吉紫陽 任云青

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽 032200)

婦科癌癥近年來日益引起人們的關(guān)注，成為一個重要的全球衛(wèi)生保健問題。其中，宮頸癌已經(jīng)成為全球女性第四大常見癌癥[1]，腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移成為宮頸癌患者預(yù)后差的主要原因。研究宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移機制對于提高患者生存率，改善患者預(yù)后情況具有重要意義。

巨噬細胞來源于血液單核巨噬細胞，是重要的免疫效應(yīng)細胞，也是腫瘤浸潤性細胞的主要成分之一。根據(jù)局部組織微環(huán)境中存在的因子不同，巨噬細胞會呈現(xiàn)不同的表型和激活狀態(tài)。近來引起人們關(guān)注的是M2型(替代活化型)巨噬細胞，它主要浸潤于腫瘤免疫微環(huán)境中并包圍著癌巢，也被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumour associated-macrophages，TAMs)[2]。TAMs通過釋放多種細胞因子與腫瘤細胞相互作用進而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。雖然在許多腫瘤中如乳腺癌[4]、肺癌[5]等已發(fā)現(xiàn)TAMs有促瘤作用，但TAMs在宮頸癌的發(fā)生和進展中的作用及具體分子機制尚不清楚。因此，本研究通過探討TAMs對宮頸癌SiHa細胞遷移和侵襲的影響，進一步研究TAMs對宮頸癌進展的潛在作用，從而為宮頸癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌SiHa細胞和人急性白血病單核細胞系THP-1分別由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室饋贈。Transwell小室(孔徑0.4 μm和8 μm)、基質(zhì)膠Matrigel(美國Corning公司)；PE anti-human CD204抗體、PE anti-human CD206抗體(美國Biolegend公司)；E-cadherin抗體、N-cadherin抗體(CST公司)；佛波脂(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)(聯(lián)科生物有限公司)；白細胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1腫瘤相關(guān)巨噬細胞誘導(dǎo)分化 取對數(shù)生長期THP-1細胞離心，PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸，按1.0×106個/孔細胞接種至6孔板，經(jīng)預(yù)實驗結(jié)果選取50 ng/ml PMA處理THP-1細胞24 h，IL-4(20 ng/ml)繼續(xù)處理72 h，此時細胞分化效果最佳。

1.2.2腫瘤相關(guān)巨噬細胞表型鑒定 取誘導(dǎo)完成的TAMs，消化離心棄去上清，PBS洗滌細胞沉淀，100 μl PBS重懸細胞，分別加入5 μl PE標(biāo)記的 CD204和 CD206抗體，避光4℃孵育30 min，離心,棄上清,PBS洗滌細胞沉淀，500 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。THP-1細胞作陰性對照。

1.2.3劃痕實驗 選擇對數(shù)生長期SiHa細胞消化離心，DMEM完全培養(yǎng)基重懸，按2.0×105個/孔細胞接種于6孔板，讓其貼壁生長，待細胞呈單層融合時，吸棄培養(yǎng)基，用10 μl無菌槍頭進行劃痕，PBS洗去脫落細胞，未共培養(yǎng)組置于無血清DMEM培養(yǎng)，共培養(yǎng)組于TAMs培養(yǎng)上清中培養(yǎng)。分別于0 h、12 h、24 h、48 h對固定的劃痕區(qū)拍照，比較各時間點細胞遷移率。細胞遷移率(%)=(0 h劃痕愈合平均寬度-每12/24 h后劃痕愈合平均寬度)/0 h劃痕愈合平均寬度×100%，以此來評價TAMs培養(yǎng)上清對SiHa細胞遷移能力的影響。

1.2.4Transwell非接觸式共培養(yǎng)實驗 共培養(yǎng)選用Transwell(孔徑0.4 μm)小室，上室接種THP-1細胞，按1.2.1步驟進行誘導(dǎo)；誘導(dǎo)完成后，將小室置于種植SiHa細胞的6孔板中進行共培養(yǎng)48 h，棄去小室，PBS洗滌SiHa細胞，用于隨后實驗。侵襲實驗選用Transwell(孔徑8 μm)小室，上室用50 μl Matrigel膠(1∶5稀釋)包被，SiHa細胞接種于Transwell上室，無血清DMEM培養(yǎng)，下室加入TAMs為共培養(yǎng)組，未共培養(yǎng)組下室為DMEM完全培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h；4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫室溫避光染色20 min，濕棉棒擦去小室內(nèi)表面細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果；每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。遷移實驗Transwell小室不包被Matrigel膠，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.2.5Western blot PBS清洗待測細胞3次，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。100℃變性5 min后等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)目的蛋白加入對應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育；TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，重復(fù)洗膜。最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀進行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.2.6熒光定量RT-PCR 參照RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA，測定RNA濃度并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，PCR擴增條件：95℃、2 min預(yù)變性；95℃、5 s，60℃、10 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進行分析。用到的引物序列有β-actin F：5′-TGGACTTCGAGCAAGA-GATG-3′，R：5′-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′；Snail F：5′-GGAAGCCTAACTACAGCGAGC-3′，R：5′-AGGACAGAGTCCCAGATGAGC-3′；Slug F：5′-AAGGACACATAGAACTCACACG-3′，R：5′-CACAGCAGCCAGATTCCTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1TAMs誘導(dǎo)分化及表型鑒定 THP-1細胞呈圓球形，懸浮生長，經(jīng)50 ng/ml PMA誘導(dǎo)24 h后，細胞停止增殖，呈貼壁生長；20 ng/ml IL-4繼續(xù)誘導(dǎo)72 h，細胞呈聚集成簇生長，部分細胞伸出偽足(圖1A～C)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示經(jīng)PMA、IL-4誘導(dǎo)完成的細胞表面CD204和CD206分子表達與對照組相比明顯增加。如圖1D所示，CD204誘導(dǎo)組96.63%，對照組0.06%；CD206誘導(dǎo)組48.38%，對照組0.06%。以上結(jié)果提示TAMs誘導(dǎo)成功。

圖1 TAMs的誘導(dǎo)分化及表型鑒定Fig.1 Induced differentiation and phenotypic identifica-tion of TAMsNote: A.Human acute leukemia monocyte line THP-1(×10)；B.Undifferentiated macrophages induced by PMA for 24 hours(×10)；C.Differentiated Macrophages induced by IL-4 for 72 hours(×10)；D.Expression of CD204 and CD206 on the surface of THP-1 and differentiated macrophages by Flow cytometry.

2.2TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞形態(tài)的影響 TAMs與SiHa細胞共培養(yǎng)(0.4 μm Transwell)48 h后，鏡下可見：未共培養(yǎng)組SiHa細胞呈“鵝卵石”樣排列，邊緣鈍圓，細胞間融合度好；共培養(yǎng)組SiHa細胞形態(tài)變化明顯，細胞呈長梭形，排列雜亂，細胞間隙增大，細胞間融合度降低，具有明顯的間質(zhì)細胞形態(tài)。見圖2。

圖2 與TAMs共培養(yǎng)后SiHa細胞的形態(tài)變化(×10)Fig.2 Morphological changes of SiHa cells after co-culture with TAMs (×10)Note: A.Non-culture;B.Co-culture group.

2.3TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞遷移、侵襲的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示：與未共培養(yǎng)組相比，各時間點與TAMs培養(yǎng)上清共培養(yǎng)的SiHa細胞遷移率均顯著增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表1。此外，TAMs與SiHa細胞共培養(yǎng)(8 μm Transwell)24 h后，用0.1%結(jié)晶紫染色法檢測穿過Transwell上室膜的SiHa細胞數(shù)來反映其遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，遷移和侵襲實驗共培養(yǎng)組穿過Transwell上室膜的SiHa細胞數(shù)均顯著高于未共培養(yǎng)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。提示與TAMs共培養(yǎng)后的SiHa細胞遷移和侵襲能力均增強。見圖4和表2。

圖3 TAMs培養(yǎng)上清對SiHa細胞遷移的影響Fig.3 Effect of TAMs culture supernatant on migration of SiHa cellsNote: A.Non-culture;B.Co-culture group.

表1 TAMs培養(yǎng)上清對SiHa細胞遷移率的影響Tab.1 Effect of TAMs culture supernatant on migration rate of SiHa cells

Note:Compared with non-culture group, 1)P<0.05.

圖4 TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞遷移與侵襲的影響Fig.4 Effect of TAMs-SiHa co-culture on migration and invasion of SiHa cells

表2 TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞遷移與侵襲的影響Tab.2 Effect of TAMs-SiHa co-culture on migration and invasion of SiHa cells

Note:Compared with non-culture group, 1)P<0.001.

2.4TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達水平的影響 TAMs與SiHa細胞共培養(yǎng)(0.4 μm Transwell)48 h后，共培養(yǎng)組SiHa細胞E-cadherin蛋白表達水平為0.18±0.01，顯著低于未共培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。共培養(yǎng)組SiHa細胞N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平分別為0.89±0.04、0.64±0.03，均顯著高于未共培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5和表3。

圖5 TAMs-SiHa共培養(yǎng)對SiHa細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of TAMs-SiHa co-culture on expression levels of EMT related proteins in SiHa cells

2.5TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞Snail/Slug mRNA表達水平的影響 TAMs與SiHa細胞共培養(yǎng)(0.4 μm Transwell) 48 h后， RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Snail/Slug mRNA表達水平。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組Snail、Slug mRNA表達水平分別為2.13±0.35、3.43±0.24，均顯著高于未共培養(yǎng)組(P<0.05)。見表3。

表3 TAMs-SiHa細胞共培養(yǎng)對SiHa細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和Snail/Slug mRNA表達水平的影響Tab.3 Effect of TAMs-SiHa co-culture on expression levels of EMT related proteins and Snail/Slug mRNA in SiHa cells

Note:Compared with non-culture group, 1)P<0.05.

表4 SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白、Snail/Slug mRNA表達水平的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between number of migration and invasion of SiHa cells and expression levels of EMT related protein and Snail/Slug mRNA

2.6SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白、Snail/Slug mRNA表達水平的相關(guān)性分析 結(jié)果如表4所示，SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與E-cadherin蛋白表達水平均呈負相關(guān),而與N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與Snail mRNA表達水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，而與Slug mRNA表達水平均不相關(guān)。

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年增加，且患病人群越來越年輕化，據(jù)估計全球每年新發(fā)宮頸癌病例約57萬，死亡病例約31.1萬[1]。盡管術(shù)前術(shù)后的輔助性化療可以提高患者的生存率，但腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲仍然是宮頸癌患者治療失敗和死亡的主要原因[6]。目前，宮頸癌轉(zhuǎn)移的具體機制尚未完全闡明。因此，進一步探討宮頸癌的轉(zhuǎn)移機制，積極探索有效防止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的新方法，對于改善宮頸癌患者預(yù)后,提高患者生存率至關(guān)重要。

越來越多的研究表明腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生和進展起著重要作用[7]。腫瘤微環(huán)境不僅包括多種腫瘤細胞，還包括基質(zhì)細胞，如內(nèi)皮細胞、間充質(zhì)干細胞以及巨噬細胞等，為腫瘤的進展提供支持[8]。在惡性腫瘤浸潤的免疫細胞中，巨噬細胞含量最為豐富，通常具有明顯的M2表型，稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)。TAMs抗原提呈和吞噬作用能力弱，主要是通過自分泌、旁分泌多種細胞因子，誘導(dǎo)腫瘤周圍微血管和淋巴管的生成，進而促進腫瘤細胞附著于血管表面，催化腫瘤外基質(zhì)的降解和重建[9]。因此，TAMs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在腫瘤的進展中發(fā)揮著重要作用。本研究通過體外實驗將人急性白血病單核細胞系THP-1誘導(dǎo)成為TAMs,并采用Transwall小室將TAMs與宮頸癌SiHa細胞建立共培養(yǎng)體系，充分模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，以此研究TAMs對SiHa細胞生長形態(tài)、遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞呈“長梭形、排列雜亂、細胞間融合度降低”，具有明顯的間質(zhì)細胞形態(tài)。癌細胞形態(tài)的改變與其功能密切相關(guān)，實驗證實，與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細胞遷移和侵襲能力明顯增強，提示當(dāng)SiHa細胞形態(tài)發(fā)生改變后，細胞間黏附變差，浸潤和遷移能力增強，說明TAMs在促進SiHa細胞遷移和侵襲的過程中發(fā)揮了重要作用。

為了探究TAMs促進SiHa細胞遷移和侵襲的機制，本研究檢測了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白的表達。EMT是腫瘤進展的一個關(guān)鍵步驟，并且在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[10]。EMT通過促使上皮細胞在某些因素作用下，失去細胞極性，丟失細胞間緊密連接和黏附連接，獲得浸潤和遷移能力，最終實現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[11]。有研究顯示，TAMs可通過促進腫瘤細胞EMT進展進而促進乳腺癌[12]、肺癌[13]和肝癌[14]等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。那么在宮頸癌中，TAMs是否可以調(diào)控SiHa細胞的EMT進展，本實驗通過TAMs與SiHa細胞共培養(yǎng)來觀察SiHa細胞EMT相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果顯示與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細胞上皮細胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達水平顯著降低，而間質(zhì)細胞標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達水平顯著升高，表明TAMs可以促進SiHa細胞的EMT進展。

機體內(nèi)調(diào)控細胞EMT效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)包括鋅指蛋白、Snail、Slug和Twist等[15]，其中Snail/Slug的研究最為多見。Snail是轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail超家族的一員，家族成員有Snail、 Slug、E12/E47、ZEB1、SIP1。Snail家族的結(jié)構(gòu)相似，C-末端含有4～5個C2H2型的鋅指DNA的結(jié)合區(qū)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)包括一個α螺旋和兩個β鏈；N-末端含有SNAG結(jié)構(gòu)域，對轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物的結(jié)合至關(guān)重要[16]。有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug與促進前列腺癌轉(zhuǎn)移的EMT進展相關(guān)[17]。Chien等[18]通過下調(diào)Snail、Slug表達水平，發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達升高，N-cadherin和Vimentin表達降低，證實了下調(diào)Snail/Slug表達水平可以逆轉(zhuǎn)EMT進程。此外，在其他腫瘤中如結(jié)直腸癌[19]、乳腺癌[20]等也可觀察到Snail參與調(diào)節(jié)E-cadherin的表達來調(diào)控EMT。因此，我們推測Snail/Slug途徑可能是TAMs調(diào)控宮頸癌細胞EMT效應(yīng)的通路之一。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測了Snail、Slug的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細胞Snail、Slug的mRNA表達水平均顯著升高，提示Snail/Slug可能在TAMs促進SiHa細胞EMT進展中起著重要作用。

為了探討SiHa細胞遷移和侵襲能力與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白、Snail/Slug mRNA表達水平之間的關(guān)系，本研究對SiHa細胞與TAMs共培養(yǎng)前后，SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和Snail/Slug mRNA表達水平進行了Pearson相關(guān)性分析。研究發(fā)現(xiàn)，SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與E-cadherin蛋白表達水平具有顯著的負性相關(guān)性,而與N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平具有顯著正性相關(guān)性。SiHa細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)與Snail mRNA表達水平呈正性相關(guān)，而與Slug mRNA表達水平不相關(guān)。據(jù)此推測，在TAMs促進SiHa細胞遷移和侵襲的過程中，Snail表達上調(diào)可能加快了SiHa細胞的EMT進展，從而促進了SiHa細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明TAMs在促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮了重要作用，可能是通過上調(diào)Snail表達促進宮頸癌細胞EMT進展來發(fā)揮作用的。因此，抑制腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞向TAMs的轉(zhuǎn)化，負向調(diào)控Snail的表達可能會抑制宮頸癌細胞的EMT進展，從而阻止宮頸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，改善患者的預(yù)后情況。