肖 非 胡 智 陽(yáng) 君 曹二龍 伍 仙

(邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，邵陽(yáng) 422000)

肺炎克雷伯菌是社區(qū)獲得性和醫(yī)院感染最常見(jiàn)的革蘭陰性細(xì)菌，也是慢性阻塞性肺疾病最常見(jiàn)的感染性細(xì)菌。肺炎克雷伯菌的主要毒力因子包括細(xì)菌表面成分莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[1,2]。肺炎克雷伯菌CPS能經(jīng)TLR4識(shí)別并誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌[1]。氣道和肺部的上皮細(xì)胞是肺炎克雷伯菌面臨的第一道防線(xiàn)。呼吸道上皮細(xì)胞不僅是一種被動(dòng)的物理屏障，而且是呼吸道固有免疫反應(yīng)的重要活性效應(yīng)細(xì)胞。因此了解肺炎克雷伯菌CPS與人呼吸道上皮細(xì)胞之間的復(fù)雜分子相互作用，有利于明確宿主的抗感染免疫機(jī)制?？咕氖窍忍烀庖呦到y(tǒng)的重要效應(yīng)分子。它們是消除或抑制各種細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)的第一道防線(xiàn)[3]。除了其抗菌活性外，它們還具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，在先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的相互作用中發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用[4,5]。在各類(lèi)抗菌肽中，人β-防御素-3(hBD-3)在上皮免疫防御中起著特別重要的作用[6]。它對(duì)廣譜的病原體有很強(qiáng)的抗菌作用。目前尚不清楚hBD-3在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控。尤其是hBD-3對(duì)肺炎克雷伯菌夾膜多糖的重要性尚不清楚。因此本研究旨在探討肺炎克雷伯菌夾膜多糖對(duì)hBD-3表達(dá)的影響，并研究其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人支氣管上皮細(xì)胞株 BEAS-2B 購(gòu)自 ATCC。小鼠抗人hBD-3多克隆抗體購(gòu)自Abcam。小鼠抗人p38、ERK1/2、JNK1/2及c-Jun單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。SB203580、PD98059和SP600125以及PDTC 購(gòu)自Sigma-Adrich。DMEM培養(yǎng)基Invitrogen公司，細(xì)胞蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo 公司。

1.2方法

1.2.1肺炎克雷伯菌的培養(yǎng)與夾膜多糖提取 肺炎克雷伯菌用含有100 μg/ml氨芐青霉素或50 μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照參考文獻(xiàn)[1]提供的方法提取CPS。即100℃加熱培養(yǎng)肺炎克雷伯菌以釋放其莢膜成分。隨后加入丙酮沉淀CPS。經(jīng)RNase B(30 μg/ml)和DnaseⅠ(70 μg/ml)及鏈霉蛋白酶溶液(含10 mmol/L Tris HCl，pH7.4，1 mmol/L CaCl2)消化后用50 kD的透析膜對(duì)樣品進(jìn)行透析、凍干。CPS粗提物隨后在TSK HW-65F柱上進(jìn)一步純化并采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定CPS的濃度。刺激細(xì)胞前采用2-酮基-3-脫氧辛酸(KOD)-硫代巴比妥酸法測(cè)定CPS中LPS的含量以排除LPS污染。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理 BEAS-2B細(xì)胞用有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，加入0.1～10.0 μg/ml CPS孵育24 h。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) mRNA表達(dá) 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄測(cè)定上皮細(xì)胞中hBD-3 mRNA的水平，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。 使用TRIzol試劑提取總RNA。在 50 μl 反應(yīng)體系中使用1 μg總RNA和隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)用于人hBD-3基因的引物和探針。 人hBD-3：正向引物，5′-GCCTCTTCCAGGTGTTTTTG-3′;反向引物：5′-GAGACCACAGGTGCCAATTT-3′。在ABI Prism 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行PCR。 25 μl PCR反應(yīng)含有30 ng cDNA，100 nmol/L熒光探針和200 nmol/L引物。采用比較閾值循環(huán)(CT)方法，通過(guò)計(jì)算其與管家基因GAPDH的比值來(lái)確定相對(duì)基因表達(dá)水平。

1.2.4ELISA檢測(cè)hBD-3蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理結(jié)束后，采用Millipore公司提供的Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit試劑盒將上清液濃縮10倍，隨后采用Phoenix公司提供的hBD-3試劑盒測(cè)定hBD-3的濃度，其原理基于雙抗體夾心法，方法按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 經(jīng)處理后的細(xì)胞樣品用含有Triton X-100的緩沖液溶解，隨后用SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)印至Hybond ECL膜(Amersham Biosciences)。經(jīng)過(guò)封閉后，先后用特異性抗體和相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，最后化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.2.6RNA干擾 使用非特異性siRNA(siRNA control，NWG Biotech)和特異性TLR4靶向siRNA(Ambion)進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)。按照參考文獻(xiàn)[7]提供的方法，采用Amaxa公司提供的Nucleofector試劑盒，將2 μg(約25 nmol/L)siRNA轉(zhuǎn)染至106個(gè)細(xì)胞內(nèi)。

1.2.7染色質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)[8]提供的方法進(jìn)行染色質(zhì)共沉淀。即，細(xì)胞裂解并經(jīng)超聲處理后，加入蛋白A/G瓊脂糖收集免疫復(fù)合物，用RIPA緩沖液和高鹽緩沖液徹底清洗后，隨后用洗脫緩沖液提取免疫復(fù)合物并用RNA酶消化。加入蛋白酶K在37℃消化6 h后，再置于65℃消化6 h。采用Qiagen公司提供的PCR純化試劑盒提取DNA，最后用Taq DNA聚合酶(Sigma)對(duì)hBD-3啟動(dòng)子DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，所用引物序列為5′-TCCCAGACACCCTT-3′(正向)和5′-TTCCAGCCAGCCATT-3′(反向)。

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌CPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)hBD-3 mRNA和蛋白 BEAS-2B細(xì)胞給予0.1 μg/ml、1.0 μg/ml和10 μg/ml CPS孵育24 h后，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，hBD-3 mRNA表達(dá)水平隨之增高，呈一定的濃度依賴(lài)性(圖1A)。此外，培養(yǎng)上清中hBD-3蛋白水平也具有類(lèi)似的趨勢(shì)(圖1B)。

圖1 不同濃度CPS對(duì)hBD-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CPS on expr-ession of hBD-3Note:*.P<0.05 vs 0 μg/ml group(Control group).

這表明肺炎克雷伯菌能誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)hBD-3。

2.2TLR4介導(dǎo)肺炎克雷伯菌CPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞hBD-3表達(dá) 為了探討CPS誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)是否經(jīng)TLR4介導(dǎo)，首先采用siRNA干擾BEAS-2B細(xì)胞上TLR4表達(dá)(圖2A)，隨后ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中hBD-3的表達(dá)量，結(jié)果顯示，沉默TLR4后，CPS誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)顯著減少(圖2B)。

圖2 沉默TLR4對(duì)CPS誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)的影響Fig.2 Effect of silencing TLR4 on CPS-induced hBD-3 expressionNote:A.RNA interference effect;B.Interfering with the effect of TLR4 on hBD-3 expression.Compared with control group(0 μg/ml),*.P<0.05；compared with the control siRNA group，#.P<0.05.

2.3肺炎克雷伯菌CPS經(jīng)絲裂原蛋白活化激酶誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)hBD-3 TLR4與相關(guān)配體結(jié)合后，可激活下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路如p38、JNK和ERK[9]。Western blot結(jié)果顯示，10 μg/ml CPS處理30 min后均可激活p38、JNK和ERK，并持續(xù)至120 min(圖3A)。而采用25 μmol/L p38和ERK抑制劑SB203580及PD98059處理細(xì)胞后，hBD-3無(wú)明顯影響，而采用25 μmol/L JNK抑制劑SP600125處理后，hBD-3分泌明顯降低(圖3B)。

圖3 MAPKs介導(dǎo)CPS誘導(dǎo)hBD-3分泌Fig.3 MAPKs mediate CPS-induced secretion of hBD-3Note:A.CPS induced MAPKs phosphorylation;B.MAPKs inhibitors on CPS-induced hBD-3 expression.Compared with control group(0 μg/ml),*.P<0.05.

2.4AP-1參與調(diào)控hBD-3表達(dá) 研究表明，肺炎克雷伯菌可激活NF-κB。但采用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞后，對(duì)hBD-3表達(dá)無(wú)明顯影響(圖4A)，相比之下，CPS可誘導(dǎo)AP-1亞基c-Jun磷酸化(圖4B)。染色質(zhì)共沉淀結(jié)果證實(shí)，CPS處理后可顯著增強(qiáng)AP-1與hBD-3啟動(dòng)子的結(jié)合(圖4C)。

圖4 肺炎克雷伯菌CPS經(jīng)AP-1誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)Fig.4 K.pneumoniae CPS induces hBD-3 expression via AP-1

3 討論

病原微生物感染后，可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞hBD-3的分泌，后者對(duì)多種病原體具有殺菌作用。細(xì)菌性肺炎患者中，血清中hBD-3水平明顯增高[10]。由于hBD-3具有廣泛的抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能，它在宿主保護(hù)肺抵抗細(xì)菌病原體方面起著重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌毒力因子夾膜多糖可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞中的hBD-3分泌。在濃度1～10 mg/ml 的情況下，hBD-3被證明具有很強(qiáng)劑量依賴(lài)性。雖然細(xì)胞上清液中的hBD-3濃度僅在pg/ml范圍內(nèi)檢測(cè)到，但目前還不清楚體內(nèi)人呼吸道肺炎克雷伯菌感染所引起的分泌型hBD-3的濃度，而本研究發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌CPS刺激的細(xì)胞中hBD-3分泌量比基礎(chǔ)水平增加了近20倍。這表明肺炎克雷伯菌CPS可有效上調(diào)hBD-3的表達(dá)，但hBD-3在體內(nèi)的抗菌活性還有待進(jìn)一步探討。

病原微生物感染后，首先被宿主細(xì)胞膜上的Toll樣受體識(shí)別[11,12]。參與識(shí)別細(xì)菌的主要模式識(shí)別受體是TLR2和TLR4。TLR2主要識(shí)別細(xì)菌的各類(lèi)脂蛋白，而TLR4主要識(shí)別多糖[13]。有研究表明，肺炎克雷伯菌CPS可通過(guò)TLR4誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表達(dá)促炎性細(xì)胞因子[1]。本研究通過(guò)RNA干擾TLR4后發(fā)現(xiàn)，CPS對(duì)hBD-3的誘導(dǎo)能力明顯降低。這表明hBD-3受TLR4的介導(dǎo)。TLR4激活后，可活化絲裂原活化蛋白激酶如p38、ERK1/2和JNK，但本研究發(fā)現(xiàn)盡管CPS可誘導(dǎo)p38、ERK1/2和JNK磷酸化，但采用p38和ERK1/2抑制劑處理后，對(duì)hBD-3的誘導(dǎo)水平并無(wú)顯著影響，而抑制JNK后，hBD-3水平顯著降低，這表明JNK直接參與hBD-3的表達(dá)。本研究的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是NF-κB并不參與調(diào)控CPS誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)，相比之下，hBD-3主要受AP-1的調(diào)控，本研究通過(guò)檢測(cè)c-Jun磷酸化以及染色質(zhì)共沉淀也證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)肺炎克雷伯菌致病物質(zhì)CPS可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞表達(dá)hBD-3，后者可能是機(jī)體拮抗并清除病原微生物的機(jī)制。該機(jī)制有賴(lài)于TLR4/JNK/AP-1通路，最終導(dǎo)致hBD-3的表達(dá)而參與免疫應(yīng)答。