洪 洋 劉 彬 夏龍飛 賈 佳 劉運(yùn)江

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050000)

阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease,AD)又稱老年癡呆，是以記憶和認(rèn)知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)能夠?qū)е抡J(rèn)知能力下降和神經(jīng)功能退化[2]，Aβ腦內(nèi)的沉積可能是誘發(fā)包括星形膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)多種神經(jīng)細(xì)胞功能失調(diào)的主要原因，明顯影響到星形膠質(zhì)細(xì)胞間的信息加工和傳導(dǎo)能力，并導(dǎo)致大范圍的腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[3]。這就提示我們，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能可能成為治療大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。

多種證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)的產(chǎn)生與AD之間的聯(lián)系是多樣的也是復(fù)雜的。ER作為一種重要的細(xì)胞器調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成代謝功能。多種病理學(xué)改變都會(huì)誘導(dǎo)ER stress的形成，主要表現(xiàn)為ER分子伴侶蛋白的形成和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)的激活。當(dāng)UPR過(guò)度或持久激活時(shí)，最終則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞功能性紊亂甚至細(xì)胞死亡[4]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，AD患者腦內(nèi)和動(dòng)物模型中，在ER部位附近聚集大量Aβ蛋白，從而誘導(dǎo)ER stress的持久性激活，導(dǎo)致GRP78、ATF4的大量表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成[4,5]。目前Aβ蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的具體機(jī)制尚不完全清楚，但是ER功能障礙有可能在Aβ蛋白引起星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨约把装Y反應(yīng)的發(fā)生中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料 Aβ1-42片段，ER stress抑制劑Salubrinal(Sal)，ER stress促進(jìn)劑Tunicamycin(TM)均購(gòu)置美國(guó)Sigma公司(St.Louis,MO,USA)，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清FBS購(gòu)置Gibco(Carlsbad,CA,USA)，GRP78、NLRP3、pro-IL-1β、β-actin抗體購(gòu)置Cell Signaling公司(Beverly,MA,USA)。羊抗兔/FITC多克隆抗體購(gòu)置 Bioss公司(Beijing,China)。

1.2方法

1.2.1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于新生SD大鼠大腦皮層，無(wú)菌條件下破碎組織，制備單細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2條件下孵育培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞充分覆蓋后，37℃震蕩去除多余小膠質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光染色法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度(純度>95%)，純化后的細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板(用于ELISA、免疫熒光、Western blot試驗(yàn))。

1.2.2ELISA檢測(cè) 取正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)干預(yù)處理后，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清IL-1β的分泌水平改變。首先，建立1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625和0 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后取上清100 μl加入到預(yù)先孵育抗IL-1β培養(yǎng)板內(nèi)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，分別要求依次加入檢測(cè)試劑。最后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)細(xì)胞上清IL-1β濃度。

1.2.3Western blot檢測(cè) 取星形膠質(zhì)細(xì)胞裂解后提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒計(jì)算蛋白含量。取提取蛋白分別制備10%或15%SDS分離膠分離蛋白，并通過(guò)半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜應(yīng)用5%脫脂奶粉封閉，4℃分別孵育GRP78、pro-IL-1β和NLRP3抗體過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學(xué)顯色。最后應(yīng)用Image J分析軟件對(duì)掃描條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4免疫熒光檢測(cè) 取4%甲醛固定星形膠質(zhì)細(xì)胞，0.05% Triton X-100和3%BSA封閉打孔，4℃分別孵育GRP78、NLRP3抗體過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h，DAPI進(jìn)行核染色，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞。

1.2.5藥物干預(yù)與分組 取正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、Aβ組(5 μmol/L)、TM組(5 μmol/L)、Sal處理組(10 μmol/L)。Aβ組給予多聚化Aβ1-42干預(yù)6 h；TM處理組應(yīng)用TM干預(yù)處理2 h；Sal處理組應(yīng)用Sal預(yù)處理1 h，然后與Aβ共處理6 h。對(duì)照組給予DMEM培養(yǎng)基對(duì)照處理。

2 結(jié)果

2.1Aβ促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞GRP78表達(dá) 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ處理6 h，星形膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)早期的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。為了研究Aβ干預(yù)早期星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)病理學(xué)改變。我們應(yīng)用Aβ處理星形膠質(zhì)細(xì)胞6 h。免疫熒光結(jié)果顯示(圖1A)，相比CTL組，Aβ組星形膠質(zhì)細(xì)胞體積出現(xiàn)明顯膨脹，在胞內(nèi)ER stress相關(guān)蛋白GRP78出現(xiàn)了大量表達(dá)，在胞漿和胞核附近均出現(xiàn)明顯大量聚集。Western blot結(jié)果顯示(圖1B)，相比對(duì)照組，Aβ顯著促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞GRP78表達(dá)(P<0.05)。

圖1 Aβ促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞GRP78表達(dá)
Fig.1 Aβ induced GRP78 expression in astrocytes
Note: A.Immunostained against antibodies GRP78 (green),DAIP was used to stain nuclei (blue);B.Compared with control group,*.P<0.05，the difference was statistically significant.

2.2ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β合成分泌 ELISA結(jié)果顯示(圖2)，相比對(duì)照組，Aβ組和TM組IL-1β分泌水平均出現(xiàn)明顯增加(P<0.01)；相比Aβ組，TM組IL-1β分泌水平未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05)。研究結(jié)果說(shuō)明，ER stress誘導(dǎo)劑TM促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β。

圖2 ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌Fig.2 ER stress activation induced IL-1β secretion in astrocytesNote:**.P<0.01，compared with control group,the difference was statistically significant.

2.3ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞pro-IL-1β表達(dá) Western blot結(jié)果顯示(圖3)，相比對(duì)照組，Aβ和TM均促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞pro-IL-1β表達(dá)(P<0.05)。研究結(jié)果說(shuō)明，ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞成熟型pro-IL-1β片段的表達(dá)。

圖3 ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞pro-IL-1β表達(dá)Fig.3 ER stress activation induced pro-IL-1β expression in astrocytesNote:*.P<0.05，compared with control group,the difference was statistically significant.

2.4ER stress抑制劑Sal抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)活化 Western blot結(jié)果顯示(圖4A)，相比對(duì)照組，Aβ組明顯促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)活化(P<0.05)。ER stress抑制劑Sal顯著抑制了Aβ所誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)(P<0.05)。另外，免疫熒光結(jié)果顯示(圖4B)，Aβ組星形膠質(zhì)胞漿和胞核附近均表達(dá)大量NLRP3。相比Aβ組，Sal組星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)出現(xiàn)明顯減少。研究結(jié)果說(shuō)明，Aβ通過(guò)調(diào)節(jié)ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)。

圖4 Sal抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)活化Fig.4 Sal inhibited NLRP3 expression in Aβ-induced astrocytesNote: A.*.P<0.05，compared with Aβ group,the difference was statistically significant；B.Immunostained against antibodies NLRP3 (green),DAIP was used to stain nuclei (blue).

3 討論

神經(jīng)炎癥反應(yīng)作為AD重要的病理學(xué)特征之一，非常易于在AD患者腦內(nèi)易感區(qū)域發(fā)生，表現(xiàn)為大量促炎癥調(diào)節(jié)因子的合成分泌[6]。這種炎癥調(diào)節(jié)因子的大量分泌嚴(yán)重影響到AD的神經(jīng)病理學(xué)特征，特別是引起記憶和認(rèn)知功能的下降[7]。IL-1β是一個(gè)能誘發(fā)或加重多種細(xì)胞反應(yīng)的主要促炎癥細(xì)胞因子。IL-1β水平的提升被諸多研究者認(rèn)為是與疾病發(fā)展密切相關(guān)，比如Ⅱ型糖尿病，癌癥或是神經(jīng)退行性疾病等[8,9]。研究證實(shí)，阻斷或消除IL-1β信號(hào)通路，則明顯改善AD認(rèn)知功能異常狀態(tài)并能有效調(diào)節(jié)AD病理學(xué)癥狀[10,11]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)是數(shù)量最龐大的一類細(xì)胞。然而，當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨髸?huì)產(chǎn)生大量炎癥調(diào)節(jié)因子，包括IL-1β、TNF-α以及COX-2等。事實(shí)上，當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致其異?；罨?。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ處理6 h，星形膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)異?；罨癄顟B(tài)，表現(xiàn)為早期的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。為了研究Aβ干預(yù)早期星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)病理學(xué)改變，我們應(yīng)用多聚化Aβ1-42處理6 h。研究結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞體積出現(xiàn)明顯膨脹，在胞漿中表達(dá)了大量ER stress相關(guān)蛋白GRP78并在胞漿和胞核附近出現(xiàn)大量聚集。多種證據(jù)表明，當(dāng)ER stress過(guò)度或持久激活時(shí)，最終則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞功能性紊亂甚至細(xì)胞死亡。ER stress發(fā)生時(shí)，與蛋白激酶(PKR-like ER kinase,PERK)結(jié)合的免疫蛋白結(jié)合蛋白GRP78會(huì)解離，并游離與胞漿中，使PERK蛋白磷酸化，進(jìn)一步促使elF2α發(fā)生磷酸化修飾，從而引起蛋白質(zhì)合成障礙，影響細(xì)胞正常功能[12]。因此我們推斷，Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ER stress活化與星形膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)的異?；罨癄顟B(tài)存在潛在聯(lián)系。

在NLRs家族中，NLRP3是最受專家學(xué)者關(guān)注的炎癥小體之一。NLRP3炎癥小體是由多種蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，包括核心蛋白NLRP3、調(diào)節(jié)分子ASC以及pro-Caspase-1組成。它常被看作是活化促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的上游蛋白[13]。盡管NLRP3炎癥小體在細(xì)胞分子內(nèi)的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，但是可以肯定的是，在溶酶體損傷[14]，線粒體鈣離子通量改變[15]以及氧化應(yīng)激片段ROS形成[16]等應(yīng)激條件下常常激活細(xì)胞內(nèi)NLRP3大量合成。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠誘導(dǎo)ER stress在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)激活，主要表現(xiàn)為GRP78的表達(dá)。為了證實(shí)本研究假設(shè)，我們應(yīng)用ER stress誘導(dǎo)劑TM干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示TM能顯著促進(jìn)pro-IL-1β、IL-1β和NLRP3的表達(dá)合成。然而，ER stress抑制劑Sal顯著抑制了Aβ誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)。研究結(jié)果說(shuō)明，Aβ通過(guò)調(diào)節(jié)ER stress活化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)以及pro-IL-1β、IL-1β合成分泌。

綜上所述，我們可以推斷 Aβ在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的大量聚集能夠誘導(dǎo)ER stress的激活并表現(xiàn)出來(lái)的早期神經(jīng)炎癥細(xì)胞毒性反應(yīng)。因此，異常折疊蛋白所誘導(dǎo)ER stress的激活表現(xiàn)出NLRP3炎癥小體所介導(dǎo)炎癥信號(hào)的啟動(dòng)，并進(jìn)一步誘發(fā)神經(jīng)炎癥因子的合成和分泌。