張婉婉，張磊，徐云根，張晶晶

（中國藥科大學藥物化學系，江蘇 南京 211198）

HH（Hedgehog）信號通路以一種高度保守的形式存在于人體中，對于胚胎的發(fā)育、組織修復以及干細胞調(diào)節(jié)至關重要[1]。在成年人體內(nèi)，除了傷口愈合和組織修復期間，HH 配體不表達，HH 通路處于靜止狀態(tài)[1]。當HH 配體高表達時，HH 配體與膜受體Patched1（PTCH1）結(jié)合，解除PTCH1對7 次跨膜蛋白Smoothened（SMO）的抑制作用，激活的SMO 會解除融合抑制蛋白（suppressor of fused，SUFU）對通路下游關鍵轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關癌基因家族鋅指蛋白（glioma-associated oncogene family zinc finger，GLI）的抑制，并將信號轉(zhuǎn)導至GLI，GLI 轉(zhuǎn)位至細胞核中引起靶基因的轉(zhuǎn)錄，HH通路被激活[1]，如圖1 所示[2]。異?；罨腍H 通路被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，例如：基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）、髓母細胞瘤（medulloblastoma，MB）等[1]。因此，靶向HH 通路成為治療腫瘤的一種有效手段。SMO 蛋白是HH通路中最重要的正性調(diào)節(jié)蛋白，與G 蛋白偶聯(lián)受體同源。第一個被發(fā)現(xiàn)的SMO 抑制劑是異甾體類生物堿cyclopamine（1）。自從化合物1 被發(fā)現(xiàn)可以有效阻斷HH 通路的信號轉(zhuǎn)導，進而抑制腫瘤生長后，SMO 抑制劑的研究成為近年來抗癌藥物研發(fā)的熱點之一[3]。

1 已上市和處于臨床階段的Smoothened 抑制劑

2012 年1 月，由羅氏和基因泰克公司共同開發(fā)的vismodegib（GDC-0449，2）獲美國FDA 批準上市，用于轉(zhuǎn)移性BCC 的治療，這也是首個被FDA批準上市的SMO 抑制[4]。2015 年7 月，諾華公司研發(fā)的sonidegib（erismodegib，NVP-LDE225，3）被FDA 批準用于手術或放射治療后復發(fā)的局部晚期BCC 的治療[5]。2018 年11 月，輝瑞公司研發(fā)的glasdegib（PF-04449913，4）被FDA 批準與低劑量阿糖胞苷聯(lián)合使用，用于年齡在75 歲及以上或者由于身體原因不適合進行高強度化療的新診斷急性髓性白血病的治療，這也是首個以急性髓性白血病為適應證的SMO 抑制劑[6]。

此外，還有很多處于臨床階段的SMO 抑制劑，包括處于Ⅲ期臨床的saridegib（IPI-926，5；NCT03703310）、處于Ⅰ/Ⅱ期臨床的taladegib（LY2940680，6；NCT02530437）、處于Ⅱ期臨床的itraconazole（7；NCT04018872，NCT03972748，NCT02749513）等。盡管SMO 抑制劑的研究成果令人欣慰，但是隨著SMO 抑制劑的臨床使用，其耐藥的問題已引起研究者們越來越多的關注，也成為今后HH通路抑制劑開發(fā)中需要克服的一大難題。下面將對SMO 抑制劑的主要耐藥機制進行闡述，并介紹相應的克服耐藥的策略。

圖1 處于抑制和活化狀態(tài)的Hedgehog 通路[2]Figure 1 “Off”and“On” states of Hedgehog pathway[2]

2 Smoothened 抑制劑產(chǎn)生耐藥的機制

化合物2 的臨床研究結(jié)果顯示，雖然部分BCC患者可以達到部分或完全緩解，但超過50%的患者沒有臨床獲益或治療無效，而超過20%早期達到緩解的患者會產(chǎn)生耐藥并出現(xiàn)疾病的惡化或復發(fā)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，對化合物2 產(chǎn)生耐藥的BCC 患者對化合物3 也耐藥[7]。目前發(fā)現(xiàn)SMO 耐藥的機制主要有以下幾種，如圖2 所示[2]。

圖2 Smoothened 抑制劑產(chǎn)生耐藥的機制[2]Figure 2 Drug resistance mechanisms of Smoothened inhibitors[2]

2.1 Smoothened 蛋白特定位點氨基酸的突變

作為一個7 次跨膜蛋白，SMO 蛋白的胞外結(jié)合域和胞外連接域在細胞膜表面形成了一個洞口，使小分子化合物得以進入SMO 的7 次跨膜區(qū)域，化合物1、2、3 等SMO 抑制劑都是結(jié)合于此區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，對SMO 抑制劑產(chǎn)生耐藥的BCC 患者中，有50%出現(xiàn)了SMO 的突變，并保持高水平的HH/GLI 通路活性；SMO 蛋白配體結(jié)合口袋發(fā)生D473G、H231R、W281C、Q477E 和W535L 突變可能會使BCC 細胞對化合物2 的敏感性部分降低，在一定情況下，會導致臨床上BCC 患者產(chǎn)生耐藥；SMO 蛋白遠離配體結(jié)合口袋區(qū)域發(fā)生W535L突變會影響化合物2 與SMO 的結(jié)合，引起耐藥的產(chǎn)生，而此區(qū)域發(fā)生F460L、V321M、L412F 突變在促進腫瘤發(fā)生和獲得性耐藥中具有雙重作用[8]，如圖3A 所示[9]。Sharpe 等[10]發(fā)現(xiàn)，SMO 蛋白發(fā) 生L412F、W535L、S533N、T241M、I408V、A459V、C469Y、V321M、W281C、N219D、D384N、S387N 突變都在一定程度上引起腫瘤對化合物2 的耐藥，如圖3B 所示[9]。Zhao 等[11]發(fā)現(xiàn)，SMO 蛋白D477G、L225R、S391N 的突變也與SMO 抑制劑的耐藥相關，如圖3C 所示[9]。

圖3 Smoothened 蛋白與化合物2 結(jié)合的結(jié)構（PDB：5L7I）[9]Figure 3 The binding structure of Smoothened protein and compound 2 (PDB：5L7I)[9]

2.2 膠質(zhì)瘤相關癌基因家族鋅指蛋白2 的過度表達或融合抑制蛋白表達降低

轉(zhuǎn)錄因子GLI 家族包括GLI1、GLI2 和GLI3，通常認為GLI1 是關鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子；GLI2 既可以充當激活因子，也可以充當抑制因子；GLI3 是弱的激活因子，主要是轉(zhuǎn)錄抑制因子[12]。抑制性蛋白SUFU 位于HH 通路下游，正常情況下抑制GLI 的活性[1]。Sharpe 等[10]研究復發(fā)的BCC 樣本時發(fā)現(xiàn)，包含GLI2基因的2 號染色體含量有所增加，而包含SUFU基因的10 號染色體含量卻有所減少，這種異?？赡苁窃赟MO 下游引起腫瘤對化合物2 耐藥的原因。Zhao 等[11]通過將外源基因整合到SMB 細胞（能致癌并保留SHH 亞型的MB 細胞）的基因組中，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達GLI2 或GLI2△N（N 末端缺失的GLI2 突變體）的SMB 細胞對SMO 抑制劑耐藥，將此類細胞接種到小鼠體內(nèi)依舊顯示出對SMO抑制劑的耐藥；而穩(wěn)定表達GLI1 與GLI3 不會引起耐藥。與對化合物3 敏感（未經(jīng)化合物3 治療）的腫瘤相比，經(jīng)過化合物3 治療后耐藥的SMB 移植腫瘤的SUFU 蛋白水平大大降低，且多數(shù)耐藥腫瘤組織中SUFU基因缺失[11]。此外，SUFU的敲除可以引起MB 細胞對SMO 抑制劑耐藥[11]。Buonamici 等[13]研究SMO 抑制劑耐藥機制時發(fā)現(xiàn)，與對照組（對化合物3 敏感）相比，對化合物3 耐藥的小鼠MB模型中包含GLI2基因的2 號染色體局部出現(xiàn)擴增，GLI2 mRNA 水平升高，GLI1 和GLI3 則未見區(qū)別。

2.3 非經(jīng)典的膠質(zhì)瘤相關癌基因家族鋅指蛋白激活途徑

經(jīng)典的HH 通路需要HH 配體和SMO 蛋白的共同參與來激活GLI，而GLI 轉(zhuǎn)錄因子作為HH 信號通路的末端效應子，也可以通過不依賴HH 配體和SMO 蛋白的其他通路激活，稱為非經(jīng)典的GLI激活途徑，即非經(jīng)典HH 通路[1]。目前非經(jīng)典HH信號轉(zhuǎn)導機制尚未被完全了解，但據(jù)報道，已有多條通路或不同靶點可以通過直接或間接與GLI 作用，激活非經(jīng)典HH 通路。

2.3.1 大鼠肉瘤蛋白/迅速加速纖維肉瘤蛋白/絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路 大鼠肉瘤蛋白/迅速加速纖維肉瘤蛋白/絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（rat sarcoma/rapidly accelerated fibrosarcoma/mitogenactivated extracellular signal-regulated kinase/extracellular regulated protein kinase，RAS/RAF/MEK/ERK）通路涉及許多細胞過程，包括細胞增殖、生長和存活，該通路的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[14]。HH通路與RAS/RAF/MEK/ERK 通路在腫瘤中的相互作用已得到了研究的證實。Riobo 等[15]發(fā)現(xiàn)，RAS/RAF/MEK/ERK 通路對HH 通路有正性調(diào)節(jié)作用：在NIH 3T3 細胞中，RAS/RAF/MEK/ERK 通路的激活會充分激活內(nèi)源性和過表達的GLI 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，HH 通路與RAS/RAF/MEK/ERK 通路同時激活協(xié)同促進細胞增殖。此外，研究發(fā)現(xiàn)RAS/RAF/MEK/ERK 通路的激活會導致SMO 抑制劑產(chǎn)生耐藥。Zhao 等[11]發(fā)現(xiàn)，SMB[ 同時具有Harvery 鼠肉瘤蛋白（Harvery rat sarcoma，HRAS）突變]細胞移植到裸鼠后同樣對SMO 抑制劑耐藥，且耐藥的腫瘤組織中有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）通路激活程度比對照組強；RAS 激活會促進腫瘤轉(zhuǎn)移，在一位罕見MB 患者的轉(zhuǎn)移病灶中發(fā)現(xiàn)高水平的MAPK通路激活，而原發(fā)病灶中只有很低水平的MAPK激活。

另有研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）可以通過RAS/RAF/MEK/ERK 通路調(diào)節(jié)GLI 的活性，與HH 通路協(xié)同促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[16]。

2.3.2 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路在腫瘤細胞生長、代謝、增殖、分化中發(fā)揮重要作用[17]。該通路介導的非經(jīng)典HH/GLI 信號激活在多種腫瘤中影響其體外增殖、克隆形成以及體內(nèi)腫瘤生長。Ju 等[18]利用斑馬魚共表達HH 通路和PI3K/AKT/mTOR 通路發(fā)現(xiàn)，單一表達HH 通路不足以引起腫瘤的發(fā)生，而2 個通路共表達可以引起多種腫瘤的發(fā)生，例如：梭形細胞肉瘤、橫紋肌肉瘤、眼黑色素瘤、星形細胞瘤和黏液瘤。Buonamici 等[13]在化合物3 耐藥的MB 小鼠模型中檢測到PI3K 信號通路的上調(diào)，而對照組（對化合物3 敏感）中并沒有出現(xiàn)PI3K 信號通路的高表達，表明PI3K 通路的代償性上調(diào)可能促進耐藥的產(chǎn)生。

2.3.3 非典型蛋白激酶ι/λ 在哺乳動物中，蛋白激酶（protein kinase C，PKC）有10 種亞型，分為3組，分別稱為典型或傳統(tǒng)的PKC（cPKC）、新型PKC（nPKC）和非典型PKC（aPKC），在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用[19]。Atwood 等[20]在BCC 細胞中發(fā)現(xiàn)，aPKCι/λ 可以增強GLI1 的DNA結(jié)合能力以及轉(zhuǎn)錄活性，同時GLI1 可以促進編碼aPKCι/λ 的基因的轉(zhuǎn)錄，GLI1 與aPKCι/λ 之間可以形成一個正反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。此外，一部分對SMO抑制劑耐藥的BCC 小鼠模型（未發(fā)生SMO 蛋白或SUFU 蛋白突變或GLI2 蛋白的高表達）與對照組相比，aPKC 的表達水平升高，表明aPKC 的高表達可能會導致SMO 抑制劑的耐藥[20]。

3 克服Smoothened 抑制劑耐藥的策略

以上耐藥機制體現(xiàn)了SMO 抑制劑存在的缺陷，并為開發(fā)新型靶向HH 通路抑制劑提供了思路。

3.1 第2 代Smoothened 抑制劑的開發(fā)

對現(xiàn)有SMO 抑制劑耐藥機制的研究發(fā)現(xiàn)，SMO蛋白D473H突變是小分子抑制劑耐藥的關鍵。如果新的SMO 抑制劑與SMO 中473 位的天冬氨酸沒有直接作用，或者結(jié)合位點區(qū)別于已有SMO 抑制劑的結(jié)合位點，則有可能克服耐藥?；衔? 是一個新型的SMO 抑制劑，與已上市的藥物（2、3）不同，化合物6可以有效抑制SMO（D473H）突變[21]。NVP-LEQ506（8）是輝瑞公司研發(fā)的第2 代SMO抑制劑，而且可以有效抑制對化合物2 耐藥的SMO突變的MB 細胞系[22]。TAK-441（9）作為一個高效可口服SMO 抑制劑，對野生型和D473H 突變的SMO 具有相同的親和力，具有克服化合物2 耐藥的潛力[23]。MRT-92（10）是?；翌怱MO 抑制劑，可以與SMO 整個跨膜空腔結(jié)合，且不受SMO D473H 突變影響[24]。近年來，抗真菌藥7 被發(fā)現(xiàn)可以通過靶向SMO 抑制HH 通路活性，且與SMO蛋白的結(jié)合位點區(qū)別于化合物1，對突變SMO 蛋白仍然保持良好的抑制活性[25]。ALLO-1 和ALLO-2（11～12）作為新一代SMO 抑制劑，與SMO 蛋白的結(jié)合位點與已有SMO 抑制劑和激動劑皆不同。Zhou 等[26]通過化合物11 的衍生探針，利用共定位的方法，揭示了化合物11 和12 結(jié)合于SMO 蛋白的底部口袋，是一個新的結(jié)合口袋，其對SMO 的抑制活性不受SMO D473H 突變的影響。

3.2 膠質(zhì)瘤相關癌基因家族鋅指蛋白抑制劑的開發(fā)

無論是經(jīng)典的HH 信號通路，還是非經(jīng)典HH信號通路的信號轉(zhuǎn)導，最終的結(jié)果都是引起轉(zhuǎn)錄因子GLI 的表達，故直接抑制GLI 活性可以有效阻斷HH 通路的信號轉(zhuǎn)導，從而克服SMO 抑制劑的耐藥問題。Lauth 等[27]發(fā)現(xiàn)了最早的GLI 抑制劑GANT58/GANT61（13～14），可以抑制體外腫瘤細胞增殖，其中化合物14 能夠抑制活細胞中GLI1的DNA 結(jié)合能力。HPI1～HPI4（15～18）是另一類GLI 抑制劑，這4 個分子均有獨特的作用機制?；衔?5 和18 會干擾GLI 蛋白的加工和穩(wěn)定，化合物16～18 會干擾GLI 向纖毛的轉(zhuǎn)運[28]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷（ATO）在橫紋肌肉瘤細胞中可以通過與GLI1 直接結(jié)合來抑制HH 通路活性，且ATO 與化合物7 聯(lián)用能夠減少橫紋肌肉瘤干細胞在克隆形成實驗中克隆形成的數(shù)量和成球?qū)嶒炛谐汕虻捏w積[29]。最近，Lospinoso Severini 等[30]報道了一個SMO/GLI 雙靶點化合物（19），該化合物可以通過同時抑制SMO 和GLI 的活性來抑制MB 的生長，并且對野生型和突變型SMO表現(xiàn)出相似的抑制效果。

3.3 基于Smoothened 抑制劑的多藥聯(lián)用

研究發(fā)現(xiàn)，多條通路或靶點可以與HH 通路發(fā)生相互作用，引起SMO 抑制劑耐藥。同時抑制HH通路與其他通路或靶點可以有效克服SMO 抑制劑的耐藥問題，目前不同靶點間藥物聯(lián)用已經(jīng)有多個臨床前或臨床實例。

3.3.1 Smoothened 抑制劑與大鼠肉瘤蛋白/迅速加速纖維肉瘤蛋白/絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路抑制劑聯(lián)用 Zhao 等[11]發(fā)現(xiàn)，在SMO 抑制劑耐藥的MB 細胞中去除致癌性HRAS 或堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），可以恢復對SMO 抑制劑的敏感性。與2 條通路協(xié)同致癌一致，同時抑制2條通路也可以協(xié)同抑制腫瘤的生長。研究發(fā)現(xiàn)，SMO 抑制劑BMS-833923（20）與MEK 抑制劑selumetinib（21）聯(lián)用，不僅能改變胰腺癌小鼠模型腫瘤微環(huán)境的基因表達譜，而且可以阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移，單用SMO 抑制劑則對腫瘤的轉(zhuǎn)移沒有影響；此外，2 種抑制劑的聯(lián)用，還顯著抑制細胞的增殖并減少CD45+細胞（尤其是Ly6G+CD11b+細胞）[31]。與單用化合物1 相比，SMO 抑制劑1 與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑gefitinib（22）的聯(lián)用大大提高了前列腺癌細胞的凋亡率[32]。同樣地，GLI 抑制劑14與EGFR 抑制劑22 聯(lián)用，抑制小鼠BCC 細胞系的增殖和活力的效果比單藥更明顯[33]。SMO 抑制劑4與EGFR 抑制劑單抗cetuximab 聯(lián)用治療復發(fā)性頭頸癌的Ⅰ期臨床試驗已經(jīng)完成（NCT01255800），結(jié)果顯示聯(lián)用有效且耐受性良好[34]。McCleary-Wheeler 等[35]報告了SMO 抑制劑1 和EGFR 抑制劑erlotinib·HCl（23）聯(lián)用治療晚期前列腺癌的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果（NCT00878163）。結(jié)果顯示，雖然化合物1 和23 聯(lián)用耐受性良好，但總體上對患者的病情并沒有顯著影響。他們認為聯(lián)用無效的可能原因主要有3 個：其一，不是所有受試前列腺腫瘤中都伴隨EGFR 通路的激活；其二，EGFR 通路的下游可以繞過EGFR 被其他因素激活，例如作者在文中提到樣本中ERK 和AKT 的表達并沒有明顯變化；其三，晚期前列腺腫瘤的增生程度可能會限制腫瘤暴露于化合物23[35]。

3.3.2 Smoothened 抑制劑與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路抑制劑聯(lián)用 PI3K 抑制劑buparlisib（24）或PI3K/mTOR 雙重抑制劑dactolisib（25）與SMO 抑制劑2 聯(lián)用，可以顯著延遲MB 小鼠模型產(chǎn)生耐藥[18]。此外，化合物24 與2 協(xié)同抑制膠質(zhì)母細胞瘤起始細胞的自我更新能力。與單藥相比，藥物聯(lián)用在抑制腫瘤生長，調(diào)節(jié)干細胞標志物、細胞周期和細胞增殖以及調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面表現(xiàn)優(yōu)異[36]。化合物2 與24 聯(lián)合治療晚期BCC 在2014 年開始進行Ⅱ期臨床試驗（NCT02303041），但是，該臨床試驗已經(jīng)由于不良事件被終止[37]。該試驗結(jié)果顯示，71%的患者疾病穩(wěn)定或有部分響應。SMO 抑制劑2 和mTOR 抑制劑sirolimus（26）聯(lián)用治療轉(zhuǎn)移性或無法手術切除的實體瘤或胰腺癌患者的Ⅰ期臨床試驗于2012 年3 月開始，于2018 年6 月完成（NCT01537107），目前尚未公布試驗結(jié)果。SMO抑制劑2 和mTOR 抑制劑everolimus（27）的聯(lián)用也在2014 年進入了臨床試驗階段，目前正處于Ⅰ期臨床（NCT02138929），用于治療晚期胃食管腺癌。3.3.3 Smoothened 抑制劑與組蛋白脫乙?；敢种苿┞?lián)用 研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylases，HDACs） 抑制劑SAHA（28） 和SMO 抑制劑1 的聯(lián)用，協(xié)同抑制多種消化道腫瘤細胞的生長[38]，SMO/HDAC 雙靶點抑制劑IHRSAHA（29）對SMO L412F 和W535L 表現(xiàn)出明顯抑制活性[39]。

4 總結(jié)與展望

HH 通路在多種惡性腫瘤中的調(diào)節(jié)是一個復雜的過程，其調(diào)節(jié)機制至今尚未完全被人們了解。近年來，通過靶向SMO 從而抑制HH 通路取得了巨大的成功。但是，頻繁且快速產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)狀，迫切需要開發(fā)新一代HH 通路抑制劑。本文闡述了SMO 抑制劑產(chǎn)生耐藥的原因，以及HH 通路與其他通路或靶點之間存在的協(xié)同機制，總結(jié)了克服現(xiàn)有SMO 抑制劑耐藥性的方案，包括第2 代SMO 抑制劑的開發(fā)、SMO 下游轉(zhuǎn)錄因子GLI 抑制劑的開發(fā)以及SMO 抑制劑與其他相關通路（靶點）抑制劑的聯(lián)用。但新一代SMO 抑制劑的開發(fā)難以趕上因突變而產(chǎn)生耐藥的速度；而藥物聯(lián)用也存在藥物間相互作用、藥動學特性不均一以及毒性疊加等問題?；贖H 通路與其他通路或靶點之間存在的協(xié)同機制，開發(fā)SMO 與其他靶點的多重抑制劑，既可以達到協(xié)同增效的目的，又可以避免藥物聯(lián)用產(chǎn)生的一系列負面問題，因此，開發(fā)SMO 與其他靶點的多重抑制劑值得期待。