曾 堅，黃芷頤，章玉香，吳春來，胡 偉*

(1.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

【研究意義】植物在生長過程中會經(jīng)歷不同逆境，包括生物逆境和非生物逆境。為適應(yīng)自然環(huán)境，植物在應(yīng)對這些逆境的過程中進化出了許多抵御機制[1-2]。熱休克反應(yīng)是植物適應(yīng)環(huán)境過程中非常重要的防御機制，而作為調(diào)節(jié)熱休克蛋白的關(guān)鍵因子，熱休克轉(zhuǎn)錄因子能夠提高植物應(yīng)對熱、干旱和氧化損傷等逆境的適應(yīng)能力。HSF能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)相關(guān)抗逆基因的表達，從而提高植物的抗逆能力，在植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中起著非常重要的作用[3-6]。【前人研究進展】HSF提高植物應(yīng)對非生物逆境的研究已有許多報道，例如在番茄中過表達SlHsfA1可以提高植株的耐熱性[7]。在擬南芥中過表達HSFA2可以提高植株對高鹽、滲透脅迫和高氧化水平環(huán)境的耐受能力；過表達HSFA6a和HSFA6b則可以大幅度提高植株對冷和高鹽的耐受水平[8-9]。在水稻中過表達TaHSFA4a還可以提高植株對重金屬的耐受能力[10]。因此，HSF不同的基因在不同植株中可以提高植物應(yīng)對不同逆境脅迫的能力?！颈狙芯壳腥朦c】木薯 (Manihotesculenta) 在熱帶及亞熱帶地區(qū)被廣泛種植，是三大薯類作物之一，約占全世界10 %人口的主食，同時也是工業(yè)淀粉和生物酒精生產(chǎn)的重要原料[11-13]。木薯具有非常好的抗旱和耐貧瘠特性，隨著能源資源的緊缺，木薯作為生物質(zhì)能源的潛力越來越被重視。因此，如何提高木薯在干旱脅迫下的適應(yīng)能力具有重要意義。另外，木薯塊根采后會出現(xiàn)“采后生理性變質(zhì)”(post-harvest physiological deterioration, PPD)，不耐儲藏嚴重限制了木薯加工利用的快速發(fā)展[14-16]。因此，研究木薯PPD過程和響應(yīng)干旱脅迫的機理具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用前期木薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過PCR技術(shù)克隆得到一個熱激轉(zhuǎn)錄因子MeHSF18基因，并對其蛋白序列，保守結(jié)構(gòu)域和進化關(guān)系進行了初步分析，對MeHSF18基因在干旱脅迫、ABA處理和PPD過程下的表達模式進行了分析，以期進一步研究MeHSF18基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用適應(yīng)性強和較耐旱的木薯材料SC124品種(由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存)進行基因克隆和后續(xù)處理。

1.2 材料處理

將木薯莖稈切成包含3～4個芽點的小節(jié)，將其種入蛭石和營養(yǎng)土比例為1∶1的基質(zhì)中生長。待生長約60 d后，選取生長狀況一致的木薯幼苗作為后續(xù)實驗材料。正常生長和采用PEG-6000進行干旱模擬處理，對照植株澆灌水，處理0、3、5、7 d后采集木薯葉片樣品用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存；正常生長和使用100 μmol/L ABA進行澆灌，處理0、3、5、7 d后采集木薯葉片樣品用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存；

取10個月的木薯塊根，選取中間部分切成5 mm左右的薄片，置于25 ℃、70 %相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行暗培養(yǎng)，分別在0、6、12、48 h取樣，采集的木薯樣品用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存。

1.3 基因克隆

使用天根生化科技有限公司和賽默飛世爾科技公司的RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)MeHSF18基因的全長cDNA序列設(shè)計引物(P1: 5'- ATGGCGCAGCGGTCAGTTCC -3';P2: 5'- TTAGATCTTGATTTCCTTTGCGTGG -3')，以木薯葉片cDNA為模板進行MeHSF18基因擴增。擴增產(chǎn)物連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑選陽性單克隆進行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

在NCBI中用BLAST搜索其它物種中和MeHSF18基因同源的蛋白質(zhì)序列；預(yù)測亞細胞定位用Plant-mPLoc；預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫；蛋白質(zhì)的等電點和分子量通過ExPASy ProtParam計算；用DNAMAN對這些序列進行比對；利用MEGA中的Neighbor-Joining (NJ)法構(gòu)建進化樹；用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。

1.5 基因的表達分析

將相應(yīng)處理的樣品提取RNA，建庫并測序，這部分工作由美吉生物技術(shù)有限公司完成。測序平臺是Illumina GAII (Illumina, San Diego, CA, USA)。使用FASTX-toolkit和FastQC移除接頭序列和低質(zhì)量序列。利用Tophat 2.0軟件將clean reads和木薯基因組參考序列進行比對，將比對結(jié)果用Cufflinks來組裝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。表達水平使用FPKM(Fragments per kilobase per million mapped reads)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeHSF18 基因的克隆

用擬南芥AtHSF16 基因( 登錄號: At4g36990) 的蛋白質(zhì)序列在數(shù)據(jù)庫 (Phytozome) 進行BLASTp 比對搜索，得到木薯同源序列 (Manes.13G124500.1)，根據(jù)序列設(shè)計PCR引物進行目的片段擴增(圖1)。目的片段進行測序后獲得一個ORF為867 bp 的序列，編碼289個氨基酸 (圖2)，將其命名為MeHSF18。通過序列比對發(fā)現(xiàn)MeHSF18基因與參考序列之間總共存在3個堿基差異，都為同義突變(圖2) 。將MeHSF18基因與基因組序列比對得知，該基因含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。通過ProtParam對MeHSF18蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測，MeHSF18蛋白質(zhì)的分子式為C1367H2162N396O454S8，分子量為31.67 KDa，理論等電點( pI) 為5.90，不穩(wěn)定系數(shù)為32.19，屬于穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示定位于細胞核。通過對MeHSF18基因編碼的蛋白質(zhì)序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，MeHSF18基因含有HSF基因家族的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，結(jié)果進一步表明克隆得到的基因為木薯MeHSF18基因。

M: Marker DL 2000；MeHSF18基因在染色體位置(B)M: Marker DL 2000; The location of MeHSF18 in chromosome 13

MeHSF18與參考序列之間存在3個堿基差異用箭頭標出The three SNPs between MeHSF18 and the reference sequence were marked by arrows

圖3 MeHSF18 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of MeHSF18 protein

2.2 MeHSF18 氨基酸序列同源性比對和進化分析

以MeHSF18基因蛋白質(zhì)序列為探針，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索并下載相關(guān)基因的氨基酸序列，其中與橡膠樹 (XP_021656118.1) 和麻瘋樹 (XP_012079229.1) 的氨基酸同源性最高，分別為86.94 %和83.51 %。利用DNAMAN軟件進行多重序列比對(圖4)發(fā)現(xiàn)，MeHSF18基因編碼的蛋白質(zhì)序列和其它植物中的HSF蛋白的氨基酸序列一致性非常高，具有HSF蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。在N端1～100氨基酸殘基位置含有高度保守的DNA Binding Domain，在N端168～195氨基酸殘基位置含有HR-A Core，HR-B Core和插入序列，表明MeHSF18基因編碼的蛋白質(zhì)屬于HSFB家族。在C端269～280氨基酸殘基位置含有核定位信號 (Nuclear localization signal, NLS)。進化樹分析顯示，木薯MeHSF18基因和橡膠樹的HSF基因聚在一起，氨基酸序列一致性最高(圖5)。同時MeHSF18基因蛋白序列與麻瘋樹、蓖麻、榴蓮、蜜桔的HSF親緣關(guān)系較高，序列一致性分別為83.51 %、73.31 %、69.79 %和70.40 %。

XP_021678492.1橡膠樹；XP_012070195.1 麻風(fēng)樹；XP_015578895.1 蓖麻；EEF36489.1 蓖麻；XP_011033721.1胡楊；XP_002321069.1三葉楊；AKV56389.1小葉楊；TKS14059.1新疆楊；KAB5527533.1柳樹；EOX92921.1可可XP_022741496.1榴蓮；XP_002278037.1葡萄XP_021678492.1 Hevea brasiliensis；XP_012070195.1 Jatropha curcas；XP_015578895.1 Ricinus communis；EEF36489.1 Ricinus communis；XP_011033721.1 Populus euphratica；XP_002321069.1 Populus trichocarpa；AKV56389.1 Populus simonii；TKS14059.1 Populus alba；KAB5527533.1 Salix brachista；EOX92921.1 Theobroma cacao XP_022741496.1 Durio zibethinus；XP_002278037.1 Vitis vinifer

圖5 木薯MeHSF18基因與其他物種HSF基因系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of MeHSF18 in cassava and HSF genes from other species

2.3 MeHSF18 基因的組織表達分析

為詳細分析MeHSF18基因在木薯不同組織中的表達水平，從數(shù)據(jù)庫中下載得到木薯11個組織的表達數(shù)據(jù)[17]，分別是葉(Leaf)，中脈(Midvein)，葉柄(Petiole)，莖(Stem)，側(cè)芽(Lateral bud)，頂端分生組織(Shoot apical meristem, SAM)，根(Storage root, SR)，須根(Fibrous root, FR)，根頂端分生組織(Root apical meristem, RAM)，分化胚組織(Organized embryogenic structure, OES)，松散性胚性愈傷組織(Friable embryogenic calli, FEC)。MeHSF18基因在不同組織中的表達水平不一樣，在葉和SAM中的表達水平最低，在根相關(guān)的組織SR，F(xiàn)R和RAM中的表達水平最高(圖6)。在根相關(guān)組織中的表達水平是葉中的10～20倍。這些結(jié)果表明MeHSF18基因在木薯根相關(guān)組織中有重要作用。

圖6 MeHSF18基因在木薯不同組織中的表達分析Fig.6 Expression analysis of MeHSF18 in different tissues/organs of cassava

2.4 MeHSF18在不同脅迫條件下的表達分析

已經(jīng)有研究報道指出HSF基因在植物應(yīng)答非生物脅迫的過程中起作用。因此分析了MeHSF18基因在干旱和ABA處理下的表達水平。在模擬干旱的PEG脅迫條件下，MeHSF18基因的表達水平隨著處理時間增加而增高，在處理后7 d達到最高，分別提高了1.5、2.4和10倍。使用ABA進行處理發(fā)現(xiàn)MeHSF18基因在葉片中的表達量也顯著上調(diào)，處理3、5、7 d后分別上調(diào)了1.7、2.0和1.9倍 (圖7)。

*表示與對照相比差異顯著 (P<0.05)* represented significant difference compared to control (0 days) (P<0.05)

木薯的PPD嚴重影響了木薯的存儲。有研究報道HSF和氧化損傷密切相關(guān)，因此分析了MeHSF18基因在木薯PPD過程中的表達水平。采后MeHSF18基因的表達水平隨著時間增加而增高，6、12、48 h后分別上調(diào)了1.6、2.3和2.0倍 (圖8)。

*表示與對照相比差異顯著 (P<0.05)* represented significant difference compared to control (0 hours) (P<0.05)

3 討 論

在植物中HSF基因?qū)儆诙嗷蚣易?，根?jù)結(jié)構(gòu)特征可以分為A，B和C家族。本研究克隆得到的MeHSF18基因全長為867 bp，編碼289個氨基酸。序列分析表明MeHSF18基因的蛋白質(zhì)序列具有典型的HSFB家族的保守結(jié)構(gòu)域[7]，進化樹分析顯示MeHSF18基因與麻瘋樹和蓖麻等物種的親緣關(guān)系較近。

HSF在不同的組織中有不同的表達水平。例如水稻中HSF在所有組織都有表達，沒有基因特異性的只在某一個組織中表達。但是擬南芥中的AtHSF9基因則只在種子中表達[18]。本研究中MeHSF18基因在葉片中表達最低，在根相關(guān)組織中表達量最高，推測該基因主要在木薯塊根中發(fā)揮作用。

HSF是植物響應(yīng)非生物脅迫逆境的重要調(diào)節(jié)因子，不同的HSF對不同的逆境有不同的響應(yīng)[19-20]。例如，在擬南芥中，AtHsfA9能夠通過ABA信號通路提高植株應(yīng)對干旱脅迫的能力，而AtHSFA2和AtHSFA8則可以提高植株應(yīng)對鹽和滲透脅迫的能力[21]。在水稻中，OsHSF17和OsHSF29也可以提高植株應(yīng)對鹽和滲透脅迫的能力[22]。另外，HSF也被認為和氧化脅迫密切相關(guān)，如OsHsfC2a和OsHsfA5被認為是ROS感知和含量積累的重要基因[23-24]。在本研究中，MeHSF18基因受到干旱和ABA的調(diào)控，表明MeHSF18基因可能通過依賴于ABA信號通路的途徑來響應(yīng)干旱脅迫。而MeHSF18基因在木薯PPD過程中的高表達則暗示該基因可能和氧化脅迫相關(guān)來影響木薯塊根的PPD過程。對這些結(jié)果的進一步研究將有可能為木薯的抗逆和延緩PPD過程提供理論參考。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到了木薯MeHSF18基因，該基因全長為867 bp，編碼289個氨基酸殘基數(shù)，蛋白保守結(jié)構(gòu)域和進化關(guān)系分析顯示該基因為HSFB家族成員之一。在ABA處理和模擬干旱脅迫下，MeHSF18基因的表達升高，表明MeHSF18基因可能通過依賴于ABA信號通路的途徑來響應(yīng)干旱脅迫。而木薯PPD過程中的高表達則推測該基因可能和氧化脅迫相關(guān)。下一步將通過對基因功能的研究來驗證該基因在木薯抗旱和PPD中的作用。