游佳, 桂哲, 謝志雄

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430072

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種普遍生活在各種環(huán)境中、可引起人類疾病的條件致病菌[1]。P.aeruginosaPAO1是北美醫(yī)院中常見的致病菌之一，因其具有生成生物膜和轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素的能力，因此對多種抗生素具有高抗性，可引起肺部感染，還可引起燒傷病人敗血癥，甚至死亡[2]。

在動植物及人體病源性假單胞菌中，Gac系統(tǒng)是一個保守的雙組分(GacS/GacA)調(diào)控系統(tǒng)，陸續(xù)在多種細(xì)菌中被鑒定出來[3-4]。GacS/GacA系統(tǒng)主要通過調(diào)控所在細(xì)菌的運(yùn)動能力、蛋白酶的分泌、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的產(chǎn)生、氫氰酸的合成等來影響毒力因子的產(chǎn)生，從而改變細(xì)菌的致病性[5-6]。其中，GacS是該系統(tǒng)的跨膜感應(yīng)蛋白，最初在丁香假單胞菌(Pseudomonassyingaepv.)中被鑒定出來，其受到外界信號激活后可自磷酸化。而GacA蛋白是該系統(tǒng)的調(diào)控蛋白，當(dāng)GacS自磷酸化后可激活GacA，假單胞菌中GacA蛋白通過結(jié)合到RsmY/Z等小RNA(small RNA，sRNA)的啟動子上起始表達(dá)。在P.aeruginosaPAO1中，這些sRNA與翻譯抑制蛋白RsmA結(jié)合，從而解除RsmA對下游目的基因的抑制作用。因此，GacS蛋白的缺失最終會導(dǎo)致目的基因的低表達(dá)[7]。

東湖假單胞菌(Pseudomonasdonghuensis)HYS菌株是本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中首次從武漢東湖水域分離的一株具備高產(chǎn)鐵載體能力的革蘭氏陰性菌，通過生理生化測試和基于全基因組測序的16S rRNA基因的進(jìn)化分析，這株高產(chǎn)鐵載體的菌株應(yīng)歸屬于Pseudomonasdonghuensissp.，并作為模式菌株被命名為PseudomonasdonghuensisHYS[8]。該HYS菌株可產(chǎn)生熒光鐵載體和非熒光鐵載體，且在同等培養(yǎng)條件下，其產(chǎn)鐵載體總量的能力是其他假單胞菌的5倍。HYS菌株還被發(fā)現(xiàn)對秀麗隱桿線蟲胚胎具有極強(qiáng)的致死效應(yīng)，秀麗隱桿線蟲胚胎在HYS菌苔上的孵化比例為0(大腸桿菌OP50陰性對照的孵化比例為100%)，且HYS喂食的秀麗隱桿線蟲半數(shù)致死時間約為3.6 d，由此也可推測出HYS具備成為致病菌的可能性[9]。然而，目前HYS的毒性調(diào)控機(jī)制尚不清楚。為了探究Gac系統(tǒng)對于潛在致病菌HYS毒性的影響，確定HYS中毒性因子的調(diào)控途徑，本研究先通過氨基酸序列BlastP比對以確定HYS中Gac系統(tǒng)的存在，再將不同來源的gacS片段通過基因克隆回補(bǔ)至HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中，通過細(xì)菌-線蟲的致病模型驗(yàn)證Gac系統(tǒng)對于HYS毒性的影響。隨后通過比較野生型HYS菌株、敲除株ΔgacS以及不同來源的gacS片段回補(bǔ)株在脫脂牛奶平板、運(yùn)動能力平板以及脂多糖和氫氰酸的檢測中的表型，進(jìn)一步明確gacS基因的缺失對于多種毒性因子的影響，以期完善HYS菌株的致病途徑，為后期HYS的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、線蟲和菌株

pBBR1-MCS2質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)N2購自美國線蟲遺傳學(xué)中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)；大腸桿菌S17-1、OP50以及銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)PAO1均由本實(shí)驗(yàn)室保存；東湖假單胞菌(P.donghuensis)HYS分離自東湖水域，HYS的gacS基因敲除株ΔgacS由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[10]。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基、NGM培養(yǎng)基的配置方法參照高經(jīng)緯[9]的配方；脫脂牛奶培養(yǎng)基的配置方法參照Reinmman等[11]的配方。

泳動運(yùn)動檢測培養(yǎng)基：蛋白胨9 g，NaCl 4.5 g，瓊脂糖2.7 g，用自來水完全溶解后定容至900 mL，分裝至三角瓶中，每瓶150 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

群集運(yùn)動檢測培養(yǎng)基：蛋白胨9 g，酵母提取物4.5 g，葡萄糖4.5 g，瓊脂4.5 g，用自來水完全溶解后定容至900 mL，分裝至三角瓶中，每瓶150 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

蹭行運(yùn)動檢測培養(yǎng)基：蛋白胨9 g，酵母提取物4.5 g，NaCl 4.5 g，瓊脂9 g，用自來水完全溶解后定容至900 mL，分裝至三角瓶中，每瓶150 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

KMB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，甘油10 mL，混合后加水定容至1 L，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

1.3 儀器與試劑盒

HV-50型高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；BS110S型分析電子天平(德國Sartorius公司)；GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；PCR儀(德國Eppendorf股份公司)。

苦味酸試紙購自北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；細(xì)菌脂多糖提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；細(xì)菌脂多糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4 生物信息學(xué)分析

HYS全基因組測序工作已由本實(shí)驗(yàn)室高經(jīng)緯完成并上傳至NCBI Whole Genome Shotgun數(shù)據(jù)庫，當(dāng)前版本接入號為AJJP01000000[9]。為了確定HYS中是否存在Gac系統(tǒng)，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測并定位HYS基因組中g(shù)acS基因的位置。

將P.aeruginosaPAO1的Gac系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白GacS作為參照，在數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Pseudomonasdonghuensis種屬為背景。P.aeruginosaPAO1的PA0925、PA0926、PA0927(被注釋為idhA)、PA0928(被注釋為gacS)、PA0929以及PA0930序列均調(diào)取自NCBI；P.donghuensisHYS的UW3_RS0101475、UW3_RS0101480、UW3_RS0101485、UW3_RS0101490、UW3_RS0101500基因序列均調(diào)取自NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，HYS的核酸數(shù)據(jù)庫接入號為NZ_AJJP01000185.1。將2組基因?qū)?yīng)的氨基酸序列進(jìn)行BlastP比對，并對結(jié)果進(jìn)行分析，保留HYS來源的高同源性比對結(jié)果并排序。

1.5 gacS基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

分別從NCBI網(wǎng)站上調(diào)取P.donghuensisHYS和P.aeruginosaPAO1的gacS基因序列，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pBBR1-MCS2質(zhì)粒上，再利用細(xì)菌結(jié)合的方法將二者的gacS基因回補(bǔ)到HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中，并分別標(biāo)記為ΔgacS/pBBR2-gacSHYS和ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1。具體操作參照高經(jīng)緯[9]的方法。將構(gòu)建成功的ΔgacS/pBBR2-gacSHYS和ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1菌株平板劃線至含50 μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板上，于4 ℃保存。

1.6 線蟲培養(yǎng)

將大腸桿菌OP50、P.aeruginosaPAO1、P.donghuensisHYS和ΔgacS菌株在LB平板上劃線，HYS/pBBR2、ΔgacS/pBBR2、ΔgacS/pBBR2-gacSHYS、ΔgacS/pBBR2-gacSpao1在含50 μg·mL-1的卡那霉素抗性平板上劃線。挑單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h，其中帶有pBBR1-MCS2質(zhì)粒的菌株均用50 μg·mL-1的卡那霉素抗性平板培養(yǎng)。取200 μL菌液滴加到NGM平板上，每個菌株滴5個NGM平板，待菌液晾干后，將滴有菌液的NGM平板放置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。將同步培養(yǎng)到L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到NGM-實(shí)驗(yàn)菌株平板上，每個平板20只。轉(zhuǎn)移線蟲的當(dāng)天記為第1天，之后每5天記錄1次線蟲狀態(tài)，同時將存活的線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM-實(shí)驗(yàn)菌株平板上，直至線蟲全部死亡。通過統(tǒng)計(jì)線蟲存活的個數(shù)和天數(shù)可指示菌株對線蟲的毒性大小。本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲用大腸桿菌OP50作為食物維持，因此將僅含大腸桿菌OP50的處理組作為陰性對照。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.7 胞外蛋白酶的檢測

利用分光光度計(jì)測定各菌株活化所得菌液的OD600，并將其OD600調(diào)至0.2。用無菌的槍頭取2 μL待測菌液滴到脫脂牛奶平板的表面，待菌液晾干后，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測量其產(chǎn)生的透明圈大小。

1.8 運(yùn)動能力的檢測

利用分光光度計(jì)測定各菌株活化所得菌液的OD600，并將其OD600調(diào)至0.1。泳動運(yùn)動和群集運(yùn)動的檢測用無菌的槍頭取2 μL待測菌液滴到泳動運(yùn)動平板、群集運(yùn)動平板的表面，待菌液晾干后，正置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h后，測量2種運(yùn)動圈直徑大小。蹭行運(yùn)動的檢測用無菌的槍頭垂直刺穿直至蹭行運(yùn)動培養(yǎng)基底部，然后將菌液沿著刺穿的孔點(diǎn)加至培養(yǎng)基的底部，待菌液完全吸入培養(yǎng)基后，將其倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h后，測量蹭行運(yùn)動產(chǎn)生的運(yùn)動痕跡的大小。記錄數(shù)據(jù)并拍照保存，每個菌株獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。

1.9 脂多糖的提取與檢測

將各菌株活化所得的菌液按1%接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，將菌液的OD600調(diào)至3.0，利用細(xì)菌脂多糖提取試劑盒提取各菌株的脂多糖樣品，具體操作參見試劑盒說明書。然后利用細(xì)菌脂多糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行脂多糖濃度檢測，具體操作參見試劑盒說明書。

1.10 氫氰酸檢測

在KMB平板上(添加了4.5 g·L-1的甘氨酸)上活化實(shí)驗(yàn)菌株，然后將苦味酸試紙浸泡在2%碳酸鈉溶液中，將試紙滅菌后烘干，再將試紙放置于培養(yǎng)皿上蓋內(nèi)側(cè)，封口膜密封培養(yǎng)皿，正置于30 ℃下培養(yǎng)48 h，拍照記錄。

1.11 數(shù)據(jù)與分析

P.donghuensisHYS和P.aeruginosaPAO1中同源性基因的排列繪制自SnapGene 2.3.2。柱狀圖繪制自O(shè)rigin 9.0和Photoshop CS2軟件。顯著性分析采用Duncan多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 HYS的生物信息學(xué)分析

將P.aeruginosaPAO1的Gac系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白GacS作為參照，以Pseudomonasdonghuensis種屬為數(shù)據(jù)庫，在NCBI中進(jìn)行氨基酸序列BlastP比對，結(jié)果如表2所示。

為了更精準(zhǔn)定位HYS中GacS蛋白的位置，需將PAO1基因組中的gacS核酸序列與表2中蛋白同源性最高的WP_026001148.1的核酸序列以及相鄰基因核酸序列進(jìn)行比對分析。PAO1中GacS蛋白對應(yīng)的gacS編碼基因的編號為PA0928，HYS基因組中WP_026001148.1蛋白編碼基因的編號為UW3_RS0101480。結(jié)果如圖1所示，2個基因組中相同的顏色代表2個同源基因，而不同顏色代表基因組內(nèi)不同的基因。可知P.donghuensisHYS中編號為UW3_RS0101485的基因與P.aeruginosaPAO1中g(shù)acS基因所在位置的相鄰基因排布一致(圖1)，且具有高度同源性(表3)。該結(jié)果說明UW3_RS0101485基因即是PAO1中Gac系統(tǒng)關(guān)鍵的gacS基因的同源基因，由此可推測HYS中存在Gac系統(tǒng)。

表2 東湖假單胞菌HYS中GacS蛋白的同源性比對

圖1 P. aeruginosa PAO1與P. donghuensis HYS中g(shù)acS基因的定位

PAO1基因編號HYS基因編號HYS蛋白編號蛋白同源性E值PA0930UW3_RS0101475WP_036995139.156.18%5E-165PA0929UW3_RS0101480WP_010220372.157.50%3E-99PA0927UW3_RS0101490WP_010220374.177.98%0.0PA0926UW3-RS0101495WP_010220375.176.60%2E-84PA0925UW3_RS0101500WP_010220376.154.96%3E-58

2.2 Gac系統(tǒng)對HYS毒性的影響

為了檢測HYS的Gac系統(tǒng)是否發(fā)揮毒性調(diào)控作用，分別將P.aeruginosaPAO1和P.donghuensisHYS的gacS基因回補(bǔ)到HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中，將所得菌株喂食秀麗隱桿線蟲，通過比較線蟲的生存天數(shù)和生存數(shù)量來判斷菌株毒性的強(qiáng)弱，從而驗(yàn)證HYS菌株中Gac系統(tǒng)的功能保守性。

由表4可知，野生型HYS菌株和PAO1菌株均對線蟲有較為強(qiáng)烈的毒性，且HYS對線蟲的毒性更強(qiáng)。而ΔgacS菌株毒性明顯減弱，其喂食的線蟲甚至與OP50喂食的線蟲生存率相當(dāng)(在第15天還有26條存活)。喂食ΔgacS的空載體菌株ΔgacS/pBBR2的線蟲在培養(yǎng)19 d后仍有1條存活；而喂食HYS的空載體菌株HYS/pBBR2的線蟲在第5天只有9條存活，培養(yǎng)到第10天沒有線蟲存活?；匮a(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS對線蟲的毒性恢復(fù)明顯，在第10天后沒有線蟲存活；同時，回補(bǔ)PAO1的gacS基因的ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1菌株對線蟲的毒性也有一定程度的恢復(fù)，但與回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS存在一定差距。上述結(jié)果說明，HYS中的Gac系統(tǒng)參與了毒性調(diào)控途徑，且PAO1的gacS基因在HYS菌株中同樣能夠發(fā)揮一定的毒性調(diào)控作用。

2.3 HYS的Gac系統(tǒng)對毒性因子表型的影響

2.3.1HYS的Gac系統(tǒng)對蛋白酶分泌的影響

由圖2可知，將gacS基因敲除后，ΔgacS菌株不能產(chǎn)生蛋白酶水解圈，說明沒有蛋白酶的產(chǎn)生或蛋白酶活性完全喪失；而回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS的蛋白酶活性幾乎恢復(fù)到野生型HYS的水平，由此推測gacS基因的缺失抑制了HYS菌株胞外蛋白酶的表達(dá)或分泌。此外，回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1和敲除株ΔgacS相比，蛋白酶活性有一定的恢復(fù)，但其蛋白酶水解圈顯著小于回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS(P<0.05)，說明PAO1的gacS基因只能夠恢復(fù)部分蛋白酶活性。

表4 各菌株毒性對線蟲生存天數(shù)和生存數(shù)量的影響

A：各菌株在脫脂牛奶平板上的胞外蛋白酶產(chǎn)生情況；B：A中數(shù)據(jù)對應(yīng)的柱狀圖，不同小寫字母表示不同菌株間蛋白酶產(chǎn)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.2HYS的Gac系統(tǒng)對運(yùn)動能力的影響 為了探究HYS菌株Gac系統(tǒng)對其運(yùn)動能力的影響，本研究檢測了所得菌株的運(yùn)動能力。由表5可知，敲除株ΔgacS與野生型HYS間的3種運(yùn)動能力的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ΔgacS/pBBR2與野生型HYS/pBBR2間3種運(yùn)動能力的差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。向敲除株ΔgacS回補(bǔ)HYS的gacS基因后，回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS的3種運(yùn)動能力均能恢復(fù)到甚至超過野生型HYS菌株的水平。而回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS和ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1間泳動運(yùn)動和群集運(yùn)動能力的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即HYS自身的gacS基因和PAO1的gacS基因均能恢復(fù)HYS菌株因gacS基因缺失所產(chǎn)生的2種運(yùn)動表型變化。與野生型菌株相比，攜帶pBBR2質(zhì)粒的菌株的3種運(yùn)動能力均顯著下降(P<0.05)，表明質(zhì)粒也會對菌株的運(yùn)動能力造成一定的影響。

表5 菌株運(yùn)動能力的比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同菌株間運(yùn)動能力的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.3HYS的Gac系統(tǒng)對脂多糖產(chǎn)量的影響

為了探究HYS菌株Gac系統(tǒng)對毒性因子脂多糖的影響，對所得菌株進(jìn)行了脂多糖濃度的檢測。利用細(xì)菌脂多糖提取試劑盒對菌株的脂多糖進(jìn)行提取，提取后的脂多糖用脂多糖檢測試劑盒進(jìn)行濃度檢測。標(biāo)準(zhǔn)物所做標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3A所示，其線性回歸方程為：Y=0.002 4X+0.212 7(R2=0.983 2)。

由圖3B可知，將gacS基因敲除后，與野生型HYS相比，敲除株ΔgacS的脂多糖濃度顯著下降(P<0.05)；回補(bǔ)HYS的gacS基因后，回補(bǔ)菌株的脂多糖濃度有所上升，差值小于敲除株ΔgacS與野生型HYS之間的差距，說明回補(bǔ)的基因發(fā)揮了作用(圖3B)。此外，回補(bǔ)了PAO1的gacS基因的ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1菌株的LPS產(chǎn)量恢復(fù)至野生型PAO1的水平(P>0.05)，但仍顯著低于ΔgacS/pBBR2-gacSHYS菌株(P<0.05)。上述結(jié)果說明HYS的Gac系統(tǒng)可正調(diào)控其脂多糖的生成。

A：標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：各菌株生產(chǎn)的脂多糖濃度，不同小寫字母表示不同菌株間脂多糖產(chǎn)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.4HYS的Gac系統(tǒng)對氫氰酸生成的影響

為了探究HYS菌株Gac系統(tǒng)對其生成有毒代謝物氫氰酸的影響，本研究進(jìn)行了氫氰酸生成的檢測。根據(jù)試紙的變色程度來判斷氫氰酸的產(chǎn)生情況。

從圖4可以看出，野生型HYS在KMB培養(yǎng)基能產(chǎn)生氫氰酸，試紙變黃褐色；而敲除株ΔgacS試紙不變色，說明沒有氫氰酸產(chǎn)生?；匮a(bǔ)HYS的gacS基因后，試紙變色，說明回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS重新產(chǎn)生氫氰酸，回補(bǔ)基因發(fā)揮了功能。但其變色程度不如HYS/pBBR2野生型明顯，由此推測其產(chǎn)生的氫氰酸含量少于HYS/pBBR2野生型菌株。此外，回補(bǔ)了PAO1gacS基因的ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1的變色程度雖然有恢復(fù)，但不及ΔgacS/pBBR2-gacSHYS明顯。

圖4 不同菌株的氫氰酸含量檢測

上述結(jié)果表明，HYS的Gac系統(tǒng)與PAO1中Gac系統(tǒng)高度保守，可形成一定程度上的功能互補(bǔ)，且HYS中g(shù)acS的缺失影響了HYS對線蟲的慢性毒性。PAO1中的gacS基因控制著線蟲的致病因子的產(chǎn)生，如胞外蛋白酶、脂多糖、氫氰酸等[12-13]，而在HYS中，gacS基因也發(fā)揮著同樣的作用，進(jìn)而可能引發(fā)潛在的動植物致病性。

3 討論

P.aeruginosaPAO1是一種人類機(jī)會致病菌，因其可造成人類疾病而被廣泛研究。秀麗隱桿線蟲因具有個體小、形態(tài)簡單、易于培養(yǎng)保存與復(fù)蘇、滿足高通量篩選以及與人類疾病相關(guān)基因高度同源等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于各類微生物致病機(jī)制的研究[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于大腸桿菌OP50，P.donghuensisHYS菌株與機(jī)會致病菌PAO1均具備強(qiáng)烈的毒殺線蟲的能力。此外，HYS喂食的線蟲在第5天只有9條存活，而PAO1喂食線蟲在第9天依然有13條存活，表明HYS相比人類機(jī)會致病菌PAO1對線蟲具備更強(qiáng)的致死效應(yīng)。

本研究通過生物信息學(xué)比對分析確定了HYS菌株中存在與PAO1高度同源的Gac系統(tǒng)。對于P.aeruginosa菌種，已有研究報(bào)道Gac系統(tǒng)與其致病性緊密相關(guān)[11]。 在本研究中，HYS的gacS基因敲除株ΔgacS所喂食的線蟲在第15天還存活26條，相比于野生型HYS，其毒性幾乎完全喪失。由于HYS和PAO1的GacS蛋白具有同源性，將PAO1的gacS片段回補(bǔ)到HYS的ΔgacS菌株中在一定程度上恢復(fù)了ΔgacS菌株的毒性表型，提示著PAO1的Gac系統(tǒng)與HYS的Gac系統(tǒng)對毒性控制具有同樣的功能。但值得注意的是，HYS對線蟲的毒性明顯強(qiáng)于PAO1，且回補(bǔ)PAO1的gacS基因無法完全恢復(fù)HYS的毒性表型。在第5天時，喂食ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1的線蟲與喂食ΔgacS/pBBR2-gacSHYS相比，存活數(shù)量幾乎多了一倍；在第10天時，喂食ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1的線蟲仍存活35條，而喂食ΔgacS/pBBR2-gacSHYS的線蟲則全部死亡，暗示著HYS中除了存在PAO1中被GacS蛋白調(diào)控的毒力因子外，可能還存在著HYS中特有的、更強(qiáng)烈的毒力因子。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，也稱為脂質(zhì)聚糖和內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分。LPS的功能包括細(xì)菌的粘附、外膜滲透屏障、抗血清以及抗吞噬，另外還可作為某些噬菌體的吸附受體[16]。LPS還介導(dǎo)著細(xì)菌和周圍環(huán)境間的相互作用，有利于細(xì)菌應(yīng)對極端生存環(huán)境[17]。有研究表明，綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis) G5的Gac系統(tǒng)顯示出與HYS不同的調(diào)控方向，G5菌株的gacA缺失株負(fù)調(diào)控LPS的產(chǎn)量，粗糙型脂多糖的產(chǎn)量明顯增多，這與HYS的ΔgacS菌株中LPS的總量下降的現(xiàn)象相反[18]，也就意味著在HYS中Gac系統(tǒng)正調(diào)控LPS的產(chǎn)量。氫氰酸(hydrogen cyanide, HCN)作為假單胞菌產(chǎn)生的一種毒性物質(zhì)，在多種假單胞菌的分泌物中均有發(fā)現(xiàn)，如熒光假單胞菌(P.fluorescent)CHA0、P.aeruginosaPAO1等[19-20]。氫氰酸可以通過抑制呼吸酶造成細(xì)胞內(nèi)窒息，曾作為一種生物殺菌劑用于煙草的黑根腐病的防治研究[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中HCN產(chǎn)量幾乎喪失，這一結(jié)果與閆小雪等[21]在熒光假單胞菌中Gac系統(tǒng)對HCN產(chǎn)量的調(diào)控趨勢相同。P.aeruginosaPAO1中的堿性蛋白酶AprA和彈性蛋白酶LasA、LasB所組成的胞外蛋白酶也是其毒力因子的一種，蛋白酶通過降解免疫球蛋白或抗菌肽等幫助病原體入侵[22]。HYS的gacS基因缺失株胞外蛋白酶活性喪失，脫脂牛奶平板上的蛋白酶水解圈完全消失。這和Duffy等[23]發(fā)現(xiàn)Gac系統(tǒng)對一些胞外酶基因的表達(dá)起正調(diào)控作用現(xiàn)象一致。此外，細(xì)菌的運(yùn)動性也參與幫助病原體附著到宿主表面，以及促進(jìn)生物膜的產(chǎn)生幫助發(fā)揮細(xì)菌毒性等作用[24]。細(xì)菌常見的運(yùn)動方式有3種：泳動運(yùn)動、群集運(yùn)動和蹭行運(yùn)動[25]。本研究發(fā)現(xiàn)敲除gacS基因后，細(xì)菌在3種運(yùn)動平板上的運(yùn)動直徑均明顯增大，這一現(xiàn)象與魏雪[26]在P.aeruginosaM18中觀察到的gacA缺失菌株的運(yùn)動性表型極為相近。

然而，本研究并未深入到基因或蛋白質(zhì)表達(dá)層次的調(diào)控研究。許多研究表明Gac系統(tǒng)是通過下游sRNA進(jìn)行調(diào)控作用的[27]。HYS中確實(shí)存在RsmY/Z/A sRNA[10]，但如何對細(xì)菌的運(yùn)動能力以及LPS、氫氰酸和蛋白酶的生成進(jìn)行調(diào)控還有待深入研究，尤其是HYS中Gac系統(tǒng)調(diào)控LPS的模式與其他菌株不同，提示HYS中RsmY/Z/A sRNA對LPS可能存在特殊的調(diào)控模式。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)相比人類機(jī)會致病菌PAO1，HYS具備更強(qiáng)的線蟲致死能力，敲除株ΔgacS通過下調(diào)多種毒力因子來影響其毒性的產(chǎn)生。本研究的結(jié)果為未來深入探討HYS中毒力因子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時也為HYS可能引起的動物毒害作用提供了抗毒研究的新思路。