周曉娟，桑躍，劉治麟，葛紹陽

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廊坊 065201；3.北京和益源生物技術(shù)有限公司，北京 100089）

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱[1]。近年來，隨著研究的深入，人們對益生菌在人類健康及疾病中的作用有了更加全面及深入的認識，多種益生功能和作用機制得到了深入的研究，包括改善腸道炎癥[2]、免疫調(diào)節(jié)[3,4]、預(yù)防過敏性疾病[5]等。

益生菌主要應(yīng)用于益生菌制劑、益生菌飲品和膳食添加劑等產(chǎn)品中, 如乳制品、飲料和益生菌膠囊等。調(diào)查表明, 益生菌在我國食品中得到廣泛應(yīng)用，其中80%應(yīng)用于發(fā)酵乳制品[1]。隨著益生菌產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，與其相關(guān)的功能和安全性研究也得到了越來越多的重視。人們提出一些能夠反映腸道細菌活性的指標，來評價乳酸菌的安全性，對產(chǎn)生的生物胺、耐藥性及毒性因子等潛在安全性風(fēng)險進行研究，成為評價益生菌安全性的重要部分[6]。

本試驗對動物雙歧桿菌A6進行安全性評價，其中體外安全性主要通過研究抗生素抗性、分析有毒代謝物等方面進行評價[6]；體內(nèi)安全性主要從菌株的毒理學(xué)、移位可能性等方面進行評價[7]。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

動物雙歧桿菌A6，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品實驗室提供，中國普通微生物保藏管理中心保藏，菌株號CGMCC No.9273。培養(yǎng)基組成同文獻[8]。

1.2 試驗方法

抗生素敏感性檢測、生物胺檢測、動物試驗設(shè)計、血生化和血常規(guī)指標檢測、細菌移位能力評價方法均與文獻[8]相同。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素敏感性

氨基糖苷類、喹諾酮類抗生素及氨多作用于革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌效果普遍較差。試驗結(jié)果表明，A6對氨基糖苷類、喹諾酮類、糖肽類部分抗生素及胺/氨的敏感性為R或者I（表1），與文獻報道相符。已有多篇文獻報道干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以及植物乳桿菌等乳酸菌天然對糖肽類抗生素如萬古霉素具有普遍耐受性。從檢測范圍分析，菌株A6不存在種屬保守耐性以外的抗生素耐受性。菌株的這種固有耐性多為菌株縱向遺傳獲得，而非基因橫向轉(zhuǎn)移，耐性的轉(zhuǎn)移風(fēng)險小。

表1 試驗菌株藥物敏感性能

2.2 生物胺檢測

脫羧酶培養(yǎng)基中的溴甲酚紫的有效指示范圍為pH 5.2～6.8，pH值在5.5時呈黃色，稍大于5.5就會出現(xiàn)顏色變化，呈現(xiàn)紫色或紫紅色。A6在改良脫羧酶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，相對于空白對照培養(yǎng)基，添加了鳥氨酸、組氨酸、酪氨酸、精氨酸四種不同氨基酸的液體培養(yǎng)基均呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明乳酸菌在其中可以正常生長，而各培養(yǎng)基均呈黃色，表明菌株生長并未使培養(yǎng)液pH值升高，初步判斷菌株未產(chǎn)生胺類物質(zhì)。

2.3 口服A6 急性毒性試驗

血常規(guī)指標可反映試驗菌株在血液中的副作用，血生化指標反映營養(yǎng)不足及代謝失衡的狀況。這些指標的變化通常早于其他的臨床癥狀。本試驗中試驗組和對照組血常規(guī)和血生化指標未發(fā)生任何顯著變化（表2），說明試驗菌株對試驗動物無不利影響。

表2 試驗小鼠的血常規(guī)和血生化指標（n=10）

2.4 細菌移位檢測

細菌移位是益生菌安全性的最嚴重問題之一。益生菌移位可引發(fā)感染，包括菌血癥、敗血癥或心內(nèi)膜炎[9,10]。因此，評價益生菌的移位能力是十分重要的。本試驗結(jié)果表明，對照組和試驗組的組織和血液樣本經(jīng)過培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基上均無菌落生長（表3），表明試驗動物的組織和血液未受到污染，菌株沒有從腸道轉(zhuǎn)移到組織和血液中，未發(fā)生移位現(xiàn)象。

表3 試驗小鼠被試菌轉(zhuǎn)移到肝、脾、腎和血液的移位率

3 結(jié)論

動物雙歧桿菌A6不存在種屬特有耐性以外的抗生素耐受性，不存在抗生素轉(zhuǎn)移的風(fēng)險；產(chǎn)胺試驗未發(fā)現(xiàn)生物胺的產(chǎn)生。以2×108cfu/mL、2×109cfu/mL、2×1010cfu/mL三種菌劑量灌胃小鼠28d，均未發(fā)生不良反應(yīng)，未發(fā)生血液、肝臟、脾臟和腎臟的移位；表現(xiàn)為較高的移位安全性。動物雙歧桿菌A6安全性評價未發(fā)現(xiàn)菌株的不安全因素。