劉濤 李丹 梁杰 汪秀妹

摘?要?利用DNAzyme及核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）構(gòu)建了熒光生物傳感器用于檢測(cè)鉛離子（Pb2+）。DNAzyme與底物探針結(jié)合并在Pb2+輔助作用下切割底物，使發(fā)夾結(jié)構(gòu)的底物探針在環(huán)上修飾有RNA堿基處斷裂，切割斷裂底物探針后，DNAzyme被釋放，繼續(xù)與下一個(gè)底物探針結(jié)合并切割，利用DNAzyme可循環(huán)反復(fù)催化裂解底物的特性實(shí)現(xiàn)循環(huán)反應(yīng)。底物探針被切割斷裂后，形成的Y字形探針可與信標(biāo)探針結(jié)合并打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，同時(shí)在Exo Ⅲ的作用下降解， 從3′端開始切割水解被打開的信標(biāo)探針， 釋放出底物探針， 繼續(xù)與下一個(gè)信標(biāo)探針結(jié)合切割，形成第二步的循環(huán)信號(hào)放大。經(jīng)過兩步的循環(huán)反應(yīng)， 熒光信號(hào)得到不斷增強(qiáng)，從而達(dá)到高靈敏檢測(cè)的目的。 200 μL反應(yīng)體系在37℃反應(yīng)60 min后，其熒光信號(hào)與Pb2+濃度在0.05～200 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.01 nmol/L。用于實(shí)際樣品中Pb2+的檢測(cè)，加標(biāo)回收率為96.3%～108.3%。本方法具有簡(jiǎn)單、快速、高選擇性、高靈敏的特點(diǎn)，在Pb2+檢測(cè)方面有良好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞?鉛離子; 脫氧核酸酶; 核酸外切酶 Ⅲ; 熒光生物傳感器

1?引 言

鉛離子（Pb2+）作為一種常見重金屬污染物，可通過皮膚、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液，并且可在人體器官和組織中積累，導(dǎo)致神經(jīng)、生殖、心血管系統(tǒng)疾病和發(fā)育障礙，特別是對(duì)于兒童發(fā)育健康影響最大[1～3]?。近年來，隨著我國(guó)新能源汽車產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展及電動(dòng)助力車、電動(dòng)自行車行業(yè)的大量需求，鉛蓄電池產(chǎn)量迅速增長(zhǎng)[4]。鉛蓄電池產(chǎn)量迅速增加的同時(shí)，在鉛蓄電池的生產(chǎn)、使用及廢電池回收等環(huán)節(jié)都有可能產(chǎn)生污染。 因此， 建立簡(jiǎn)單、快速、高靈敏的Pb2+檢測(cè)方法，對(duì)環(huán)境及生物樣品的分析檢測(cè)有重要的意義。

Pb2+的常規(guī)分析方法主要包括電感耦合等離子質(zhì)譜法[5，6]、原子吸收光譜法[7]和原子發(fā)射光譜法[8]、原子熒光光譜法[9，10]、及電化學(xué)法[11]等;這些方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛的特異性、高靈敏檢測(cè)，但多需要昂貴精密的儀器，且操作步驟復(fù)雜，需專業(yè)人員進(jìn)行操作，檢測(cè)成本較高。近年來，生物傳感器的快速發(fā)展為金屬離子檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單、快速、低成本的方法。DNA分子的磷酸根陰離子骨架易與金屬陽(yáng)離子結(jié)合，且具有高穩(wěn)定性、易合成、易修飾、可在體外進(jìn)行序列篩選等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于構(gòu)建金屬離子生物傳感器[12]。Pb2+傳感器的設(shè)計(jì)中常使用G-四鏈體[13，14]及DNAzyme兩種DNA分子。G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基的單鏈DNA片段在特定金屬離子的作用下折疊形成的特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。Pb2+可與G-四鏈體特異性結(jié)合，并維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[16]，基于該性質(zhì)發(fā)展了多種Pb2+傳感器[17，18]。除Pb2+外，K+、Na+、 Sr2+及Ba2+等[12]金屬離子也可與G-四鏈體結(jié)合，并發(fā)揮與Pb2+相似的功能，因此可能對(duì)Pb2+檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

DNAzymes是對(duì)特定底物具有高催化活性的功能核酸，在特定金屬離子的輔助作用下可催化底物鏈斷裂[19]，基于此，建立了各種類型的Pb2+傳感器。Zhang等[20]將8-17DNAzyme及其底物結(jié)合形成一條單鏈并組裝在金電極表面，設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、高靈敏的電化學(xué)檢測(cè)Pb2+的方法;李宸葳等[21]利用GR-5 DNAzyme結(jié)合G-四鏈體，設(shè)計(jì)了一種高靈敏的比色傳感器用于檢測(cè)Pb2+。盡管基于DNAzyme的催化切割反應(yīng)，建立了多種電化學(xué)及比色傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+的靈敏檢測(cè)，但電化學(xué)方法多需對(duì)電極進(jìn)行拋光處理及固定DNA探針的操作，而比色法的反應(yīng)步驟較為繁瑣，多需額外的顯色步驟，對(duì)操作的要求較高，不便于簡(jiǎn)單快速檢測(cè)。熒光法單操作簡(jiǎn)， Zhang等[22]利用DNAzyme結(jié)合分子信標(biāo)及催化放大策略開發(fā)了一系列高靈敏、低背景的金屬離子熒光檢測(cè)方法。核酸工具酶如核酸外切酶、限制性內(nèi)切酶及聚合酶等被廣泛應(yīng)用于DNA傳感器的構(gòu)建[24～28]，常被用于信號(hào)放大，如趙永席等[23]利用DNA限制性內(nèi)切酶建立了一種熒光循環(huán)放大策略， 實(shí)現(xiàn)Pb2+高靈敏檢測(cè)。

本研究利用DNAzyme可循環(huán)反復(fù)催化裂解底物的特性[22]及核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大兩種信號(hào)放大策略，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏、高特異性的熒光DNA生物傳感器，用于檢測(cè)Pb2+。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

CaryEclipse分子熒光光譜儀（美國(guó)瓦里安公司）;DK-S22恒溫水浴鍋（上海精宏公司）;Ultrapure實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰公司）。

所有DNA序列均由上海生工生物有限公司合成，序列見表1;鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液及其它金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心;核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）購(gòu)自NEB公司，其它試劑均為分析純，購(gòu)自阿拉丁試劑公司。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?DNA發(fā)夾探針預(yù)處理?底物探針及信標(biāo)探針用10 mmol/L TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl; 1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，pH= 7.4）溶解，配制成濃度為1 μmol/L的儲(chǔ)存液。將兩種探針溶液在90℃孵育10 min，自然冷卻至室溫，以確保探針形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2.2.2?Pb2+的檢測(cè)?取40 μL信標(biāo)探針、20 μL底物探針及10 μL 8-17DNAzyme于0.5 mL離心管，依次加入20 μL NE緩沖液1（10 mmol/L Bis-Tris-丙烷-HCl，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT， pH=7.0）、16 U Exo Ⅲ、20 μL不同濃度的Pb2+溶液、90 μL緩沖液，于37℃孵育60 min。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定熒光光譜， 激發(fā)波長(zhǎng)494 nm，掃描范圍500～600 nm。

3?結(jié)果與討論

3.1?實(shí)驗(yàn)原理

構(gòu)建的檢測(cè)Pb2的熒光傳感器原理如圖1所示。反應(yīng)過程分為兩步，首先，DNAzyme與底物探針結(jié)合，在Pb2+輔助作用下切割底物，使發(fā)夾結(jié)構(gòu)的底物探針在環(huán)上修飾有RNA堿基處斷裂，發(fā)夾結(jié)構(gòu)破壞后，受到堿基配位個(gè)數(shù)的影響，在反應(yīng)溫度下，DNAzyme與斷裂后的底物不能穩(wěn)定結(jié)合，進(jìn)而被釋放，繼續(xù)與下一個(gè)底物探針結(jié)合，并再次切割，如此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，利用DNAzyme可循環(huán)反復(fù)催化裂解底物的特性實(shí)現(xiàn)第一步的循環(huán)放大。底物探針被切割斷裂后，形成的Y字形探針可與信標(biāo)探針雜交結(jié)合，并打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離， 從而發(fā)出熒光信號(hào)，同時(shí)在Exo Ⅲ的作用下降解， 從3′端開始切割被打開的信標(biāo)探針，釋放出底物探針，繼續(xù)與下一個(gè)信標(biāo)探針結(jié)合切割，形成第二步的循環(huán)信號(hào)放大。經(jīng)過兩步的循環(huán)反應(yīng)， 單個(gè)Pb2+產(chǎn)生的信號(hào)被持續(xù)放大，從而達(dá)到高靈敏檢測(cè)的目的。Pb2+不存在時(shí)， DNAzyme雖可與底物探針結(jié)合，但不能被斷裂，不能引發(fā)第一步反應(yīng);同時(shí)，由于空間位阻及堿基雜交個(gè)數(shù)的影響，游離的底物探針無法與信標(biāo)探針結(jié)合，不能產(chǎn)生熒光信號(hào)。

3.2?方案可行性驗(yàn)證

對(duì)構(gòu)建的外切酶Ⅲ輔助基于DNAzyme的信號(hào)放大策略Pb2+檢測(cè)傳感器的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖2所示，不存在Pb2+的空白對(duì)照組的熒光信號(hào)很低;當(dāng)Pb2+存在時(shí)，與空白背景組相比，熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，且對(duì)不同濃度Pb2+的熒光響應(yīng)值也不同。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的Pb2+傳感體系設(shè)計(jì)方案可行。

3.3?實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

3.3.1?信標(biāo)探針堿基雜交個(gè)數(shù)的優(yōu)化?發(fā)夾結(jié)構(gòu)的信標(biāo)探針中堿基的雜交個(gè)數(shù)對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系熒光信號(hào)的產(chǎn)生有重要影響，因此首先對(duì)信標(biāo)探針序列進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖3。信標(biāo)探針中堿基雜交個(gè)數(shù)過多，會(huì)造成底物形成的Y型探針與之結(jié)合困難，熒光信號(hào)降低;信標(biāo)探針堿基雜交個(gè)數(shù)較少，會(huì)造成整個(gè)體系的背景信號(hào)偏高。由圖3可見，當(dāng)信標(biāo)探針中堿基雜交個(gè)數(shù)為12時(shí)結(jié)果最優(yōu)。

3.3.2?反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化?反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光信號(hào)有重要的影響，反應(yīng)時(shí)間不足，會(huì)造成熒光信號(hào)強(qiáng)度低; 反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)造成背景信號(hào)上升。對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，每間隔10 min測(cè)定樣品組及對(duì)照組的熒光信號(hào)強(qiáng)度。如圖4A所示，60 min前，熒光信號(hào)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng);60 min后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，熒光信號(hào)雖有所增加，但是背景信號(hào)也開始增強(qiáng)。因此，選擇60 min為檢測(cè)體系的反應(yīng)時(shí)間。

3.3.3?反應(yīng)溫度的選擇?反應(yīng)溫度主要對(duì)Exo Ⅲ活性以及DNA探針的結(jié)合有影響，在25℃～40℃范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，如圖4B所示，在25℃～37℃范圍內(nèi)，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨溫度升高而增加，這是由于隨著反應(yīng)溫度升高，外切酶的活性增加;反應(yīng)溫度高于37℃時(shí)，隨溫度升高，熒光信號(hào)顯著下降，原因是高使酶的活性降低，同時(shí)也會(huì)造成DNAzyme與底物探針的結(jié)合能力減弱，使其對(duì)底物的切割效率降低。因此，為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果，反應(yīng)溫度選擇37℃。

3.4?傳感器的特異性分析

分別采用Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+ 及Cr3+等金屬離子考察了傳感器對(duì)Pb2+的選擇性， Pb2+濃度為200 nmol/L，其它金屬離子濃度為10 μmol/L，結(jié)果如圖5A所示。與Pb2+產(chǎn)生的熒光信號(hào)相比，其它金屬離子產(chǎn)生的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)，表明所構(gòu)建的傳感器對(duì)Pb2+具有良好的選擇性。同時(shí)，為進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性，測(cè)定了Pb2+（濃度200 nmol/L）與其它金屬離子（Ca2+、Mg2+、Cd2+、Mn2+，濃度均為10 μmol/L）共存時(shí)傳感器的響應(yīng)，如圖5B所示，其它金屬離子的存在對(duì)Pb2+的檢測(cè)無明顯影響，進(jìn)一步表明構(gòu)建的傳感器有良好的選擇性。

3.5?Pb2+的定量分析

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定了不同Pb2+濃度時(shí)體系的熒光信號(hào)。如圖6所示，Pb2+濃度在0.05～200 nmol/L范圍內(nèi)，其熒光信號(hào)強(qiáng)度和Pb2+濃度呈線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998，檢出限為0.01 nmol/L（S/N=3），遠(yuǎn)低于我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006）中Pb2+限值0.01 mg/L（～50 nmol/L），也低于文獻(xiàn)報(bào)道的Pb2+傳感器[20～23]（表2）。

3.6?實(shí)際水樣分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建的Pb2+傳感器在實(shí)際樣品中的應(yīng)用性能，分別采集自來水與校園內(nèi)湖水，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后， 測(cè)定Pb2+含量，結(jié)果見表3。所采集的樣品未檢出Pb2+，加標(biāo)回收率為96.3%～108.3%之間。

4?結(jié) 論

利用金屬DNAzyme可循環(huán)切割底物的特性及核酸外切酶 Ⅲ不需特定識(shí)別序列對(duì)雙鏈DNA水解的性質(zhì)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了兩步循環(huán)信號(hào)放大的Pb2+生物傳感器， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+的高靈敏檢測(cè)。此傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)，在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

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A Fluorescence Biosensor for Lead Ion Detection

Based on DNAzyme and Exonuclease Ⅲ

LIU Tao*， LI Dan， LIANG Jie， WANG Xiu-Mei

（Fujian Provincial Key Laboratory of Ecology-Toxicological Effects & Control for Emerging Contaminants College of

Environmental and Biological Engineering， Putian University， Putian 351100， China）

Abstract?A fluorescence sensor for Pb2+ detection was developed on the basis of a DNAzyme cleavage and exonuclease Ⅲ assistant amplification strategy. In the presence of Pb2+， the DNAzyme hybridized with substrate strand and catalyzed the hydrolytic cleavage of the substrate strand， and then the DNAzyme released from the substrate strand and bound another substrate strand to trigger another cycle of hydrolytic cleavage. The DNAzymes were used as catalysts for amplified sensing through multiple turnover reactions. The substrate probe was cleavaged and broken to form a Y-shaped probe which could hybridize and open the molecular beacon， resulting in the increase of the fluorescence signal. At the same time， exonuclease Ⅲ catalytically digested the molecular beacon from 3′-end and released the Y-shaped substrate strand. The released Y-shaped substrate strand could directly hybridize with another molecular beacon to generate fluorescence signal， and thus was further recognized and cleaved by exonuclease Ⅲ from the second step of cyclic signal amplification. Accompanying with each cleavage toward molecular probe by exonuclease Ⅲ， the fluorescence signal was accumulated， which resulted in a cyclic amplification format for the fluorescence response toward Pb2+ detection. The fluorescence response was detected in a 200 μL reaction system that was incubated at 37℃ for 60 min. The linear range for detection of Pb2+ was 0.05-200 nmol/L with a detection limit of 0.01 nmol/L， and the recoveries of environmental water samples were 96.3%-108.3%. This method had many advantages such as simple operation， rapid detection， high selectivity and high sensitivity， and showed great application potential in Pb2+ detection.

Keywords?Lead ion ; DNAzyme; Exonuclease Ⅲ; Fluorescence biosensor

（Received 11 August 2019; accepted 10 December 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31801462）， the Scientific Research Foundation of Fujian Provincial Education Department （No. JT180466） and the Scientific Research Foundation of Putian University （No. 2017015）.