韓美娟 牛 凱 婁運(yùn)偉 王 輝

(河南省免疫與靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)和Crohn′s氏病(Crohn′s disease)，是一組腸道炎癥性疾病，其病因尚不清楚，目前認(rèn)為炎癥性腸病的發(fā)生主要與遺傳、免疫、腸道菌群和環(huán)境等因素有關(guān)[1,2]。盡管大部分研究已經(jīng)表明，正常生理狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)有較多信號(hào)通路參與并維持正常腸道上皮細(xì)胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)，然而對(duì)于腸道組織在外界應(yīng)激及損傷狀態(tài)下恢復(fù)其穩(wěn)定狀態(tài)的機(jī)制研究還較為匱乏[3]。

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白8(tumor necrosis factor-α induced protein-8,TNFAIP8或TIPE)家族是近些年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族，主要由4組成員構(gòu)成：TNFAIP8(TIPE)、TIPE1(TNFAIP8-like 1，TNFAIP8L1)、IPE2(TNFAIP8-like 2，TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3-like 3， TNFAIP8L3)，家族成員之間具有其獨(dú)特的蛋白結(jié)構(gòu)及高度同源的蛋白序列。但TIPE家族成員間也存在著細(xì)微的蛋白結(jié)構(gòu)差異，并且在機(jī)體組織中的表達(dá)也存在差異，提示其家族成員在不同組織中有不同的生物學(xué)功能[4]。

TIPE也被稱為SCCS2、GG21或MDC3.13，是TNFAIP8家族最早被發(fā)現(xiàn)的成員。TIPE被首次發(fā)現(xiàn)是在人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (head and neck squam-ous cell carcinoma,HNSCC)患者及來自該患者的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系[1]。TIPE在人的淋巴組織中表達(dá)相對(duì)較高，在肺、胸腺、脾臟組織表達(dá)相對(duì)較低[1]。TIPE在腫瘤領(lǐng)域研究的較為廣泛，但目前對(duì)TIPE的生理作用包括在腸道組織中的作用知之甚少。本研究旨在探究TIPE在小鼠腸道組織中的表達(dá)特點(diǎn)和表達(dá)調(diào)節(jié)變化。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡的WT雄性小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠均飼養(yǎng)于無特定病原體級(jí)環(huán)境中。

1.1.2主要的試劑與儀器 葡聚糖硫酸酯鈉鹽(dextran sodium sulfate，DSS)(相對(duì)分子量為36 000～50 000)購自美國MP Biomedicals公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；β-actin抗體和TIPE抗體(貨號(hào)為66009-1和15790-1)、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗購自Proteintech公司(貨號(hào)分別為SA00001-1和SA000 01-2)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymer-ase chain reaction,PCR)儀購自上海賽默飛世爾科技有限公司；Citrobacter rodentium菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2方法

1.2.1取材 頸椎脫臼處死小鼠，取全十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸測量其長度。用剪刀將其剖開，PBS漂洗。取3 cm進(jìn)行研磨后放于-80℃保存， Western blot檢測蛋白表達(dá)。再取1.0 cm加入1 ml TRIzol，放于-80℃保存,實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA表達(dá)。

1.2.2分離結(jié)腸上皮細(xì)胞 用冷PBS沖洗結(jié)腸并切成小塊，將切成小段的結(jié)腸在含 EDTA-DTT的HBSS緩沖液中37℃緩慢搖動(dòng)20 min，用70 μm的濾器過濾后，取上清液，通過離心獲取單細(xì)胞。經(jīng)上皮細(xì)胞特異性的抗體EpCam染色后確定，約85%以上的細(xì)胞都是EpCam 陽性的結(jié)腸上皮細(xì)胞。根據(jù)需要，分離的結(jié)腸上皮細(xì)胞，-80℃保存,行Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

1.2.3Real-time PCR 細(xì)胞中總RNA的抽提使用Invitrogen的TRIzol試劑，并嚴(yán)格按照操作手冊(cè)操作?；蜣D(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增使用Applied Biosystems的7500 Fast Real-time PCR System，PCR程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。所用引物序列如表1所示。

1.2.4Western blot 將細(xì)胞收集后，提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA Kit測定蛋白濃度，用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，孵育一抗，4℃過夜。用TBST洗膜液洗膜3次后，孵育二抗，室溫孵育1 h，最后用TBST洗滌3次后用發(fā)光液進(jìn)行曝光。

1.2.5DSS處理小鼠 配制DSS溶液：稱取適量DSS于蒸餾水中，配制成3.0%濃度(w/v)的DSS溶液，配制好的溶液儲(chǔ)存于4℃冰箱，要求現(xiàn)配現(xiàn)用。以3.0%DSS喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，每天觀察小鼠的疾病變化，在不同的時(shí)間點(diǎn)處理小鼠，收集樣本。

1.2.6Citrobacter rodentium灌胃 小鼠在Citrob-acter rodentium灌胃之前饑餓過夜，記錄小鼠灌胃前的體重，用無菌灌胃針對(duì)小鼠實(shí)施灌胃，每只小鼠灌胃約200 μl，其菌量約為2×109的Citrobacter rodentium。灌胃之后小鼠保持正常飲食，每隔2 d記錄一次小鼠體重變化，在不同的時(shí)間點(diǎn)處理小鼠，收集樣本。

2 結(jié)果

2.1TIPE在結(jié)腸組織中高表達(dá) 首先檢測TNFAIP8家族成員TNFAIP8(TIPE)、TIPE1、TIPE2和TIPE3在結(jié)腸組織中的相對(duì)表達(dá)，在整個(gè)家族成員中，TIPE和TIPE1的表達(dá)比TIPE2的表達(dá)高，而TIPE3的表達(dá)最低(圖1A)，此外實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與其他家族成員相比，TIPE在結(jié)腸中表達(dá)最高(圖1B)。

圖1 TNFAIP8家族基因在小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of TNFAIP8 family gene in mouse colon tissueNote:A.The total RNA of distal colon tissue of WT mice was extracted,and the mRNA expression level of TNFAIP8 family members was detected by RT-PCR.β-actin was used as an internal reference gene；B.Real-time quantitative PCR for quantifying mRNA expression.These are 3 test results.The graphical data is the relative expression level of the

2.2TIPE在結(jié)腸上皮細(xì)胞中表達(dá)最高 從正常小鼠中分別提取出十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織中的上皮細(xì)胞，與十二指腸、空腸和回腸組織中的上皮細(xì)胞相比，Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，TIPE在結(jié)腸上皮細(xì)胞中表達(dá)最高(圖2A、B)。

圖2 TIPE在小鼠腸道組織上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of TIPE in mouse intestinal epithel-ial cellsNote:A.Total RNA was extracted from epithelial cells of duodenum,empty,ileum and colon of WT mice.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of TIPE mRNA in these epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene.These are 3 test results.The data shown the relative expression levels of the protein was extracted from epithelial cells of duodenum,empty,ileum and colon of WT mice.Western blot was used to detect the expression levels of TIPE in tissue epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene(n=5).These are 3 test results.

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in Real-time PCR

2.3TIPE在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥中表達(dá)上調(diào) 以3.0%DSS喂養(yǎng)WT小鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，在不同的時(shí)間點(diǎn)提取小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞，RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著DSS誘導(dǎo)時(shí)間的延長，TIPE在結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)(圖3A、B)。

2.4TIPE在Citrobacter rodentium誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥中表達(dá)上調(diào) 用Citrobacter rodentium對(duì)WT小鼠灌胃誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，在不同的時(shí)間點(diǎn)提取小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞，RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，TIPE在結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)(圖4A、B)。

圖4 TIPE在Citrobacter rodentium感染誘導(dǎo)腸炎過程中在小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)Fig.4 Up-regulation of TIPE expression in mouse colonic epithelial cells during Citrobacter rodentium infection-induced enteritisNote:A.Infecting WT mice with Citrobacter rodentium to induce experimental colitis.The mice were sacrificed at different time points,and total RNA from epithelial cells of mice colon tissue was extracted.Detecting the expression level of TIPE by RT-PCR,β-actin was used as an internal reference gene；B.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of TIPE mRNA in these tissue epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene.These are 3 test results.The data shown the relative expression levels of the

3 討論

大部分研究發(fā)現(xiàn)TIPE在正常生理過程及病理過程中發(fā)揮著很重要的作用，如調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素對(duì)T細(xì)胞凋亡的影響[5]，通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-1β和GM-CSF細(xì)胞因子的產(chǎn)生來抵抗細(xì)菌的感染[6]，通過激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin,mTOR)激酶保護(hù)多巴胺神經(jīng)元氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[7]，調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的增殖[8]。但對(duì)TIPE在腸道中的生理作用及其具體機(jī)制的研究甚少。

近年來隨著我國生活水平、飲食習(xí)慣的改變，以及結(jié)腸鏡的普遍應(yīng)用和對(duì)疾病的深入認(rèn)識(shí)，我國IBD的就診人數(shù)與日俱增，其發(fā)病率在近20年間增長近10倍[9]。在臨床上，IBD的發(fā)病與多種因素有關(guān)。IBD患者的臨床表現(xiàn)為腹瀉、黏液血便及腹痛等，病程呈慢性疼痛期與緩解期交替出現(xiàn)，可伴有較多的其他腸道性并發(fā)癥,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[10]。腸道上皮細(xì)胞完整性的維持在保護(hù)機(jī)體抵抗外界干擾，如藥物、抗原和微生物等的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，上皮細(xì)胞死亡增加和增殖能力降低與DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生密切相關(guān)[11-13]。IBD的發(fā)生主要集中在結(jié)腸部位，而本研究證明了TIPE無論在結(jié)腸組織還是結(jié)腸上皮細(xì)胞中均表達(dá)較高。并且在構(gòu)建的兩種試驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中TIPE在結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達(dá)量隨著DSS處理或Citrobacter rodentium感染時(shí)間的延長也隨之增加。這些研究結(jié)果提示TIPE可能在DSS 或Citrobacter rodentium感染誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中起著重要的調(diào)控作用，我們推測在結(jié)腸炎過程中，TIPE表達(dá)水平上調(diào)可能發(fā)揮重要的保護(hù)性作用，增強(qiáng)結(jié)腸上皮細(xì)胞抵抗細(xì)胞死亡的能力，從而促進(jìn)受損的腸道有效快速修復(fù)，其具體的作用機(jī)制有待更深入的研究。