鄒榮 胡韜韜 余秉治

430022 武漢，武漢市第一醫(yī)院腎內(nèi)科

新月體腎炎是腎臟病領域常見的急危重癥，其病理核心為包曼囊內(nèi)超過50%腎小球新月體形成，且新月體占腎小球面積50%以上。新月體可分為細胞性、細胞纖維性和纖維性新月體，疾病早期以細胞性新月體形成為主[1]。一般認為足細胞并不參與新月體形成，但近十年來臨床試驗和動物實驗研究提示足細胞可能是啟動新月體形成的主要細胞，本文就足細胞在新月體腎炎中的相關研究進展作一綜述。

一、足細胞橋的發(fā)現(xiàn)

2001年，Le Hir等[2]研究抗腎小球基底膜腎炎小鼠模型時發(fā)現(xiàn)，造模成功的小鼠腎小球內(nèi)可見彌漫毛細血管內(nèi)炎癥、新月體形成和足細胞足突廣泛融合。最值得注意的是，在腎小球毛細血管襻和壁層上皮細胞間可以看到橋接細胞，該細胞與壁層上皮細胞互相接觸，并破壞了壁層上皮細胞之間的緊密連接。橋接細胞存在于新月體形成的早期和發(fā)展階段，并在細胞新月體后期向纖維新月體轉(zhuǎn)變的過程中也能觀察到。電鏡觀察到新月體腎炎模型中足細胞膜形成片狀突起，逐漸遷移、黏附鮑曼囊，插入壁層上皮細胞緊密連接之間，在腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和壁層基底膜(parietal basement membrane，PBM)之間形成足細胞橋(podocyte bridge)[2]。通過免疫染色證實這些細胞表達了足細胞特異性標志蛋白如腎母細胞瘤蛋白1(wilms tumor protein1，WT1)，整合素α3亞單位，podocin，synaptopodin和CD2AP，提示它們可能起源于足細胞。

但也有不同意見提出新月體細胞染色未發(fā)現(xiàn)足細胞特異蛋白的表達，認為新月體中增殖細胞可能主要來源于壁層上皮細胞，因此，對足細胞參與新月體形成提出質(zhì)疑。

2004年Moeller等[3]首次報道將足細胞特異性2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26報告小鼠雜交，通過足細胞特異性標記觀察到在新月體形成早期即有足細胞遷移并粘附鮑曼囊；病理細胞計數(shù)提示新月體細胞中大約有50%細胞來源于足細胞；從而證實了足細胞是參與新月體形成的重要細胞。2016年Succar及其同事利用透射電鏡技術再次證實了足細胞橋的形成。他們使用腎毒血清(nephrotoxic serum，NTS)誘導建立新月體腎炎小鼠模型，分別在造模結(jié)束后第1、2、3、5、7、14天通過透射電鏡觀察腎小球變化。第1天相鄰足細胞的胞體之間廣泛形成了接觸，并且在胞體接觸部位出現(xiàn)緊密連接。免疫熒光可以檢測到緊密連接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)表達增加。第2天，足細胞之間距離減少，腎小球基底膜厚度增加。第3天足細胞足突融合(foot process effacement，F(xiàn)PE)，第5天足突廣泛融合，并在毛細血管襻和鮑曼囊之間可以觀察到足細胞橋形成。在第7天和第14天，所有腎小球中都出現(xiàn)了纖維素樣壞死和細胞新月體形成[4]。因此有人提出，足細胞橋的出現(xiàn)可能是新月體形成的關鍵起始事件。

二、足細胞遷移與新月體形成

正常腎小球中的足細胞是高度分化成熟的細胞，穩(wěn)定表達成熟足細胞的標記蛋白如足細胞骨架蛋白、裂孔隔膜蛋白復合體、頂膜區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白、基底區(qū)連接膜蛋白，一般不具有遷移能力[5]。但足細胞在發(fā)育過程中或病理損傷之后，足突會形成偽足樣結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有的表現(xiàn)為寬膜突起，被稱為板狀偽足，有的表現(xiàn)為長而細的尖銳結(jié)構(gòu)，被稱為絲狀偽足。足細胞通過足突骨架蛋白的收縮將偽足向前推進延伸。足細胞底部的粘著斑復合物原本將足突固定在腎小球基底膜上，在病理損傷后參與足細胞的運動。足細胞每次運動都涉及到足突與基底膜粘著點的破壞與重建，并在絲狀偽足向前移動時錨定到新的位置。這個過程稱為足細胞的遷移[6]。足細胞遷移能力的獲得是足細胞成為橋接細胞、啟動新月體形成的前提條件。

研究證實，許多足細胞成熟標記蛋白的表達或功能異常參與并調(diào)控足細胞遷移。Rho-GTPases是調(diào)節(jié)足細胞骨架蛋白、調(diào)控足細胞遷移的重要蛋白家族。Rho(Ras homologous)家族的小GTPases屬于Ras超家族，分子量20 000～30 000，存在于所有真核細胞生物中，通過影響細胞骨架肌動蛋白重建、細胞和細胞之間、細胞和基質(zhì)之間的粘附來作為分子開關在細胞遷移中發(fā)揮核心作用。Cdc42、Rac1和RhoA是Rho-GTPases家族的主要成員。RhoA定位于人染色體3p21.3區(qū)域，基因全長53 kDa，通過促進胞體及肌動蛋白-肌球蛋白應力纖維的形成，調(diào)節(jié)收縮性肌動蛋白和肌球蛋白微絲的聚合，維持足細胞細胞骨架的穩(wěn)定，其在成纖維細胞中可誘導黏著斑和應力纖維的生成。應用活化的RhoA轉(zhuǎn)染小鼠足細胞，可促進細胞遷移[7]。Rac調(diào)節(jié)層狀偽足的形成和皺褶，還可與TRPC6形成復合物，由TRPC6介導的Ca2+內(nèi)流，可升高Rac活性，促使足細胞遷移。Cdc42主要參與調(diào)節(jié)絲狀偽足的形成，從而調(diào)節(jié)足細胞的遷移行為[8]。

Synaptopodin屬于足細胞骨架蛋白，分子量100 kDa，是一種富含脯氨酸的肌動蛋白相關蛋白，僅表達于成熟分化的足細胞。已有研究證實，Synaptopodin能夠從多個方面影響足細胞遷移行為。 Synaptopodin能夠與肌動蛋白成束蛋白α-actinin-4連結(jié)而調(diào)節(jié)肌動蛋白成束功能，影響 F-actin 的聚集和解聚，從而調(diào)節(jié)足細胞的“可塑性”[9]；Synaptopodin通過競爭性阻斷Smurf1介導的RhoA泛素化降解，從而誘導應力纖維的形成[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)，synaptopodin直接與接頭蛋白IRSp53相連接，通過Cdc42-IRSp53-Mena復合物抑制足細胞絲狀偽足的形成，維持足細胞在基底膜上的錨定狀態(tài)。Synaptopodin基因缺失的小鼠表現(xiàn)出腎臟足細胞壓力絲缺失，形成異常非極性的層狀偽足，阻止細胞遷移[11]。

Podocin、Nephrin和CD2相關蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)是目前已經(jīng)確定的三種裂孔隔膜蛋白，三種蛋白相互作用，共同形成裂孔隔膜蛋白復合體，穩(wěn)定裂孔隔膜完整性[5]。CD2AP 作為重要的胞內(nèi)接頭蛋白，不僅與nephrin和podocin直接作用，而且可直接與纖絲狀肌動蛋白連接以調(diào)節(jié)細胞骨架的組成和排列[12]。 Podocin分子量42 kDa，NPHS2基因編碼，由383個氨基酸殘基組成。其結(jié)構(gòu)呈發(fā)卡樣，定位于裂孔隔膜的脂類微功能域，通過瞬時受體電位通道蛋白6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)的集聚發(fā)揮機械感受器的作用。當足細胞受到機械性刺激時，出現(xiàn)細胞骨架蛋白的重排和足突收縮。裂孔隔膜結(jié)構(gòu)分子的異?？梢砸鹱慵毎羌艿闹嘏?，并推測可能進一步影響足細胞遷移能力的獲得，但它們在足細胞遷移中的作用機制還需要進一步研究和證實[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)信號通路活化也參與了足細胞遷移。哺乳動物Notch信號通路由四種受體(Notch1、Notch 2、Notch3和Notch 4)，五種配體(DLL 1、DLL 3、DLL 4、Jagged 1和Jagged 2)構(gòu)成。Notch信號通路調(diào)控幾乎涉及所有細胞的增殖和分化活動，其調(diào)控過程可概括為：配體與Notch受體胞外區(qū)域結(jié)合—Notch胞內(nèi)胞外段分離—可溶性活性Notch受體胞內(nèi)區(qū)(NICD)進入細胞核—形成CLS—ICN復合體—激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[14]。腎毒血清能誘導正常小鼠足細胞上調(diào)Notch3受體及其靶基因HeyL表達；通過基因工程技術在足細胞過表達Notch3活化細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，觀察到足細胞肌動蛋白細胞骨架重組，表現(xiàn)出遷移特性。在體內(nèi)抑制Notch3表達能有效抑制腎內(nèi)炎癥細胞聚集和新月體形成[15]。

表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)及其下游信號通路激活也參與足細胞遷移。 Bollee等[16]在腎毒血清誘導的新月體腎炎模型中觀察到EGF介導的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路活化。該信號通路激活能誘導足細胞環(huán)狀F-肌動蛋白結(jié)構(gòu)(RiLiS)形成，而RiLiS結(jié)構(gòu)是足細胞頂端突起和頂端遷移能力獲得的標志性改變。

雖然體內(nèi)足細胞是高度分化的成熟細胞，一般情況下不具有遷移能力，但在新月體腎炎模型中多次觀察到足細胞失去正常極性并成為具有遷移能力的細胞，說明足細胞遷移能力的獲得可能是足細胞橋和新月體形成的基礎條件。

三、足細胞增殖與新月體形成

Reidy等[17]認為，足細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時將失去成熟足細胞原有的蛋白標記分子，如Nephrin、synaptopodin等，轉(zhuǎn)而表達上調(diào)的間充質(zhì)細胞樣表型標志物，如成纖維細胞特殊蛋白Ⅰ、整合素連接激酶、纖維連接蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶 9等。已經(jīng)證實高糖和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等可以誘導體外培養(yǎng)足細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[18]，美國匹茲堡大學 Liu等[19]利用TGF-β刺激體外培養(yǎng)的足細胞，足細胞原有標記蛋白如 Nephrin、P-cadherin、ZO-1等減少，轉(zhuǎn)而表達間充質(zhì)細胞蛋白分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶9、結(jié)蛋白等，進而導致足細胞功能紊亂，濾過膜完整性喪失。在新月體腎炎患者的腎活檢標本中也發(fā)現(xiàn)成熟足細胞丟失[20]、足細胞表型改變[21]和足細胞來源的新月體細胞高表達增殖蛋白如增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Ki67[22]，提示足細胞可能在新月體形成過程中發(fā)生了由高度分化的成熟細胞表型向具有增殖能力的表型轉(zhuǎn)化。正常情況下，巢蛋白Nestin僅表達在成熟足細胞胞漿及初級足突。Thorner等[23]觀察35例腎活檢標本，發(fā)現(xiàn)新月體中增殖細胞也表達巢蛋白Nestin，并且在腎小球毛細血管襻和壁層上皮細胞之間可以觀察到巢蛋白陽性的橋接細胞，進一步證實了新月體形成過程中足細胞增殖的存在。

多數(shù)腎病類型的病理進展中，足細胞數(shù)目不斷減少。但部分類型腎病，如細胞型局灶節(jié)段性腎小球硬化、塌陷型腎小球病和人類免疫缺陷病毒相關性腎病卻出現(xiàn)了足細胞增殖的情況[18]。足細胞增殖也見于新月體腎炎病理損傷。選擇性刪除足細胞中von Hippel Lindau(Vhlh)基因，穩(wěn)定了缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)α亞基，隨后上調(diào)HIF靶基因如血管內(nèi)皮生長因子A、趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)及其配體的表達。Vhlh突變小鼠發(fā)育4周時發(fā)生腎小球性血尿和蛋白尿，腎臟病理顯示新月體形成和足細胞增殖。該病理過程與足細胞HIF靶基因CXCR4特異性表達上調(diào)密切相關，誘導CXCR4變異足以引起足細胞增殖和新月體形成。給予抗CXCR4抗體能有效改善Vhlh突變小鼠新月體腎炎的嚴重程度[24]。該研究提示受損的去分化足細胞增殖可能是為了彌補缺失的正常足細胞，而增殖的足細胞在鮑曼囊內(nèi)堆積，又參與新月體形成。

Dai及其同事也觀察到新月體腎炎中足細胞增殖的存在，并證明足細胞增殖與信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)的激活有關[25]。STAT是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，被各種胞外細胞因子和生長因子信號激活后進入胞核內(nèi)與靶基因啟動子序列的特定位點結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄[26]。在NTS誘導的新月體腎炎模型中，足細胞STAT3的激活及其下游靶基因表達增加。通過基因工程技術誘導足細胞特異性缺失STAT3，觀察到STAT3缺失減輕了NTS誘導的新月體形成和腎臟損傷。STAT3缺失可通過阻止壁層上皮細胞募集和下調(diào)足細胞分化標志物、抑制足細胞增殖來減少新月體的形成。該研究提示足細胞STAT3的激活對于新月體腎小球腎炎的發(fā)展至關重要，推測IL-6和EGF可能由內(nèi)在的腎小球細胞(足細胞，腎小球系膜細胞和內(nèi)皮細胞)和募集到腎小球的循環(huán)免疫細胞(淋巴細胞)產(chǎn)生。然后，IL-6和EGF在受損腎小球中的局部蓄積可以激活足細胞中的JAK/STAT信號傳導，并啟動足細胞增殖，足細胞標記物的丟失和壁層上皮細胞的募集，最終導致新月體形成[25]。細胞增殖由所處的細胞周期決定，而細胞周期受細胞周期蛋白cyclin的調(diào)控。不同時相的cyclin激活特定的細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)而引起細胞增殖。cyclin-CDK復合物受CDK抑制蛋白(CDK-inhibitor，CDKI)P21、P27和P57調(diào)控。大多數(shù)腎小球疾病時足細胞難以增殖的原因是CDKI表達沒有削弱反而得到了加強。然而部分病理類型的足細胞損傷時，細胞周期調(diào)控失衡導致足細胞增殖。Shankland等[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同腎病類型CDKI表達不同，在微小病變和膜性腎病組，P21、P27和P57表達與正常腎臟無明顯差異，但在細胞型局灶節(jié)段性腎小球硬化、塌陷型腎小球病和HIVAN組，足細胞P27和P57表達受抑制，激活了與有絲分裂相關的細胞周期蛋白，從而促使足細胞發(fā)生增殖[28]。在新月體腎炎患者腎組織中也觀察到細胞周期蛋白cyclin A和B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表達上調(diào)，CDK抑制蛋白p27表達減弱[29]。該現(xiàn)象提示細胞周期蛋白參與了新月體腎炎的病生過程。但足細胞是否發(fā)生細胞周期蛋白調(diào)節(jié)失衡，細胞表型變化是否與細胞周期蛋白有關，仍需要進一步深入研究。

抑制足細胞增殖也可以減輕新月體腎炎中腎組織損傷。腎毒血清誘導的新月體腎炎小鼠模型中觀察到microRNA-92a表達上調(diào)，并抑制p57kip2的表達，從而誘導足細胞經(jīng)歷分化表型的失調(diào)和增殖。給予抗miR-92a抗體可以防治小鼠白蛋白尿和腎功能衰竭，表明miR-92a抑制可以作為RPGN的潛在治療策略[30]。同樣，在NTS誘導的新月體腎炎小鼠模型中，Dai等[31]觀察到維甲酸(retinoic acid，RA)通過激活RA受體α(retinoic acid receptor alpha，RARα)抑制足細胞增殖，恢復足細胞標志蛋白的表達，RA治療能顯著減輕足細胞損傷，改善腎功能并減少小鼠的新月體數(shù)量，敲除RARα，RA的保護作用在新月體腎炎模型小鼠中不再呈現(xiàn)。

有證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ)的表達可以預防足細胞損傷。腎毒血清誘導的新月體腎炎小鼠模型中足細胞PPARγ表達豐度和轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)的治療能夠提高足細胞對損傷的耐受性，有效減輕新月體的形成和腎臟損害。該研究提示PPARγ途徑可能是新月體腎炎的治療靶標之一[32]。對這些研究結(jié)果的綜合解釋是在各種致病因素的作用下，足細胞可能失去他們分化成熟的細胞標記，向增殖細胞表型轉(zhuǎn)化并獲得遷移能力；足細胞橋形成以后，足細胞與壁層上皮細胞相互接觸，相互影響，誘導足細胞、壁層上皮細胞、巨噬細胞等大量增殖，并釋放炎癥因子，從而推動新月體形成的病理進程[33]。

四、小結(jié)

細胞新月體的起源一直存在爭議。早期理論在發(fā)病機制中低估了足細胞的作用，但新近研究表明，足細胞是新月體形成的重要細胞，廣泛參與了新月體腎炎的發(fā)生與進展，針對足細胞的治療策略有可能抑制新月體腎炎的進展和惡化。