王國泰 李京濤 魏海梁 閆曙光 李 寧

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，咸陽 712000)

肝纖維化是肝細(xì)胞收到外源性炎癥刺激后，受損肝臟周圍大量聚集了膠原蛋白和纖維黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)導(dǎo)致正常膠原蛋白降解功能失常，進(jìn)而造成纖維結(jié)締組織和膠原等在受損肝臟周圍異常沉積的病理過程[1,2]。肝臟受損時(shí)肝星狀細(xì)胞在肝竇狀隙中被激活，眾多的證據(jù)表明HSC激活是肝纖維化過程的關(guān)鍵，是纖維狀和非纖維狀基質(zhì)蛋白的主要來源。肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活能夠增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、促進(jìn)收縮平滑肌 α-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)增加、促炎細(xì)胞因子的釋放和基質(zhì)降解酶及其抑制物的釋放。HSC的激活是導(dǎo)致肝纖維化的主要因素，激活的HSC分泌大量細(xì)胞外間質(zhì)，影響肝臟的功能，引起細(xì)胞因子及細(xì)胞群的一系列變化。臨床上大量數(shù)據(jù)表明早期的肝纖維化是可以通過治療逆轉(zhuǎn)，但是若病情進(jìn)一步發(fā)展則會(huì)發(fā)展成肝硬化甚至是肝癌[3]。

目前臨床上沒有特別有效的藥物來控制和治療肝纖維化，因此針對肝纖維化的藥物研究一直是臨床的研究熱點(diǎn)。TGF-β1/Smad通路是肝纖維化發(fā)生的重要信號通路，研究表明在體內(nèi)建立以CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型[3]，探討Smad2和Smad3在肝纖維化中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝臟纖維化組織中發(fā)現(xiàn)了Smad2和Smad3的磷酸化[2]。因此針對抑制TGF-β1/Smad信號通路的藥物就成為肝纖維化的研究熱點(diǎn)。

姜黃素是從傳統(tǒng)中醫(yī)藥姜黃中提取的一種單體，其物理特性表現(xiàn)為橙黃色粉末結(jié)晶，味苦，不溶于水，易溶于乙醇和冰醋酸以及堿溶液?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以很好地抑制炎癥的發(fā)生、同時(shí)可以抗氧化、抗凝降脂、消除自由基和抑制腫瘤增殖等作用[4]。結(jié)合姜黃素可以抗炎的作用，設(shè)想其是否對肝纖維化有一定的作用。因此，本研究采用人肝星狀細(xì)胞LX-2為研究目標(biāo)，來研究姜黃素是否可以抑制肝纖維的進(jìn)程及其可能的作用機(jī)制，為臨床上肝纖維化的治療提供可行的治療策略。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 人肝星狀細(xì)胞LX-2購自中科院上海細(xì)胞庫，姜黃素單體購自陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸和磷鎢酸均購自西安科昊生物有限公司，蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司，4%多聚甲醛、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液和青鏈霉素購自美國HyClone，β-actin、Ku70和CDK12抗體購自英國 Abcam，兔二抗購自英國 Abcam，Trans-well小室購自康寧。

1.1.2儀器 CFX96 real-time PCR儀、S1000TM Thermal Cycler PCR儀(Bio-Rad，美國)；Western blot儀器(Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 調(diào)整LX-2細(xì)胞密度為4×105個(gè)/孔直接鋪板，細(xì)胞密度達(dá)至80%左右，10 ng/ml TGF-β1刺激24 h，隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h。結(jié)束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀450 nm檢測細(xì)胞CCK-8混合液OD值進(jìn)行活力分析。

1.2.2qRT-PCR 調(diào)整LX-2細(xì)胞密度為4×105個(gè)/孔直接鋪板，細(xì)胞密度達(dá)至80%左右，10 ng/ml TGF-β1刺激24 h，隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h，嚴(yán)格按照試劑盒步驟提取、定量、反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。引物序列如下，CollagenⅠ:Forward-ATTTTTCTGDCGACACCCGAT，Reverse-TCCCAGGTGTAGACCAA；CollagenⅢ For-ward-ATTTTTGTACACACCCGAT，Reverse-TGACCG-GTGTAGACCAA;α-SMA Forward-ATTTTTGCCCGAT-ACCCGAT，Reverse-TGACCGTCATAGACCAA和β-actin：Forward-ATTTTTGTACACACAATGC，Reverse-TGACCGGTGTCCCTGACGAT。

1.2.3Western blot 調(diào)整LX-2細(xì)胞密度為4×105個(gè)/孔直接鋪板，細(xì)胞密度達(dá)至80%左右，10 ng/ml TGF-β1刺激24 h，隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h。隨后消化細(xì)胞鋪至培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度80%時(shí)收集細(xì)胞，裂解液(含有蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min后高速離心機(jī)4℃ 13 000 r/min 離心30 min后吸取上層蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗(Ku70、CDK12和β-actin)，4℃過夜。第2天冷的PBS清洗條帶3次，二抗孵育1 h，發(fā)光儀發(fā)光拍照。

1.2.4CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型 C57小鼠分組，分為空白對照組(Normal)、PBS組和姜黃素(Curcumin)組，每組6只。CCl4和橄欖油(2∶3)按比例混勻，每周兩次皮下注射，注射劑量3 ml/kg，連續(xù)注射6周。PBS組小鼠PBS給藥處理，姜黃素組給藥100 mg/kg，每周3次給藥，連續(xù)給藥6周。6周后CO2處死所有小鼠，收集每只小鼠血液，肝臟固定在4%多聚甲醛，在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃。

1.2.5小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測 肝纖維化模型造模成功6周后，采集小鼠血液，采用離心分離處理,臺式離心機(jī)轉(zhuǎn)速為13 000 r/min,處理時(shí)間為20 min,離心分離后取上清液進(jìn)行檢測。全自動(dòng)生化分析儀、酶標(biāo)儀及配套試劑盒完成檢測，肝功能指標(biāo)包括ALT、AST、ALB和TP。

1.2.6ELISA 測IL-10和IFN-γ水平 肝纖維化模型造模成功6周后，采集小鼠血液，采用離心分離處理,臺式離心機(jī)轉(zhuǎn)速為13 000 r/min,處理時(shí)間為20 min,離心分離后取上清液進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測血液上清中IL-10和IFN-γ的含量。

1.2.7羥脯氨酸的測定 稱取小鼠肝組織100 mg，置于安瓿瓶中，加入2.5 ml純水和2.5 ml濃鹽酸封瓶，置于105℃烘箱中水解18 h，濾紙過濾即得肝組織水解液。取10 μl水解液，加入10 μl內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，用72%乙腈水溶液定容至10 ml，取稀釋液1 ml，以13 000 r/min離心10 min，取上清，用試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.8HE染色 按1.2.4方法進(jìn)行分組和給藥。給藥6周后，CO2處死小鼠，分離出肝臟盡量去除結(jié)締組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，并將包埋標(biāo)本切成4 μm薄片，依次進(jìn)行石蠟切片脫蠟至水、蘇木素(Hematoxylin)染色、伊紅(Eosin)染色、脫水封片操作，顯微鏡鏡檢，圖像采集，Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.9馬松染色 中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。入天青石藍(lán)液染10 min。蒸餾水洗3次。馬松和苦味酸染30 min。無水酒精直接分化和脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。染色的結(jié)果膠原呈藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1姜黃素抑制了LX-2的增殖作用 正常體外培養(yǎng)LX-2細(xì)胞，不進(jìn)行任何處理，分別不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L)48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5～35 μmol/L姜黃素對LX-2細(xì)胞增殖沒有影響(圖1A)，而45和50 μmol/L則現(xiàn)在抑制LX-2細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此后續(xù)姜黃素給藥濃度控制在50 μmol/L以內(nèi)。

圖1 不同濃度姜黃素對LX-2細(xì)胞的作用Fig.1 Effect of curcumin at different concentrations on LX-2 cellNote:A.Toxicity of curcumin at different concentrations on LX-2 cells；B.Inhibition of curcumin at different concentrations on TGF-β activated LX-2 cells.***.P<0.001.

正常生理?xiàng)l件下人肝星狀細(xì)胞處于靜態(tài)，肝臟受到外源性損傷發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)會(huì)激活人肝星狀細(xì)胞的活化與增殖，使其在受損肝臟周圍快速增殖聚集。體外我們用10 ng/ml TGF-β1刺激人肝星狀細(xì)胞LX-2 24 h，來模擬這種損傷。隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h，CCK-8檢測各組LX-2細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著姜黃素濃度的增高，可以顯著抑制活化狀態(tài)下的LX-2細(xì)胞的增殖(P<0.05)，并且發(fā)現(xiàn)且姜黃素20 μmol/L抑制作用最強(qiáng)(圖1B)(P<0.05)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以20 μmol/L姜黃素為研究基礎(chǔ)。此結(jié)果說明姜黃素對活化狀態(tài)下的人肝星狀細(xì)胞LX-2具有抑制作用，為后續(xù)的研究奠定一定基礎(chǔ)。

2.2姜黃素抑制LX-2細(xì)胞纖維相關(guān)蛋白和免疫炎性因子的表達(dá) 姜黃素對活化狀態(tài)下的人肝星狀細(xì)胞LX-2的增殖具有抑制作用，通過qRT-PCR和Western blot我們檢測了CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以顯著抑制CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA的表達(dá)(P<0.05)，降低其在活化狀態(tài)下LX-2細(xì)胞的含量；通過ELISA檢測了IL-10和IFN-γ的表達(dá)變化，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效抑制免疫炎性因子IL-10和IFN-γ的表達(dá)(P<0.05)，說明姜黃素對纖維相干蛋白和免疫炎性反應(yīng)具有抑制作用。見圖2。

圖2 姜黃素對纖維相關(guān)蛋白和免疫炎性因子表達(dá)的影響Fig.2 Effect of curcumin on expression of fiber-related proteins and immunoinflammatory factorsNote:A.qRT-PCR was used to detect the effect of curcumin on fiber-related protein expression；B.ELISA was used to detect curcumin on immuno-inflammatory factors IL-10 and IFN-γ expression effect；C.Western blot was used to detect the effect of curcumin on fiber-related protein expression.**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3姜黃素抑制LX-2細(xì)胞內(nèi)p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路 目前已有研究結(jié)果表明，TGF-β1可以激活smad2的磷酸化，促使其進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)p-65的表達(dá)從而發(fā)揮調(diào)節(jié)促纖維化的作用，Western blot結(jié)果顯示姜黃素顯著抑制smad2的磷酸化和p-65的表達(dá)(P<0.05)，說明在細(xì)胞水平姜黃素素抑制了p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB經(jīng)典纖維化信號通路。見圖3。

圖3 姜黃素對p-smad2和p-65表達(dá)的影響Fig.3 Effect of curcumin on expression of p-smad2 and p-65Note:**.P<0.01;***.P<0.001.

2.4姜黃素改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維小鼠肝組織和肝功能損傷 經(jīng)CCl4誘導(dǎo)成功構(gòu)建C57肝纖維化小鼠模型，姜黃素腹腔給藥，6周后處死小鼠，收集各組小鼠血清和肝組織進(jìn)行肝功和HE染色。肝纖維化過程中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)對肝功能具有一定的指向性，血液分析結(jié)果顯示，與PBS組相比，姜黃素顯著降低了CCl4誘導(dǎo)小鼠血液中AST、ALT、Cr和BUN的表達(dá)(P<0.05)；同時(shí)HE染色結(jié)果顯示姜黃素有效改善了CCl4誘導(dǎo)小鼠肝組織損傷，組織中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，與PBS組相比，組織結(jié)構(gòu)排列有序，細(xì)胞碎片明顯減少。這說明在體內(nèi)姜黃素可以改善纖維化小鼠肝組織損傷和肝功能損傷，有利于小鼠維持更長的生存期。見圖4。

2.5姜黃素抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維小鼠肝組織內(nèi)膠原的沉積 膠原的沉積是造成肝臟發(fā)生纖維化的主要原因，小鼠造模給藥結(jié)束后馬松染色檢測各組肝組織內(nèi)纖維蛋白的表達(dá)，與PBS組相比較，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效抑制纖維蛋白的表達(dá)(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素顯著抑制肝組織內(nèi)α-SMA的表達(dá)(P<0.05)。見圖5。

圖5 姜黃素對小鼠肝組織纖維化的抑制情況Fig.5 Inhibition of curcumin on liver fibrosis in miceNote:A.Masson staining to detect the expression of curcumin in liver tissue of mice；B.Effect of curcumin on the expression of hydroxyproline in liver tissue of mice.***.P<0.001.

2.6姜黃素抑制CCl4誘導(dǎo)的p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路 在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路，在體內(nèi)這種抑制作用是否仍存在，我們通過Western blot檢測了各組小鼠肝組織內(nèi)p-smad2和p-65的表達(dá)，結(jié)果表明在體內(nèi)姜黃素同樣可以有效抑制p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路，從而抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。見圖6。

圖6 姜黃素在體內(nèi)對p-smad2和p-65表達(dá)影響Fig.6 Effect of curcumin on expression of p-smad2 and p-65 in vivo3Note:**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

肝纖維化是臨床上較為常見的一種肝臟疾病，在發(fā)病早期具有一定的可逆轉(zhuǎn)性，若不及時(shí)治療隨著病情的發(fā)展會(huì)形成肝硬化甚至是肝癌[5]，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于肝纖維化病情較為嚴(yán)重的階段[6]。肝纖維化形成的原因，目前尚不完全清楚，其是多基因多因素參與形成的結(jié)果[7,8]。目前較為公認(rèn)的說法是膠原沉積和纖維黏連蛋白的過度表達(dá)以及免疫相關(guān)炎性因子釋放是造成肝纖維化的主要原因[9,10]。目前TGF-β/p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路是纖維化研究的熱點(diǎn)[10]。

傳統(tǒng)中藥在肝病的治療上有獨(dú)特的優(yōu)勢[11,12]，毒副作用小，來源廣泛，可以作為治療肝病等多種疾病的寶庫。姜黃素是從傳統(tǒng)中醫(yī)藥姜黃中提取的一種單體，其物理特性表現(xiàn)為橙黃色粉末結(jié)晶，味苦，不溶于水，易溶于乙醇和冰醋酸以及堿溶液?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以很好地抑制炎癥的發(fā)生，同時(shí)可以抗氧化、抗凝降脂、消除自由基和抑制腫瘤增殖等作用[9,13]。姜黃素對肝纖維化的作用目前報(bào)道較少，具體機(jī)制更是闡明不清楚。

本研究主要研究了傳統(tǒng)中藥姜黃的提取單體姜黃素對肝纖維化的作用及其作用機(jī)制。體外研究結(jié)果可知姜黃素可以有效抑制TGF-β1激活的人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞的增殖，同時(shí)顯著抑制CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA以及免疫炎性因子IL-10和IFN-γ的表達(dá)，說明姜黃素在體外對肝纖維化相關(guān)的因子具有很好的抑制作用，為證明這種抑制作用是否通過TGF-β/p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)，隨后檢測了LX-2細(xì)胞內(nèi)p-smad2和p-65的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效抑制smad2的磷酸化和p-65的表達(dá)，其可能的機(jī)制是通過抑制smad2的磷酸化從而阻止其入核，進(jìn)而影響p-65/NF-κB信號通路，影響下游纖維蛋白基因的編碼和翻譯。體外實(shí)驗(yàn)中我們通過CCl4構(gòu)建C57小鼠肝纖維化模型，腹腔給藥的方式注射姜黃素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效改善小鼠肝功能損傷，降低小鼠血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的表達(dá)，同時(shí)減少組織中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量，減輕炎癥反應(yīng)。通過馬松染色和羥脯氨酸的測定，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素可以顯著減少小鼠體內(nèi)纖維蛋白的表達(dá)，通過Western blot檢測我們發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)姜黃素同樣可以有效抑制smad2的磷酸化和p-65的表達(dá)。

綜上所述，在體內(nèi)和體外姜黃素是通過阻滯p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路抑制了肝纖維化的作用，這為中藥姜黃素的臨床應(yīng)用和肝纖維化的藥物治療都提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是姜黃素又是通過哪些上游因素來調(diào)控TGF-β/smad2信號通路，除了對p-smad2介導(dǎo)的p-65/NF-κB信號通路有抑制作用，對其他纖維化信號通路是否同樣有抑制作用，這將是我們下一步的研究重點(diǎn)。