徐 鵬 鄒任玲 張冬青

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院,上海 200093)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身性的，以大小關節(jié)病變和關節(jié)滑膜受到炎性細胞浸潤為特征，逐步形成血管翳，最終導致骨和軟骨侵蝕破壞的自身免疫性疾病。其發(fā)病機制可歸結于患者異常免疫學功能及其所關聯(lián)的多種炎癥細胞以及多種炎癥因子介導了特定信號分子通路的過度活化，從而誘導患者關節(jié)病灶破骨細胞的分化，進而造成患者大小關節(jié)損傷和破壞[1,2]。糖蛋白130 (gp130)作為IL-6、IL-11和IL-27等細胞因子共同的受體β亞基，受相關配體啟動激活了JAK/STAT通路，導致患者JAK/STAT相關信號分子和靶點過度活躍及IL-6受體分子也在破骨細胞表面高表達。本文旨在分析gp130相關炎癥因子及介導RA患者破骨細胞增殖分化的可能機制，借以用抗gp130抗體調控gp130分子的異常表達，從而達到用免疫手段協(xié)同臨床干預RA患者疾病進程的可能性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 與上海市長寧區(qū)光華中西醫(yī)結合醫(yī)院合作，隨機選取2014年1月至2017年6月RA患者47例作為實驗組，男性15例，女性32例，年齡為(57±12)歲，病程(5±3)年，符合ACR/EULAR 2010年RA分類標準[3]。對照組選取健康獻血者40例，男女各20例，年齡(45±15)歲，無慢性疾病史和長期用藥史，1周內無急性感染，各關節(jié)功能正常。以上所有標本均滿足血紅蛋白≥100 g/L，白細胞≥3.5×109L-1，血清肌酐、血清膽紅素、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶不大于正常值的1.5倍[4,5]。

1.1.2主要試劑及儀器 IL-6、IL-6Rα、gp130、IL-11、IL-27和MMP-9 ELISA檢測試劑盒，購自上海森雄科技實業(yè)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基，酶標檢測儀購自美國Thermo Fisher公司；流式抗體同型對照及流式細胞儀購自美國BD公司；電泳凝膠轉印成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1血清處理與酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測 室溫凝固血清30 min，3 000 r/min離心15 min，分裝EP管，-80℃冷凍保存，實驗時提前取出30 min解凍。ELISA按照各試劑盒說明書操作，以IL-6為例，加入標準品和待測樣品100 μl，37℃溫育120 min 后洗板4次，加一抗50 μl，37℃溫育60 min后洗板4次，加酶標抗體100 μl，37℃溫育60 min后洗板4次，加底物顯色劑100 μl，避光10 min，加終止液 50 μl，在450 nm處測吸光值。分別檢測正常對照組和RA患者的血清IL-6、IL-6Rα、gp130、IL-11、IL-27和MMP-9表達量。

1.2.2破骨細胞樣細胞(OLC)培養(yǎng) 取研究對象外周全血10 ml，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋2～3倍，輕緩加入Ficoll淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，收集單個核細胞層，再以RPMI1640洗滌2次后，1 500 r/min離心10 min，重懸細胞[4,6]。將對照組和RA患者的PBMC細胞分別在添加20 ng/ml RANKL和M-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，再添加40 ng/ml RANKL一起培養(yǎng)7 d。M-CSF和RANKL每3 d補充一次，直至視野下可見大量纖維狀破骨樣細胞聚集。細胞以4%多聚甲醛固定，分別并進行TRAP 染色[7]和FITC-抗gp130抗體標記。

1.2.3流式細胞術(FACS)檢測gp130陽性細胞 分別將正常對照組和RA患者的PBMC細胞，以及M-CSF/RANKL誘導的OLC細胞稀釋成百萬計數(shù)單位，取100 μl分裝至流式管，各加入FITC-抗gp130抗體2 μl，4℃孵育1 h，PBS洗滌2次，用流式細胞儀進行分析，在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽性的細胞群進行分選。

1.2.4抗gp130 McAb的制備(簡略)與處理 通過BALB/c小鼠腹腔注射混有弗氏完全佐劑的gp130重組蛋白，第2周及4周重復加強免疫2次，第5周沖擊免疫后3 d處死取脾臟研磨，以HAT選擇性培養(yǎng)基混合脾細胞與骨髓瘤細胞，篩選出有效的細胞株經(jīng)擴增純化即為其gp130單克隆抗體[8]。在培養(yǎng)OLC同時單抗干預組再每3 d加50 μg/ml鼠抗人gp130單抗，其余條件不變，進行TRAP染色并進行細胞計數(shù)定量分析結果，同時分別取PBMC和OLC細胞上清用ELISA檢測IL-6和MMP-9表達水平。

1.2.5免疫印跡法(Western blot)檢測STAT3信號 分別將正常對照PBMC、RA患者PBMC及OLC中加入50 μg/ml抗gp130 McAb，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱溫育1 h，再加入10 ng/ml IL-6，37℃溫育20 min 后，PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，收集細胞，提取全蛋白，加β-actin參照，Western blot檢測STAT3及其磷酸化水平。

2 結果

2.1血清IL-6/IL-6Rα/gp130表達檢測 經(jīng)過ELISA檢測顯示，40例對照組IL-6、IL-6Rα、gp130血清水平分別為(18.03±4.77) pg/ml、(48.12±13.67)ng/ml、(249.66±64.99)ng/ml，47例RA患者組分別為(43.51±20.53) pg/ml、(53.26±18.36)ng/ml、(226.65±78.54)ng/ml，兩組IL-6水平比較差異性有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。雖然患者血清IL-6Rα與gp130水平差異性不顯著(P>0.05)，但進一步計算成對標本的IL-6Rα/gp130后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RA患者血清均存在IL-6Rα/gp130異常升高(0.195±0.037)vs(0.240±0.050)，差異性有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。RA患者體內除了IL-6異常升高外，還可能存在IL-6Rα/gp130失衡狀況。

圖1 RA患者IL-6、IL-6Rα、gp130血清水平表達量及其比值Fig.1 Serum IL-6，IL-6Rα，gp130 content and ratio of IL-6Rα/gp130 in RA patientsNote: Compared with the control group,*.P<0.05；compared with the control group，**.P<0.01.

2.2血清IL-11、IL-27和MMP-9表達檢測 經(jīng)ELISA檢測顯示，47例RA患者的IL-11、IL-27和MMP-9 血清水平與40例對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 RA患者IL-11、IL-27和MMP-9的表達量Tab.1 Serum IL-11，IL-27 and MMP-9 content in RA

Note：Compared with control group,1)P<0.05，2)P<0.01.

2.3gp130陽性細胞 用FITC標記的抗gp130抗體FACS檢測表明：正常人外周血PBMC(PBMC-NP)gp130陽性細胞為(1.10±0.38)%，RA患者PBMC gp130陽性細胞已達(15.12±1.97)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)RANKL和M-CSF誘導10 d，正常人OLC具有gp130陽性細胞為(11.74±3.91)%；RA患者具有gp130陽性細胞高達(44.07±5.06)%，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。從上結果揭示RA患者淋巴細胞gp130升高，而破骨細胞表面本身可能含有豐富gp130糖蛋白。

圖2 RANKL和M-CSF誘導后，對照組和RA患者的細胞中gp130的表達Fig.2 gp130 expression in cells from controls and patients with RA after induction with RANKL and M-CSFNote: The percentage of gp130-positive cells was detected.

2.4破骨細胞TRAP染色分析 當加入RANKL和M-CSF共培養(yǎng)3 d后顯微鏡下即可見細胞間隙模糊，互相融合出現(xiàn)多核巨細胞，邊緣不規(guī)則部分出現(xiàn)偽足，再添加RANKL培養(yǎng)7 d后TRAP染色，顯微鏡下可見胞漿酒紅色，細胞核個數(shù)大于3個，定義為TRAP+細胞，進行細胞計數(shù)定量分析，結果顯示與正常對照組比較，RA患者組破骨細胞數(shù)量明顯增多，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。在RANKL刺激破骨細胞同時，加入自制鼠抗人gp130 McAb，誘導分化7 d后，可見RA患者組破骨細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05，圖3)。

圖3 抗gp130 McAb干預破骨細胞的誘導Fig.3 Anti-gp130 McAb interfere with induction of osteoclastsNote: A.Normal-OLC;B.Normal-OLC treatment with anti-gp130 McAb;C.RA-OLC;D.RA-OLC treatment with anti-gp130 McAb;E.The expression of TRAP-positive cells in normal and RA patients 7 days after induction by RANKL and anti-gp130 McAb.*.P<0.05.

表2 RA患者細胞培養(yǎng)上清IL-6和MMP-9表達量Tab.2 IL-6 and MMP-9 content in supernatants of RA patients cell

Note：RA PBMC compared with NC PBMC;RA OLC compared with NC OLC;RA gp130 McAb compared with NC gp130 McAb,1)P<0.05，2)P<0.01.

2.5抗gp130 McAb干預破骨細胞上清的IL-6和MMP-9表達檢測 經(jīng)ELISA分別檢測正常人和RA患者的PBMC，OLC和加入抗gp130 McAb共培養(yǎng)的OLC，結果如表2所示，正常對照組破骨細胞上清的IL-6和MMP-9均顯著低于RA患者組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，加入 抗gp130 McAb干預的RA患者組破骨細胞上清的IL-6和MMP-9均顯著下調，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 抗人gp130單克隆抗體對RA患者細胞分泌IL-6和MMP-9的影響Fig.4 Effect of anti-human gp130 MaAb on IL-6 and MMP-9 secretion by RA cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

2.6Western blot檢測RA PBMC/OLC細胞STAT3的磷酸化 IL-6結合細胞表面IL-6R/gp130可激活JAK/STAT信號通路，刺激細胞內STAT3磷酸化，20 min 即達峰值，以Western blot分別評估正常人及RA患者的PBMC和OLC細胞的抗gp130 McAb調控作用，圖5表明加入抗gp130 McAb能明顯抑制RA患者PBMC和OLC細胞內STAT3磷酸化。

圖5 抗人gp130單克隆抗體對STAT3磷酸化的影響Fig.5 Effect of anti-human gp130 McAb on phosphoryl-ation of STAT3Note: A.Normal-PBMC;B.RA-PBMC;C.RA-OLC.

3 討論

眾所周知，IL-6和IL-11都屬于白介素IL-6家族，其主要分類依據(jù)正是此類細胞因子的受體都共同含有信號傳導受體亞基gp130糖蛋白。IL-6或其家族成員如IL-11與細胞膜表面或可溶性IL-6R/IL-11R的結合啟動了IL-6R與gp130的結合，gp130隨后進行同源二聚體化和信號轉導[9,10]。而IL-27雖然屬于白介素IL-12家族，由p28和EBI3組成，但其傳導途徑同樣需要通過IL-27R與gp130組成異源二聚體[11]。研究表明，炎癥反應往往由細胞因子驅動完成，而體內促炎與抗炎細胞因子的失衡往往正是誘導自身免疫疾病、慢性炎癥疾病以及相關機體組織破壞的罪魁禍首[12]。實驗結果IL-6與IL-11在RA患者血清的高表達提示其可能通過受體傳導信號，參與RA發(fā)病進程。IL-6可誘導B細胞和T細胞增殖和分化，在滑膜病灶處，誘導VEGF分泌可促使滑膜血管新生，誘導RANKL刺激破骨細胞分化侵襲關節(jié)[13]，甚至與BMPs家族水平調節(jié)相關，使破骨細胞與成骨細胞在骨微環(huán)境失衡[14]。IL-11具有與IL-6相似可調節(jié)免疫應答和骨代謝的功能，誘導CRP等合成，且IL-11還可刺激TPO，促進血小板的增殖分化[9]，可能是RA患者往往同時伴有血小板增多癥的主要因素之一。IL-27在RA患者體循環(huán)的高表達揭示了RA患者Th1/Th2的免疫失衡，IL-27體內循環(huán)調節(jié)免疫促Th1分化可上調ICAM-1在FLS表面表達，加強多種趨化因子，過度激活JAK/STAT通路，加重RA患者滑膜炎癥和骨破壞[11,15]。

MMP-9作為金屬基質蛋白酶的代表，參與細胞外基質代謝，作用底物Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原及明膠等，是反映骨吸收與骨重建的重要關鍵酶，可由破骨細胞高表達，在破骨細胞遷移、侵蝕、錨定過程起重要作用[16]。實驗表明的體循環(huán)MMP-9高表達正提示了RA患者體內破骨細胞分化造成骨侵蝕的嚴重程度。且RA患者的IL-6、IL-11、IL-27血清學水平的異常升高，原因可能是其誘導破骨細胞分化，分泌大量金屬基質蛋白酶進入體循環(huán)，表現(xiàn)骨侵蝕的后果。而RA患者單個核細胞上清分泌IL-6的高表達，同樣揭示其可能調控淋巴細胞自分泌的IL-6誘導單核細胞融合形成多核破骨樣細胞，分泌MMP-9參與骨侵蝕。

本研究檢測到的血清可溶性gp130(sgp130)，可能來源于膜結合受體的蛋白分解或選擇性剪接，且sgp130可能是IL-6/sIL-6Rα反式信號途徑天然的拮抗劑，通過競爭結合sIL-6Rα，從而部分抑制IL-6的過度激活。本實驗結果表明：RA患者細胞表面gp130大幅增加，但游離血清中的sgp130有所減少可能就在于招募了IL-6和sIL-6Rα，從而減少了反式信號轉導至細胞的途徑。IL-6雖有誘導破骨細胞分化等功能，但單獨并無法發(fā)揮生物化功能，必須連接其受體IL-6Rα/gp130發(fā)揮作用，實驗結果表明RA患者血清學IL-6Rα/gp130失衡，可導致IL-6/IL-6Rα/gp130過量反式信號傳導，由于體循環(huán)存在過量的gp130相關配體，雖有血清sp130中和，但依然存在大量IL-6/IL-6Rα向膜表面gp130傳導反式途徑，造成JAK/STAT過度活化[17]，由此提示IL-6Rα/gp130可能是RA患者發(fā)病或病情加重的重要因素和潛在診斷手段。

體外實驗通過收集PBMC，并以M-CSF和RANKL誘導后發(fā)現(xiàn)，同樣條件下，RA患者比正常人可生成更多的破骨細胞，存在高表達的IL-6和MMP-9，且RA患者的破骨細胞表面gp130的高表達提示其可能大量招募IL-6/sIL-6Rα，從而激活STAT3，進一步誘導RANKL表達，而RANKL正是誘導破骨細胞前體的分化成熟關鍵，同時通過抗gp130 McAb的干預亦提示破骨細胞表面存在的gp130是其骨侵蝕發(fā)揮作用的重要靶點，阻斷gp130可明顯抑制下游的STAT3的磷酸化，降低細胞分泌IL-6和MMP-9的水平，證明其調控gp130確可影響RA患者的破骨細胞分化。

綜上所述，本實驗的研究表明RA患者中不論是IL-6和IL-11，還是IL-27，均通過多種作用機制參與RA的發(fā)病進程，且其特異性受體均需先與gp130組成同源或異源二聚體才能激活信號傳導，缺乏gp130的粒細胞對IL-6并無應答[18]，gp130是RA發(fā)病機制關鍵信號通路的重要靶點。RA患者細胞表面gp130增多可能激活對應同源/異源二聚體受體，招募更多不僅限IL-6的相應配體誘發(fā)炎癥反應加重病情。gp130和其配體們在RA患者體內循環(huán)系統(tǒng)和局部病灶的失衡是RA發(fā)病機制的關鍵，因此與檢測單一細胞因子相比，監(jiān)測gp130相關受體和配體的動態(tài)水平表達可能為診斷RA病程提供更好的實驗室指標。

再者目前針對IL-6、IL-6R及相關激酶(JAK)等抑制劑抗體藥物已經(jīng)用于臨床[19]，而gp130已被證明高表達于破骨細胞表面，且其受到抑制時可減少破骨細胞分化，表明gp130也將是具有發(fā)展?jié)摿Φ腞A治療靶點。本項目組正在與醫(yī)院研究團隊合作開展應用抗gp130 mab干預RA患者的關節(jié)病灶，期待能為臨床RA病程的調控增添一新的免疫干預方法。