王 亮 司 萍綜述 沈永明審校

天津市兒童醫(yī)院檢驗科（天津 300074）

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種常見的兒童全身性血管炎綜合征，多見于5 歲以下嬰幼兒，目前發(fā)病率最高的是日本、韓國和臺灣[1]。KD 的典型臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、皮疹、黏膜炎以及心血管損傷等冠狀動脈損傷（coronary artery lesions，CAL）。KD 可累及冠狀動脈，引起冠狀動脈擴張、心肌炎、血栓形成，若得不到及時治療，嚴重者可導致死亡。目前KD 的診斷主要依據(jù)臨床癥狀，但易與其他一些兒童自愈性疾病相混淆，包括麻疹、腺病毒感染、猩紅熱、登革熱。如果KD 的臨床表現(xiàn)不明顯，特別是不完全性KD，容易發(fā)生漏檢。靜脈注射丙種球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）已成為指南推薦的KD治療 首選方案，但大約10%～20%的患兒在單次IVIG 后無反應，而IVIG無反應型KD發(fā)生CAL的風險更 高[2]。目前KD病因尚不清楚，普遍認為與感染、免疫，細胞因子損傷及遺傳易感性等多種因素相關。本文重點介紹KD 診斷相關生物學標志物的研究現(xiàn)狀，并敘述其在疾病診斷和評估疾病嚴重程度中的作用。

1 炎癥標志物

KD 患者的炎癥標志物水平隨疾病進展發(fā)生變化。研究報道，KD急性期患者的紅細胞沉降率、血小板數(shù)升高，并且急性期有白細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)增多，其程度與心功能不全有關[3]。C反應蛋白作為炎癥標志物，與KD疾病嚴重程度和CAL的發(fā)展也有顯著關系。KD患兒處于急性期時C反應蛋白顯著升高，當炎癥得到控制后其含量又會降低，有可能作為疾病治療和預后觀察的指標。研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素原水平在KD急性期升高，并且IVIG無反應型KD患兒升高更加明顯[4]。外周血嗜酸性粒細胞增多和低白蛋白與 IVIG無反應以及冠狀動脈并發(fā)癥的風險增加有關[5-6]。平均血小板體積、血小板分布寬度降低和血小板衍生微 粒已被證明是KD急性期血小板活化和炎癥的標志[7-8]。炎癥標志物在很大程度上是非特異性的，因為這些標志物在許多其他炎癥和感染條件下也會升高。這些生物標志物可以反映KD 機體持續(xù)的炎癥狀態(tài)，但在作出明確診斷方面仍作用有限。

2 免疫標志物

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）作為最強的抗原提呈細胞，是連接固有免疫與適應性免疫的橋梁，其細胞數(shù)的動態(tài)變化會引起機體免疫狀態(tài)變化。研究報道，在KD急性期外周血中髓細胞型DCs水平升高，而漿細胞型DCs 升高不明顯[9]，這提示KD 患兒可能存在免疫耐受。KD急性期CD8+T細胞數(shù)量減少，但早期T細胞活化標志CD8+CD69+T細胞增加，晚期T細胞活化標志CD 8+HLA-DR+T 細胞未見明顯增加，CD8+CD69+T細胞可作為病情進展的指標[10]。KD動物模型的冠狀動脈免疫組織化學研究表明，CD8+T細胞存在于受損的冠狀動脈內(nèi)，并且與炎癥性血管炎有關[11]。研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞活化和抑制失衡可能與KD發(fā)病機制相關，IVIG抑制CD8+T細胞的活化，但CD8+T細胞的過度激活可能引起IVIG無反應，CD8+HLA-DR+T細胞/CD8+CD69+T細胞比值可作為預測IVIG 敏感性的指標[12]。急性期KD 患兒存在明顯的輔助性T 細胞17(Th 17)和調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）失衡[13]，Th17比例上調(diào)，而Treg比例下調(diào)。這些結果提示KD患者機體存在免疫系統(tǒng)失衡，特別是CD8相關免疫系統(tǒng)，進而導致機體免疫功能紊亂。

近年來，關于KD 急性期的促炎和抗炎細胞因子的研究多有報道。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中細胞因子IL-17，IL-23以及Th1/Th2細胞因子，包括IFNγ、IL-10、IL-6、IL-4 在KD 急性期均有升高[13-14]，并且血漿中Th1/Th2 細胞因子可用于疾病診斷和治療效果評價。血管內(nèi)皮生長因子、IL-6是KD發(fā)生CAL的重要危險因素[15]。急性期KD 患兒sCD 40 L、E-選擇素、CCL 23、CXCL 10 表達均高于對照組[16]。腫瘤壞死因子（TNF-α）在招募炎癥細胞到冠狀動脈內(nèi)皮的過程以及CAL發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前TNF-α阻斷劑應用于KD的治療也得到廣泛研究[17]。這些研究可以為KD 疾病診斷提供生物標記物，同時也提示KD 機體存在某些級聯(lián)反應，由于機體免疫功能異常，可能導致KD急性期的炎癥上調(diào)以及IVIG無反應。

3 蛋白標志物

3.1 氨基末端腦鈉肽前體

氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）是一種無生物活性的肽段，是由心室肌細胞分泌的腦鈉肽前體降解而成的，是心肌細胞應激的標志。急性期KD 患兒存在心肌損害，因此NT-proBNP 作為一種潛在的生物標志物得 到廣泛研究。Meta分析發(fā)現(xiàn)，NT-proBNP截斷值為190 pg/mL和260 pg/mL時，診斷KD的靈敏度為89%和93%，特異度為0.69和0.88[18]。而NT-proBNP截斷值為1 300 pg/mL，診斷KD患兒CAL的靈敏度和特異度分別為95%和85%，NT-proBNP截斷值為800 pg/mL，診斷KD 患兒IVIG 無反應的靈敏度和特異度分別為71%和62%[19]。NT-proBNP截斷值為1025 pg/mL，診斷急性期KD 靈敏度為88%，特異度為96%[20]。根據(jù)患兒年齡不同而設定不同的NT-proBNP 界值，發(fā)現(xiàn)NT-proBNP 在不同年齡段中診斷的特異度和靈敏度存在差異[21]。但目前對依據(jù)年齡來確定界值仍存在爭議，因為血清NT-proBNP 水平存在一定的年齡依賴性，一般在嬰幼兒期最高，之后降低。此外應用NTproBNP診斷KD時，必須首先排除其他心臟疾病的存在，因為其他心臟疾病患者中也存在NT-proBNP水平增加[22]。

3.2 其他KD相關蛋白標志物

凝血酶致敏蛋白（thrombospondin，TSP）是首次從凝血酶刺激后的血小板細胞膜中分離的糖蛋白，但此后研究證實，體內(nèi)多種細胞均可產(chǎn)生TSP。TSP包含5種亞型，其中TSP-2與KD關系得到廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期血漿TSP-2水平明顯升高，而在IVIG無反應型KD 患兒血漿中TSP 水平更高。當TSP-2 的截斷值為31.50 ng/mL時，其預測IVIG無反應的靈敏度為82.35%，特異性度64.81%[23]。骨膜蛋白（periostin）是一種調(diào)節(jié)心血管損傷反應的基質(zhì)細胞蛋白，與其他發(fā)熱患兒相比，KD 急性期和慢性期患兒冠狀動脈中骨膜蛋白含量增加[24]?？扇苄陨L刺激表達基因2蛋白（suppression of tumorigenicity-2，ST2）主要以2種亞型存在，跨膜或細胞形式的ST2（ST2L）以及可溶性或循環(huán)形式的ST2（sST2），可反映心血管應激和心肌纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，sST2在KD急性期升高，其水平與心肌舒張功能受損有關；此外KD急性期患兒心肌肌鈣蛋白I 水平顯著升高，提示心肌細胞應激反應和細胞死亡與急性期KD患兒的心肌炎癥有關[25]。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期患兒體內(nèi)誘導型一氧化氮合酶（nitric oxide synthases，iNOS）、硫化氫（H2S）水平較對照組明顯升高，但有CAL的KD患兒的iNOS表達水平明顯高于無CAL的KD患兒，而H2S與之相反，聯(lián)合應用i-NOS（＞10 U/mL）和H2S（＜3.31 μmol/L）預測冠狀動脈擴張的靈敏度為80%，特異度為81%，因此有可能用于指導臨床治療，預防CAL的發(fā)生[26]。簇蛋白（clusterin）是高密度脂蛋白的一部分，對于維持冠狀動脈壁的完整性發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，KD患兒血漿簇蛋白＜12 mg/L與CAL發(fā)生發(fā)展相關[27]。細胞粘合素C（tenascin-C，TN-C）是近年來發(fā)現(xiàn)的新型細胞外基質(zhì)成分之一，是組織損傷和炎癥的標志。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期TN-C表達水平與心血管炎癥程度相關[28]。

目前已知報道的KD相關的幾種蛋白質(zhì)生物標志物仍處于早期發(fā)現(xiàn)階段，并且大多數(shù)研究結果是建立在單個中心的小樣本研究對象之上，需要在更大的人群進行驗證，才能將其應用于臨床。此外NT-proBNP被認為是可進行床旁KD 診斷的理想指標。但KD 可能與其他伴有心功能障礙的發(fā)熱疾病相混淆。因此NT-proBNP用于KD診斷時，必須首先排除其他心臟相關疾病。

4 KD易感基因

日本、韓國和中國臺灣的KD 的發(fā)病率高于西方國家。這種差異提示遺傳易感性，或反映環(huán)境或生活方式的差異。同時，亞洲人群中KD 患兒的同胞和有過KD病史的父母的后代的KD發(fā)病率分別是普通人群的6～10倍和2倍[29]。研究發(fā)現(xiàn)，在夏威夷定居的日本裔美國人中，KD 的發(fā)病率與日本本地的發(fā)病率相當，進一步指向KD 可能的遺傳關聯(lián)[30]。因此KD 可能是一種多基因復雜性疾病，隨著與KD 相關的易感基因的研究，為KD的診斷提供了新的方向。

4.1 CD40基因

CD40是相對分子量質(zhì)量48 000的細胞表面受體，其基因定位于20 q 11，屬神經(jīng)生長因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族。CD 40-CD 40 L 配基化參與炎癥反應過程。與發(fā)熱對照組相比，KD 患兒CD 4+T 細胞上CD 40配體的表達水平較高。這種過度表達在IVIG治療后下降[31]，這意味著CD 40-CD 40 L 相互作用可能參與KD 的冠脈炎癥改變。目前CD 40基因是與KD發(fā)生相關的全基因組關聯(lián)分析研究（genome-wide association study，GWAS）連鎖的基因位點之一。GWAS分析顯示，CD 40的功能性單核苷酸多態(tài)位點（ainge nucleotide polymorphisms，SNP）與KD的發(fā)病相關，其中漢族人群中發(fā)現(xiàn)CD 40基因SNP 位點（rs 4813003、rs1535045）與KD的易感性相關[32]。

4.2 1,4,5 三磷酸肌醇3 激酶C（inositol 1,4,5-triphosphate 3-kinase C，ITPKC） 基因

ITPKC基因定位于19q13.2，是Ca2+/NFAT信號通路的第二信使分子，在免疫活化和T 細胞受體信號傳導過程中發(fā)揮重要作用。ITPKC多態(tài)性影響T細胞活化，可能導致炎癥性T 細胞在急性期持續(xù)作用。GWAS 分析顯示，ITPKC基因的單核苷酸多態(tài)性與KD 易感性相關，ITPKC基因功能性SNP rs 28493229的C等位基因可能增加KD的發(fā)生風險[33]。ITPKC中的SNP rs7251246與KD嚴重程度相關，并與CAL發(fā)生有顯著關聯(lián)[34]。然而，也有研究報道，ITPKC基因功能性SNP rs28493229與臺灣地區(qū)KD發(fā)生風險之間沒有顯著關聯(lián)[35]。

4.3 Fcγ受體ⅡA基因

Fcγ 受體ⅡA（Fc fragment of IgG receptor 2 A，F(xiàn)CGR2A）基因定位于人類染色體1q22-23，其編碼的Fc段受體主要表達于免疫細胞膜表面，其多態(tài)性可以改變FcγRⅡa與lgG的結合力。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期患兒FCGR2A mRNA表達明顯高于對照組[36]。GWAS分析顯示，F(xiàn)CGR 2 A基因與KD 易感性相關，其中FCGR 2 A基因SNP rs 1801274 與KD 易感性相關。此外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CGR2A基因SNP rsl801274與男性KD顯著相關，而與女性相關性并不明顯，這也可以進一步解釋男性KD 發(fā)病率高于女性[37]。此外，F(xiàn)CGR 2 A基因H131R多態(tài)性可能與亞洲人的KD易感性有關[38]。

4.4 其他KD相關易感基因

除上述研究較廣泛的KD 易感性相關基因外，一些其他基因也引起研究者的關注。CASP 3基因定位于人類染色體4 q 35，與細胞凋亡密切相關。已知報道CASP3基因SNP rs 72689236與KD易感性相關[39]。而ITPKC基因SNP rs28493229以及CASP3基因SNP rs113420705與IVIG無反應和CAL風險增加相關[40]。TGF-β 信號通路在炎癥、T 細胞活化和組織重塑中發(fā)揮重要作用。研究報道，KD 患兒TGF-BR 2 mRNA表達明顯高于健康對照組[41]。TGF-BR 2基因SNP rs6550004與KD易感性相關，SNP rs1495592與CAL相關[42]。B淋巴酪氨酸激酶（B lymphoid tyrosine kinase，BLK）在B細胞的信號轉導中起作用。研究報道，朝鮮族人群中BLK基因SNP rs6993775與KD易感性相關[43]。人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）主要存在于細胞膜表面。近期研究發(fā)現(xiàn)，HLA相關基因（HLA-CSNP rs9380242，HLA-BSNP rs9378199，MICA SNPrs9266669 和HCP5SNP rs6938467 ）與KD易感性顯著相關[44]。

綜上，目前關于KD 診斷相關生物學標志物的研究取得了顯著進展。炎癥標志物可以幫助用于KD的臨床診斷，但這些標志物對KD 的診斷特異性較低。蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)確定了一些與KD相關的蛋白生物標志物，但這些生物標記物仍需進一步開展多中心大樣本臨床研究才能用于診斷KD。全基因組關聯(lián)研究為KD 診斷提供新的研究方向，但研究處于發(fā)展的早期階段，需要在不同人群中進行大規(guī)模驗證，尚不足以作為KD 診斷的標準，但對于研究KD 的發(fā)病機制以及精準治療提供新的思路。