尉嘉斌 鹿洪亭

兒童惡性腫瘤嚴(yán)重危害兒童健康[1,2]。circRNA最早由Sanger[3]于1976年在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，Salzman[4]在2012年首次通過RNA測(cè)序方法在人類白細(xì)胞中檢測(cè)到了80多種circRNA。隨后，Jeck等[5]在人類纖維母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了超過25 000種circRNA，如此龐大的數(shù)據(jù)提示circRNA并不是RNA剪接過程中的偶然產(chǎn)物，而是廣泛、穩(wěn)定、高度保守地存在于人類細(xì)胞中。

一、circRNA概述

(一)circRNA分子特征

circRNA是一類穩(wěn)定的非編碼RNA分子，大多存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但少部分內(nèi)含子來源的circRNA存在于核內(nèi)。傳統(tǒng)的線性RNA含有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，但circRNA分子呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不含有5’和3’末端，表達(dá)更穩(wěn)定，不易被核酸內(nèi)切酶降解[6]。

(二)circRNA的分類

circRNA大部分由外顯子反向剪接形成，但也有小部分是由內(nèi)含子和基因間區(qū)域形成的。根據(jù)其來源分為：外顯子環(huán)狀RNA(exonic circRNAs)、 內(nèi)含子環(huán)狀RNA (intronic circRNAs)、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exon-intron circRNAs)等，具體形成機(jī)制尚不明確[7-9]。除此之外，還有一種特殊類型的circRNA,稱為tricRNA，是由前體tRNA剪接形成[10]。研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)具有年齡依賴性及組織特異性。另一種分類是根據(jù)circRNA與相鄰編碼RNA的位置不同，又可以將其分為以下5種類型?！癳xonic”由外顯子剪切而成；“intronic”由內(nèi)含子剪切而成；“antisense”指circRNA基因位點(diǎn)與線性RNA重合，由反義鏈轉(zhuǎn)錄而來；“sense overlaping”指circRNA與線性RNA轉(zhuǎn)錄自相同的基因位點(diǎn)，但不屬于外顯子型或內(nèi)含子型；“intergenic”指circRNA基因位點(diǎn)位于己知基因外[11,12]。

(三)circRNA的生物學(xué)功能

1. miRNA海綿作用 circRNA通過堿基互補(bǔ)作用,像海綿一樣吸附miRNA，這種作用形式被稱為miRNA 海綿作用。2013年，Nature上發(fā)文報(bào)道CDR1基因起源的circRNA(ciRS-7)可以結(jié)合吸附miR-7，使miR-7的活性降低，間接上調(diào)miR-7相關(guān)靶基因的表達(dá)[13]。Zheng[14]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circHIPK3可直接結(jié)合miR-124并抑制其活性。近年來，大量研究證實(shí)circRNA的miRNA海綿作用在多種組織及細(xì)胞系中普遍存在。由于circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在機(jī)體內(nèi)miRNA的吸附能力要強(qiáng)于線性RNA。

2. 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 轉(zhuǎn)錄調(diào)控是circRNA一個(gè)重要的功能。為了研究circRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的調(diào)控，Li等[9]采用交聯(lián)免疫沉淀法在HeLa細(xì)胞中鑒定出111個(gè)與RNA聚合酶Ⅱ相互作用的circRNA，并對(duì)其中的circEIF3J和circPAIP2進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HeLa及HEK293細(xì)胞中敲除circEIF3J和circPAIP2，可降低親本基因EIF3JhePAIP2的mRNA水平。再如，在小鼠中Fmn基因是肢體發(fā)育所必需的。外顯子circRNA是通過反向剪接從Fmn基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。缺乏這種剪接受體的小鼠不能檢測(cè)到外顯子circRNA的表達(dá)，雖有正常的肢體發(fā)育，但會(huì)出現(xiàn)一種不完全穿透性腎發(fā)育不全表型[15]。circRNA通過阻斷翻譯的起始位點(diǎn)，進(jìn)而減少蛋白質(zhì)的表達(dá)。

3. 與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)相互作用 研究發(fā)現(xiàn)circRNA可以與RBP直接結(jié)合形成RNA蛋白復(fù)合物,對(duì)RBP起調(diào)節(jié)作用或者通過部分堿基互補(bǔ)配對(duì)直接作用于靶基因,也可通過RNA介導(dǎo)間接與蛋白質(zhì)發(fā)生關(guān)聯(lián)，影響蛋白質(zhì)功能[16]。例如，circRNA可以穩(wěn)定地與AGO蛋白和RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，通過加強(qiáng)其功能進(jìn)而提高基因轉(zhuǎn)錄水平。也有人提出，circRNA可作為靶向元件，同時(shí)與RNA結(jié)合蛋白及與其互補(bǔ)的RNA或DNA序列結(jié)合[7]。剪接因子MBL就是一種RBP，在人類和果蠅中可結(jié)合其親本基因的第二外顯子促進(jìn)其環(huán)化形成circMBL。circMBL能與MBL結(jié)合，降低MBL有效濃度，減少circMBL生成[17]。

4. 參與蛋白質(zhì)翻譯 部分circRNA可以編碼蛋白質(zhì)。存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的肝炎δ因子就是一種由circRNA編碼的蛋白質(zhì)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，人骨肉瘤細(xì)胞U20S內(nèi)的circRNA具有蛋白質(zhì)翻譯功能，但效率較低[19]。Legnini等[20]報(bào)道,circ-ZNF609與多聚核糖體結(jié)合,通過不依賴 5′端帽子結(jié)構(gòu)的方式和剪接依賴兩種形式參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

二、circRNA與兒童常見惡性實(shí)體腫瘤

1. 骨肉瘤 骨肉瘤(osteosarcoma)也叫成骨肉瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，約占所有小兒腫瘤的5%。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_100876的下調(diào)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[21]。Liu等[22]通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_103801在骨肉瘤細(xì)胞株和組織中表達(dá)均上調(diào)，而hsa_circRNA_104980則下調(diào)。功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_103801參與HIF-1、VEGF、血管再生通路、RAP1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路；而hsa_circRNA_104980與緊密結(jié)合途徑有關(guān)。Wu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，circTAD2A在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增加，circTAD2A通過“吸附”mi-203a-3p和CREB3(與骨肉瘤相關(guān)的致癌基因)促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，這提示circTAD2A-miR-203a-3p/CREB3可以作為治療骨肉瘤的新靶點(diǎn)。越來越多的數(shù)據(jù)表明，circRNA與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展呈正相關(guān)。例如，circRNALRP6通過對(duì)KLF2和APC水平的負(fù)面影響而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生[24]。circRNA_100876通過吸附miRNA-136抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[21]。circ_0000285通過“海綿”miRNA-599促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[25]。

2. 肝母細(xì)胞瘤 肝母細(xì)胞瘤(hepatoblastoma)是一種惡性胚胎腫瘤，是兒童肝臟腫瘤常見類型之一。Liu等[26]分別取肝母細(xì)胞瘤和鄰近的癌旁組織，通過基因測(cè)序檢測(cè)出兩樣本之間表達(dá)差異的circRNA。其中，肝母細(xì)胞瘤組織中circ_0015756的表達(dá)顯著上調(diào)。經(jīng)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circ_0015756充當(dāng)miR-1250-3p海綿來調(diào)節(jié)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞功能。circ_0015756沉默可降低肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力、增殖能力和體外侵襲能力。其團(tuán)隊(duì)還測(cè)定了circ_0015756在肝母細(xì)胞瘤患者外周血中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其表達(dá)水平顯著增加。Zhen等[27]也在64例肝切除患者肝母細(xì)胞瘤組織與正常肝組織的比較中發(fā)現(xiàn)，circHMGCS1在肝母細(xì)胞瘤組織中顯著上調(diào)，circHMGCS1通過“海綿”miR-503-5p調(diào)節(jié)IGF2和IGF1R的表達(dá)，并影響下游PI3K-Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)肝母細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖和谷氨酰胺降解。這提示circHMGCS1對(duì)于肝母細(xì)胞瘤來說可能成為一種有前景的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志。

3. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)是兒童最常見的顱外腫瘤，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，可以起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部位。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)circAGO2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平上調(diào)，他們推測(cè)circAGO2可能與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。最終他們通過實(shí)驗(yàn)證明了circAGO2與癌細(xì)胞中的HuR相互作用并激活HuR蛋白，通過促進(jìn)AGO2-miRNA復(fù)合物的HuR抑制功能，使AGO2-miRNA介導(dǎo)的基因沉默受到抑制，使目標(biāo)基因表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和侵襲。這說明circAGO2可能會(huì)為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷提供新的思路。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探討了circAGO2敲除對(duì)荷瘤裸鼠轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)和存活的治療效果。在癌癥轉(zhuǎn)移的治療實(shí)驗(yàn)中，敲除的裸鼠存活概率提高。雖然目前僅僅停留在實(shí)驗(yàn)階段，但仍提示circRNA對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后有著重要的作用。Li等[28]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由致癌基因CUX1產(chǎn)生的含內(nèi)含子的環(huán)狀RNA(circ-CUX1)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和侵襲中有重要作用。上調(diào)的circ-CUX1 通過與EWSR1結(jié)合并促進(jìn)其與MYC相關(guān)的鋅指蛋白的相互作用，促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的有氧糖酵解和生長(zhǎng)過程，并增加其侵襲性。

4. 血管瘤 血管瘤(hemangioma)是由胚胎期間成血管細(xì)胞增生而形成的常見于皮膚和軟組織內(nèi)的先天性良性腫瘤或血管畸形，多見于嬰兒出生時(shí)或出生后不久。Fu等[29]首次對(duì)嬰兒血管瘤內(nèi)的circRNA進(jìn)行了分析，檢測(cè)出具有差異性表達(dá)的circRNA，同時(shí)鑒定出234條上調(diào)和374條下調(diào)的circRNA。其中，明顯上調(diào)的是hsa_circ_100933和hsa_circ_100709，下調(diào)的是hsa_circ_104310。Li[30]從3例患兒身上獲得增殖毛細(xì)血管瘤和與之匹配的正常皮膚組織，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)249個(gè)表達(dá)差異的circRNA，與匹配的正常皮膚對(duì)照相比，在血管瘤組織中有124個(gè)上調(diào)和125個(gè)下調(diào)的circRNA。hsa_cicRNA_001885和hsa_cicRNA_006612在血管瘤組織中的表達(dá)分別是正常皮膚的12.33倍和7.13倍。他們還通過GO和KEGG途徑分析差異表達(dá)的circRNA的來源基因，GO結(jié)果顯示，發(fā)生差異表達(dá)的circRNA來源基因主要參與細(xì)胞成分的發(fā)生、蛋白質(zhì)結(jié)合。KEGG途徑分析則顯示，存在差異表達(dá)的circRNA起源基因與細(xì)胞間信息交流的方式有關(guān)。

5. 橫紋肌肉瘤 橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)是兒童軟組織肉瘤中最常見的一種，是起源于橫紋肌細(xì)胞或向橫紋肌細(xì)胞分化的一種惡性腫瘤。Rossi等[31]通過研究circ-ZNF609在兒童橫紋肌肉瘤中的表達(dá)和功能，加深了circ-ZNF609在細(xì)胞周期調(diào)控中作用的認(rèn)識(shí)。他們不僅發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609主要在胚胎型和肺泡型橫紋肌肉瘤活檢中被上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)在胚胎型橫紋肌肉瘤衍生的細(xì)胞系中，基因敲除circ-ZNF609導(dǎo)致p-Akt蛋白水平顯著下降，該蛋白在細(xì)胞周期中發(fā)揮著重要作用。其原理大致為circ-ZNF609通過對(duì)抗p-Akt蛋白酶體依賴性降解作用，從而作為與細(xì)胞增殖相關(guān)的途徑的新調(diào)節(jié)劑。此外，Rossi等通過對(duì)circ-ZNF609缺失的人原發(fā)性成肌細(xì)胞進(jìn)行RNA序列分析，發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609使得細(xì)胞周期相關(guān)基因下調(diào)和天然免疫基因上調(diào)，說明circ-ZNF609與橫紋肌肉瘤細(xì)胞增殖存在密切聯(lián)系。

三、小結(jié)

隨著新一代高通量測(cè)序和生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者開始從不同角度深入地研究circRNA，由于circRNA的結(jié)構(gòu)特異、高度保守、在細(xì)胞中含量豐富等特點(diǎn)，已經(jīng)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其中，circRNA與腫瘤的關(guān)系不容忽視。大量研究表明circRNA在腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等方面都扮演著舉足輕重的角色，不過circRNA在兒童惡性實(shí)體腫瘤領(lǐng)域中的文獻(xiàn)報(bào)道比較少。雖然circRNA已被確定的功能尚不完全清楚，但隨著對(duì)circRNA的進(jìn)一步研究，更多在兒童腫瘤中差異表達(dá)的circRNA將被發(fā)現(xiàn)，未來將在診斷、治療、疾病預(yù)后中發(fā)揮越來越重要的作用。