基因座的BCG菌株[7],能提高其在小鼠感染模型中的保護效力,同時與功能性ESX-1系統(tǒng)的重組BCG菌株相比,毒力顯著降低。當用親本BCG菌株時,功能性吞噬體破裂誘導的幾種宿主細胞免疫反應未出現(xiàn)。因為BCG中缺失分泌ESX1抗原的免疫原性,故應當與其他有助于保護性免疫加強的疫苗聯(lián)合使用,例如減毒的Mtb疫苗MTBVAC[8],該疫苗作為活疫苗目前處于臨床研發(fā)階段[9]。

最近的研究發(fā)現(xiàn):Mtb的RD7區(qū)Rv2346c基因編碼的分泌蛋白為ESAT-6家族成員,與其他ESAT-6家族蛋白具有超過90%的同源性[9]。本課題組也發(fā)現(xiàn):Rv2346c通過p38/miRNA/NF-κB信號通路抑制腫瘤壞死因子α和IL-6的產(chǎn)生,從而增強其在巨噬細胞內(nèi)存活[10]。該基因可作為一個毒力因子促進肺組織的炎性損傷,增加小鼠的死亡率,為Mtb疫苗的研究策略提供了一個新思路。

1.2 ESX-5分泌系統(tǒng) 除了ESX-1分泌系統(tǒng)外,ESX-5也與分枝桿菌的致病力有關。ESX-5是最近進化的Ⅶ型分泌系統(tǒng),只存在于生長緩慢的分枝桿菌中。ESX-5分泌系統(tǒng)最初是在海洋分枝桿菌中發(fā)現(xiàn),其主要功能可能是分泌底物,這些底物主要屬于PE和PPE蛋白的獨特家族,分別以其N端Pro-Glu和Pro-Pro-Glu基序命名。這些蛋白家族約占MtbH37Rv基因組的8%,根據(jù)其C末端序列中存在的基序,進一步分為不同的亞組。PE的形成基于多拷貝的富含GC重復序列 (PE_PGRS),PPE的形成基于多態(tài)性串聯(lián)重復序列 (PPE-MPTR),它們僅存在于致病物種中[11]。對Mtb的不同ESX-5突變體的研究顯示:ESX-5系統(tǒng)的失活導致PPE蛋白輸出缺陷、細胞壁完整性受損和強衰減[12]以及PE_PGRS輸出的缺陷[13]。此外,ESX-5區(qū)域中編碼PPE/PE基因的突變體:如MtbΔppe25-pe19顯示衰減,但由于基因組中大量的PE/PPE同源體的表達,通過交叉反應性,仍能誘導強烈的CD4+T細胞免疫反應[14]。雖然Δppe25-pe19構建體衰減的分子機制目前尚不清楚,但對某些PE和PPE蛋白輸出的干擾也與所選Mtb菌株的毒力增加有關。

通過對已經(jīng)突變或丟失基因ppe38Mtb菌株的研究發(fā)現(xiàn):PPE38是ESX-5介導的超過80個PE_PGRS和PPEMPTR底物分泌所必需的。該研究還發(fā)現(xiàn):ppe38基因座通過IS6110介導的重組過程[15],在所謂的 “北京”家族的大多數(shù)Mtb菌株中缺失,因此提出了關于PE_PGRS和PPE-MPTR蛋白的毒力作用及其分泌機制中的重要性[16]。

1.3 ESX-3分泌系統(tǒng)ESX-3除了在鐵和鋅的獲取中扮演重要作用外,研究發(fā)現(xiàn)ESX-3與Mtb毒性也有關[17]。它通過幾種PE/PPE蛋白[18]及其分泌的底物EsxH和EsxG,抑制巨噬細胞和樹突狀細胞激活MtbCD4+T淋巴細胞特異性抗原,進而抑制吞噬體成熟[19]。

2 其他表面暴露因子

幾十年來,分枝桿菌細胞包膜脂質結構的豐富性一直是人們研究的主題,Mtb細胞包膜具有復雜的組織結構,其常規(guī)質膜中包括一層肽聚糖與共價連接的多糖,又稱為阿拉伯半乳聚糖,其五酰氨基末端被霉菌酸酯化。質膜中的這些成分含有60～90個碳原子的α-烷基-β-羥基脂肪酸,是分枝桿菌膜的特征結構,這對于分枝桿菌細胞的存活是必需的[20]。這些菌酸殘基是分枝桿菌外膜內(nèi)部小葉的主要成分,為一種獨特的脂質雙分子層;外部小葉由各種類型的非共價結合脂質組成,如海藻糖單霉菌酸酯、海藻糖二霉菌酸酯 (trehalose dimycolates,TDM)、結核菌醇二菌酸鹽 (phthiocerol dimycocerosates,PDIM)、二乙酰海藻糖、聚乙酰海藻糖及硫脂質等等,其中一些由MmpL家族的分枝桿菌轉運蛋白運輸?shù)酵饽?從而構成藥物開發(fā)的靶標[21]。

2.1 TDM 基于幾十年積累的研究,分枝桿菌表面脂質和糖結合物是進入巨噬細胞、刺激各種受體的重要毒力因子。早在20世紀50年代,TDM已被證明是一種重要的效應分子,也被稱為 “索狀因子”,它被認為是顯微鏡下Mtb呈特征性索狀外觀的唯一因素。通過刺激巨噬細胞誘導的C型凝集素,TDM可導致細胞因子及NO的產(chǎn)生,同時,TDM可能是導致吞噬體延遲成熟的原因之一。TDM存在于所有分枝桿菌屬的細菌的細胞壁,僅有菌酸殘基存在微小的修飾變化。通過構建缺乏所有S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉移酶的Mtb菌株及缺乏含氧功能基團的菌株的實驗研究,菌酸修飾的免疫調(diào)節(jié)作用得到證實[22]。在小鼠感染模型中使用這些菌株的結果顯示出嚴重的減毒和抗原特異性免疫應答的變化,這取決于特定修飾的存在。

2.2 Ham基因Ham基因對于含氧肌球蛋白 (含甲氧基的氧化霉菌酸酯)的合成是必需的。研究表明:氧化型分枝菌酸的形成依賴Ham基因,Ham基因的缺失不僅影響細胞壁的完整性,對特異性抑制IL-12p40介導的反應似乎也很重要。鑒于分枝菌酸生物合成的復雜性,脂肪酸合成酶在蛋白質與蛋白質相互作用中起關鍵作用[23]。Ham基因編碼脂肪酸合成酶系統(tǒng)Ⅱ核心成分的基因突變,如kasB和hadC,均能影響分枝菌酸組成,從而影響各菌株的毒力[24],特別是氧化霉菌酸酯,對于形成泡沫狀巨噬細胞至關重要,其分化感染的巨噬細胞富含脂滴,能夠使細菌持久存在[25]。最近的研究闡明:這些分枝菌酸類的生物合成和代謝可以為研究它們對分枝桿菌的毒力和持久性的影響提供新線索[26]。

2.3 PhoP基因 先前關于硫脂質的毒力作用曾被提出質疑,然而最近研究發(fā)現(xiàn):PhoP基因缺失或低表達菌株影響了硫脂質生物合成,提示硫脂質的產(chǎn)物與PhoP/R雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關聯(lián)[27]。PhoP是雙組分PhoP/R中的一個調(diào)節(jié)基因,PhoP敲除株在小鼠體內(nèi)的毒力作用明顯減弱[28]。MTBVAC是一種敲除phoP和fadD26(Rv2930)的弱毒Mtb候選疫苗,與BCG的安全性和生物分布相同,但保護性更強,是第1個進入臨床評估的結核菌減毒活疫苗[29]。

2.4 PDIM PDIM可作為菌膜的組成部分,是結核桿菌細胞壁的主要脂類成分之一,僅存在于致病性分枝桿菌中,但也有人認為它們與宿主質膜的結合能夠改變其生物物理特性,PDIM通過靶向宿主質膜脂質組織來控制巨噬細胞的侵襲,改變其生物物理特性,從而對吞噬細胞受體及其下游的信號通路起調(diào)控作用[30]。此外,研究表明PDIM對于ESX-1介導的有效吞噬體破裂是必不可少的,其機制尚待闡明[31]。

2.5 聚酮化合物合酶系統(tǒng)(polyketide synthase system,pks)最近研究證實:pks5基因敲除后,會導致細胞壁脂質成分LOS合成完全消失,而將pks5基因互補回突變株,其LOS合成完全恢復。LOS是分枝桿菌重要的脂質成分,對LOS功能的研究還不深入。有研究表明,純化的LOS能夠抑制巨噬細胞腫瘤壞死因子α的分泌,提示LOS可能類似于酚類糖脂,是分枝桿菌的毒力脂質[32]。

2.6 脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)Mtb細胞包膜上的甘露糖化成分,如磷脂酰肌醇甘露糖苷、脂甘露聚糖和LAM,因其在宿主細胞識別中的重要性最近被廣泛研究[33]。在體外,LAM結構的變化對免疫原性的影響引起了很多關注。LAM是Mtb慢生長的分枝桿菌細胞壁表面特有的脂糖,有研究報道,其末端的甘露糖加帽結構是Mtb的關鍵抑制性表位,介導免疫逃逸。它的核心骨架主要由3個結構組成,分別是阿拉伯聚糖和甘露聚糖形成的多糖主鏈、錨定物PIMs和末端帽子結構。致病物種特異性甘露糖帽基序導致的ManLAM主要起免疫逃逸作用,因為細胞質中鈣離子濃度的升高是吞噬體成熟和與溶酶體融合所必需的,ManLAM可以抑制鈣離子濃度的升高,從而抑制吞噬體的成熟和溶酶體融合。另外,不常見的甲硫基-D-木糖基序也證實存在于Mtb中,每分子ManLAM結合一個甘露糖帽,最近發(fā)現(xiàn)的負責其生物合成的遺傳基因座將能夠闡明其生物學作用[34]。牛分枝桿菌BCG和Mtb的突變株產(chǎn)生無帽LAM,而體內(nèi)復制和細胞因子則無變化[35]。這種重要的糖綴合物的生物學功能尚需進行更深入的研究。前人在PIM寡糖、LAM阿拉伯寡糖及LAM類似物的合成,包括立體選擇性地生成β連接的阿拉伯糖苷鍵等方面做了大量的工作,雖然這些工作為更加有效地制備LAM衍生物并將其應用于LAM的生物學研究,包括基于LAM的疫苗研發(fā)等提供了堅實的基礎,但是到目前為止,仍然鮮有結核桿菌寡糖綴合物疫苗的研究報道或取得突破性進展。

2.7 CpnT CpnT是為數(shù)不多的特征性整合蛋白之一,是一種具有N末端外毒素結構域的通道形成蛋白,可導致Mtb誘導感染細胞壞死的能力[36]。CpnT似乎不會誘導大量的細胞因子產(chǎn)生,因此被認為允許“靜息”的細胞免疫逃逸和導致結核桿菌感染的傳播[37]。

2.8 Ag85復合物 幾種獨立于Ⅶ型分泌系統(tǒng)的重要的分泌蛋白也被描述為毒力因子。Ag85由Ag85A、Ag85B和Ag85C 3種組分組成,屬于早期分泌蛋白,由Mtb的TAT分泌系統(tǒng)產(chǎn)生,在BCG中該蛋白復合體基因缺失。Ag85復合物在Mtb的細胞壁中起著非常重要的作用,Ag85復合物具有分枝菌酸轉移酶的活性,可以使海藻糖轉移和沉積在細胞壁上,在Mtb細胞壁合成晚期起重要作用。先前研究認為:這些抗原與疫苗接種有關[38]。但最近研究發(fā)現(xiàn):產(chǎn)生免疫應答的Ag85蛋白表達水平受PhoP/R雙組分調(diào)控系統(tǒng)的影響,使用Ag85作為免疫原不適用于保護所有Mtb菌株,因為可能存在免疫識別的菌株譜系依賴性變異[39]。在MVA85A疫苗與BCG比較的Ⅱb期臨床試驗中顯示MVA85A疫苗無保護作用,認為Ag85A只產(chǎn)生了微弱的T細胞免疫應答。在MTBVAC疫苗中,Ag85B也可高度表達[40],細胞免疫反應強,研究表明Ag85B參與脂質的積累和儲存,是Mtb潛伏期間所必需的一個重要抗原。

3 其他毒力因子

研究發(fā)現(xiàn):Mtb毒力相關的轉錄因子可能參與PE/PPE基因的調(diào)控,主要包括Sigma因子、擬核相關的全局性轉錄因子Lsr2和EspR、雙組分調(diào)控系統(tǒng)MprAB和PhoPR,這些轉錄調(diào)控因子之間可能存在相互作用,它們是直接還是間接參與PE/PPE基因的調(diào)控還有待于進一步研究。

另一個值得注意的例子是蛋白酪氨酸磷酸酶PtpA,它直接與空泡H+-ATPase結合,因此是吞噬體酸化的主要抑制劑之一[41]。然而,如前所述,分枝桿菌對吞噬體酸化和成熟的抑制相當復雜,比如通過SecA2介導的經(jīng)典分泌途徑輸出的特異性蛋白質(SapM、PknG),均會影響含分枝桿菌的吞噬體的酸化和成熟[42]。

最后,強調(diào)一個名為moaA1-D1的基因簇。最近研究發(fā)現(xiàn):由該基因簇編碼的蛋白質可使結核桿菌能夠利用硝酸鹽作為呼吸鏈,從而在嚴重缺氧狀態(tài)中得以存活,這一特征在宿主形成缺氧性肉芽腫顯得特別重要[43]。特異性獲得moaA1-D1簇的分子桿菌已被用作研究Mtb進化的生物模型[44]。

4 展望

總之,進一步研究了解Mtb的相關毒力因子,有助于明確Mtb在促進或限制宿主巨噬細胞感染的具體病理機制,進而影響疾病轉歸。結核病作為與宿主相關的疾病的特殊性以及某些Mtb菌株家族在全球人群中的的特異性,使得結核病的感染過程異常復雜。分子生物學技術的發(fā)展有助于發(fā)現(xiàn)更多的與Mtb致病相關的因子。因此,需要對Mtb病原體繼續(xù)深入研究,以便更好地了解使Mtb成為強大且具有破壞性的病原體的進化適應過程,并尋找新的可能的解決方案,從而為抗結核藥物及新型抗結核疫苗的研發(fā)提供關鍵的靶標。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突