王 健 趙 碩 任博環(huán)

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，錦州 121001)

急性腎損傷(aucte kiney injury,AKI)是指在短時間內(nèi)患者腎功能急劇降低的情況，在化療患者中常見的并發(fā)癥，發(fā)生率約為10%～15%。臨床研究結(jié)果表明，合并AKI患者的死亡率和化療失敗率均顯著增加，這是由于化療藥物本身是一種腎毒性藥物，而腎毒性則是導(dǎo)致AKI的主要因素之一[1]。順鉑曾是臨床上治療實體瘤最為廣泛的一線化療藥物之一，但現(xiàn)代藥理學研究證實順鉑不僅能抑制腫瘤細胞DNA合成，還具有較強的腎毒性，可對動物和人類的腎小管造成嚴重的損害，使其在臨床的應(yīng)用受到限制[2]。近年來，大量藥理學研究也關(guān)注如何通過聯(lián)合應(yīng)用藥物減小順鉑的腎毒性，從而增加其臨床治療的安全性。研究表明，順鉑腎毒性的機制主要包括抑制DNA合成、跨膜累積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激活細胞凋亡途徑等，若通過使用某種藥物，減少順鉑帶來的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并對腎細胞起到保護作用，則能有效地抑制順鉑的腎毒性[3]。相關(guān)報道指出，在30年前，谷胱甘肽前體N-乙酰半胱氨酸已經(jīng)被應(yīng)用于治療氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)引起的慢性疾病如酒精肝等，而這些疾病產(chǎn)生的原因恰恰為谷胱甘肽水平減少和抗氧化能力缺乏，與順鉑導(dǎo)致腎毒性的機制符合，這也給臨床通過聯(lián)合用藥減少順鉑腎毒性及探討其機制帶來了新的研究思路。本研究通過動物實驗分析探討了N-乙酰半胱氨酸對于順鉑誘導(dǎo)的腎毒性和腎損傷的保護功能及其機制，旨在為臨床藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 順鉑注射液(國藥準字：H20030675；生產(chǎn)廠家：南京制藥廠；規(guī)格：20 ml∶20 mg)，N-乙酰半胱氨酸購自北京阿匹斯生物科技有限公司(貨號：AC0001A)，PBS溶液和生理鹽水購自海標科技有限公司均為超純級，Scr、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)均采用雙抗夾心法測定，小鼠Scr、TNF-α GSH-PX(谷胱甘肽-過氧化物酶)ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽[貨號：SBJ-M0081(Scr)；SBJ-M0030(TNF-α)；SBJ-M0019(GSH-PX)]；小鼠BUN ELISA檢測試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司(貨號：JEB-12858)。

1.1.2儀器 TD-4M型實驗用低速離心機(BIOBASE產(chǎn)品)，MDF-C8V(N)型-80℃超低溫冰箱、-20℃冰箱(日本SANYO產(chǎn)品)，680型全自動酶標儀(美國BIO-RAD產(chǎn)品)，CX-23型生物顯微鏡(日本Olympus產(chǎn)品)，CPA225D型電子分析天平(德國賽多利斯產(chǎn)品)，KL型石蠟包埋機(國產(chǎn)湖北康龍電子科技公司產(chǎn)品)。

1.1.3動物 選擇10月齡的健康BALB/c小鼠200只，清潔級(SPF)，雌雄各半，體重(28±2)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，用于AKI建模及后續(xù)給藥研究，在溫度(22±1)℃、濕度(55±10)%條件下用顆粒飼料、自來水喂養(yǎng)，各組小鼠自由進食、飲水，明暗交替時間為各12 h，每5只同性別小鼠同籠飼養(yǎng)，定期對飼養(yǎng)室進行清潔消毒，試驗結(jié)束后處死小鼠并進行焚燒處理。

1.2方法

1.2.1順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠模型(AKI)的構(gòu)建 選擇BALB/c健康小鼠200只，隨機分為2組，各100只，在動物房內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在最后一次進食12～15 h，模型組60只腹腔注射20 mg/kg的順鉑(順鉑注射液由生理鹽水稀釋至濃度1 g/L)，對照組60只注射等體積無菌生理鹽水，每日給藥1次，給藥第3天，每只小鼠在眼內(nèi)眥靜脈叢抽取眼球血1 ml，送至病理檢驗科測定血清Scr、BUN水平，并做腎臟組織切片PAS染色，顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞排列疏松、腫脹、呈空泡狀、擴張、刷狀緣部分壞死、脫落，但腎小球未見病變情況，與對照組有顯著差異，模型組Scr水平為對照組的10～20倍、BUN水平為對照組的3～5倍，且經(jīng)多次試驗確定能穩(wěn)定造模，建立AKI小鼠模型。

1.2.2分組處理方法 AKI造模完成后，從模型組100只小鼠中選取60只作為動物實驗對象，雌雄各半，并依據(jù)小鼠性別采用分層隨機抽樣分為6組，各10只，每組小鼠雌雄各半。在AKI模型建立7 d后，A組給予5 mg/kg順鉑，B組給予250 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸，C組給予5 mg/kg順鉑+250 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸；D組給予500 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸；E組給予5 mg/kg 順鉑+500 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸，F(xiàn)組注射生理鹽水做對照，腹腔注射給藥，每天1次，每次注射100 ml，順鉑、N-乙酰半胱氨酸注射液均根據(jù)每次注射體積由生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3血生化指標、炎癥因子的檢測 在各組小鼠給藥7 d后，經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈叢對每只小鼠抽取眼球血1 ml，取樣后加入1.5 ml離心管中，以4 000 r/min離心10 min分離血清，在2 h內(nèi)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測眼球血血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)含量。對于不能立即檢測的血清樣本則梯度降溫保存在4℃、-20℃、-80℃環(huán)境下，最終在-80℃超低溫冷凍箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4小鼠腎臟組織病理PAS染色和腎損評分 給藥7 d后，采用乙醚對小鼠進行麻醉，麻醉后，打開腹腔、胸腔，充分暴露膀胱，用移液器吸凈膀胱殘留尿液，暴露腹主動脈、下腔靜脈，經(jīng)左心室、腹主動脈灌注20 ml預(yù)冷PBS溶液，并剪斷下腔靜脈，觀察腎臟顏色變白后立即摘除雙側(cè)腎臟，處死小鼠。取腎臟冠狀位前1/2組織，用4%多聚甲醛固定20 h，后經(jīng)脫水、浸蠟、包埋處理做成腎臟組織切片，水化后做HE染色，由病理科醫(yī)師雙盲情況下每個切片選擇5個視野區(qū)域以10倍顯微鏡頭觀察腎小管、腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)，若出現(xiàn)腎小管擴張、刷狀緣脫落、腎細胞壞死、空泡化等情況則評價為出現(xiàn)腎組織損傷。最后根據(jù)損傷面積和范圍對每只小鼠進行腎損傷評分：0分：無損傷；1分：損傷面積<10%；2分：損傷面積為10%～25%；3分：損傷面積為26%～50%；4分：損傷面積為51%～75%；5分：損傷面積>75%。

2 結(jié)果

2.1N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠臨床指標的影響

2.1.1N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠眼球血血清Scr、BUN水平的影響 表1中的對比結(jié)果顯示，給藥前，6組小鼠血清Scr、BUN水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，給藥7 d后，6組Scr、BUN水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：A組>F組>C組>E組>B組>D組，而與治療前相比，A組顯著增加(P<0.05)；B組、D組、E組顯著降低(P<0.05)，C組、F組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 給藥前后6組AKI小鼠眼球血血清Scr、BUN水平比較Tab.1 Comparison of serum Scr and BUN levels in 6 groups AKI mice before and after

Note：Compared with before administration，group A,B,C,D,E,F，Scr value:t=3.193，P>0.05;t=37.209，P<0.05;t=1.425，P>0.05;t=36.524，P<0.05;t=25.524，P<0.05;t=1.623，P>0.05.Compared with before administration,group A,B,C,D,E,F,BUN value:t=2.424，P>0.05;t=12.422，P<0.05;t=1.562，P>0.05;t=15.446，P<0.05;t=9.262，P<0.05;t=1.834，P>0.05.

2.1.2N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠眼球血血清炎癥因子水平的影響 給藥前，6組小鼠血清TNF-α、GSH水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，給藥7 d后，6組TNF-α、GSH水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：①TNF-α：A組>F組>C組>E組>B組>D組，而與治療前相比，A組顯著增加(P<0.05)；B組、D組、E組顯著降低(P<0.05)，C組、F組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；②血清GSH：A組0.05)，E組、B組、D組顯著增加(P<0.05)，相關(guān)資料見表2。

表2 給藥前后6組AKI小鼠眼球血血清TNF-α、GSH水平比較Tab.2 Comparison of serum TNF-α and GSH levels in 6 groups AKI mice before and after

Note：Compared with before administration，group A，B，C，D，E，F(xiàn)，TNF-α value:t=2.937，P>0.05；t=8.378，P<0.05；t=1.749，P>0.05；t=9.738，P<0.05；t=3.524，P<0.05；t=1.362，P>0.05.Compared with before administration,group A,B,C,D,E,GSH value:t=9.472，P<0.05；t=4.173，P<0.05；t=1.156，P>0.05；t=5.736，P<0.05；t=5.734，P<0.05；t=1.761，P>0.05.

2.2N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠腎損傷程度的影響

2.2.1N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠腎損傷評分的影響 給藥后與給藥前相比，RIS改善水平：A組0.05)，表明N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠腎臟組織具有保護作用，見表3。

表3 給藥前后6組AKI小鼠腎組織損傷評分比較(分，Tab.3 Comparison of renal tissue damage scores of 6 groups of AKI mice before and after administration

Note：Compared with before administration，group A，B，C，D，E，F(xiàn)，t=3.332，P<0.05；t=13.262，P<0.05；t=0.828，P>0.05；t=21.549，P<0.0 5；t=6.893，P<0.05；t=0.491，P>0.05.

圖1 給藥后6組小鼠腎臟組織病理PAS染色圖(×10)Fig.1 Histopathological PAS staining of 6 groups of mice after administration (×10)Note:A.Group A;B.Group B;C.Group C;D.Group D;E.Group E;F.Group F.

2.2.2N-乙酰半胱氨酸對于AKI小鼠腎組織病理學檢查結(jié)果的影響 給藥前，6組AKI小鼠的腎臟PSA染色圖可見腎小管擴張、上皮腫脹、細胞排列疏松、空泡變性，但腎小球未見顯著損壞，與圖1中給藥后的F組空白對照組情形相同；給藥后，給予順鉑的小鼠腎臟PAS染色圖除具有AKI小鼠腎臟損傷特征外，腎小球邊緣細胞出現(xiàn)壞死脫落，腎小球體積改變，顏色加深，與圖1中給藥后A組情形相同；而在給藥后，給予 N-乙酰半胱氨酸的4組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)則出現(xiàn)一定改觀和修復(fù)，原損傷部位顏色變淺、深色面積縮小，特別是圖1中的B組和D組，腎臟損傷面積、壞死細胞比例明顯低于同時給予順鉑的C組和E組。

3 討論

順鉑作為常用的化療藥物之一，腎毒性是順鉑化療中頻率最高、最為嚴重的不良反應(yīng)，可影響化療順利進行、縮短患者生存時間。研究表明，順鉑所致腎毒性可引發(fā)急性腎損傷，其重要機制包括氧化應(yīng)激、跨膜累積、炎癥反應(yīng)、P53蛋白介導(dǎo)的細胞凋亡途徑等，也有觀點認為，順鉑腎毒性即自由基毒性和過氧化物毒性[4]。但順鉑對于惡性腫瘤具有廣譜抗性和強效抑制作用，在化療治療中不可或缺，通過聯(lián)合用藥減輕順鉑腎毒性、增強順鉑應(yīng)用的安全性，也是近年來藥理學研究中的熱點問題。

谷胱甘肽是機體細胞中的重要代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與三羧酸循環(huán)，其活性巰基是重要官能團，具有抗氧化應(yīng)激、清除自由基、抑制細胞凋亡等藥理作用，可有效對抗順鉑腎毒性的相關(guān)機制如氧化應(yīng)激、細胞凋亡等。但谷胱甘肽屬于小分子肽，口服或靜滴給藥的生物利用度差，N-乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前體，注射給藥后在人體代謝過程中能分解為谷胱甘肽，更高效地阻斷P53蛋白介導(dǎo)的腎細胞凋亡途徑、提高腎細胞抗氧化應(yīng)激能力、清除過氧化物、自由基毒性物質(zhì)，在臨床上，N-乙酰半胱氨酸也有被應(yīng)用于治療急性腎衰竭的經(jīng)驗[5]。

因此，近年來，大量動物試驗都將N-乙酰半胱氨酸作為緩解順鉑腎毒性的有效藥物并研究其對于順鉑腎毒性的緩解效果，但關(guān)于順鉑導(dǎo)致腎損傷、腎毒性的動物試驗多數(shù)是將單一劑量的N-乙酰半胱氨酸(試驗組)、西米替汀(陽性對照組)、健康組(陰性對照組)加以比較，觀察指標則主要為肌酐、尿素氮等常見指標[6，7]，上述研究不足之處和本文的創(chuàng)新之處在于：①研究文獻中的對照組試驗是獨立的，對象為健康小鼠，并未在AKI模型中給藥，本研究首次選取AKI模型小鼠給藥，所有給藥處理均在相同平臺上進行，可得到較為新穎的結(jié)論；②傳統(tǒng)研究缺少濃度梯度試驗，無法證明不同劑量的N-乙酰半胱氨酸對于順鉑所致的腎損傷的保護能力差異。本研究中首次將N-乙酰半胱氨酸根據(jù)劑量分為兩組，并引入兩組順鉑+N-乙酰半胱氨酸做梯度對照，研究結(jié)果表明：給藥7 d后，6組Scr、BUN、TNF-α和GSH改善水平有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：A組>F組>C組>E組>B組>D組，說明N-乙酰半胱氨酸可促進AKI小鼠血清炎癥因子水平改善、提高腎臟抗氧化應(yīng)激能力。這個結(jié)果不僅證實了高劑量的N-乙酰半胱氨酸對順鉑所致腎毒性的保護作用強于低劑量的N-乙酰半胱氨酸，還證實了N-乙酰半胱氨酸與順鉑同時聯(lián)用有助于減輕腎毒性，且不同的N-乙酰半胱氨酸劑量對于順鉑腎毒性的保護作用也不同；③傳統(tǒng)研究的觀察指標相對單一，本研究中引入了腎組織損傷病理評分標準、氧化應(yīng)激指標GSH、炎癥因子TNF-α，并結(jié)合PAS染色圖對AKI小鼠腎損傷程度的改善水平進行了綜合對比分析，觀察指標更加全面，本研究結(jié)果也表明，這些指標的研究結(jié)論也高度一致。

總之，本研究通過6組AKI小鼠進行對照給藥試驗，證實了N-乙酰半胱氨酸可減輕因順鉑導(dǎo)致的小鼠腎毒性和腎損傷程度，對腎臟具有保護作用，且動物實驗的療效與N-乙酰半胱氨酸的劑量有高度相關(guān)性，其機制則與N-乙酰半胱氨酸具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等藥理作用有關(guān)。不過本研究中并未涉及相關(guān)靶蛋白如C5aR、P53等的表達檢測、免疫熒光等生物學實驗，研究仍不夠深入，應(yīng)在接下來的工作中進一步探討。