王麗琴,荊得寶,朱 靜,焦紅衛(wèi)

(1.上海市口腔病防治院分院口腔內(nèi)科,上海 200031; 2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院口腔科,上海 200135; 3.上海市口腔病防治院特需門診,上海 200031)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs,matrix metalloproteinases)是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族,可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì),其分為五大類:膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、膜型MMPs以及結(jié)構(gòu)和功能比較特殊的MMPs[1-2]?；|(zhì)金屬蛋白酶與口腔多種疾病有著密切的關(guān)系。MMPs通過降解牙本質(zhì)的膠原參與齲病的發(fā)展,并與牙髓炎、根尖周炎的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[3]。體外研究發(fā)現(xiàn),在炎癥因子的刺激下,牙髓細(xì)胞能夠合成的MMPs有:MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MT1-MMP、MMP-20和MMP-28[4-6]。生理?xiàng)l件下MMPs 的水平較低,其與TIMPs的平衡維持著牙髓組織的健康,牙髓組織在炎癥狀態(tài)下,MMPs的水平顯著增高。通過檢查齲洞內(nèi)牙本質(zhì)液MMP-9的含量,在不可逆牙髓炎患牙牙本質(zhì)液中可檢出較高含量的MMP-9,健康對照樣本中未能檢出MMP-9,提示牙髓炎可致牙髓組織MMP-9水平升高[7]。Evrosimovska等[8]通過對比慢性牙髓炎組織和正常牙髓組織中MMP-1,MMP-8,MMP-13的水平,發(fā)現(xiàn)炎癥組織中MMPs水平顯著升高。提示MMPs參與牙髓炎癥的發(fā)展,與炎癥過程中細(xì)胞外基質(zhì)的破壞密切相關(guān)。

研究擬探討臨床常用的3種根管沖洗液對炎癥牙髓組織中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-8、MMP-9、MMP-2水平的影響。希望藉此了解臨床常用根管沖洗液對與牙髓炎密切相關(guān)的MMPs的影響。

1 研究對象和方法

1.1 材料和儀器

材料:人MMP-8、MMP-9、MMP-2ELISA試劑盒(武漢新啟迪生物科技公司,中國);2%氯己定(錦州藥業(yè)有限公司,中國);1%次氯酸鈉(南昌普陽科技有限公司,中國);3%雙氧水(江西健保醫(yī)藥科技有限公司,中國)。

儀器:離心機(jī)(Sorvall LengendRT型低溫離心機(jī),德國);酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國)。

1.2 研究對象的選擇

選擇診斷為牙髓炎需根管治療的患牙40例。標(biāo)準(zhǔn):無系統(tǒng)性疾病,近3個月未使用抗生素及免疫制劑,牙周袋<3 mm,能夠配合完成根管治療。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 患者隨機(jī)分為4組,分別為氯己定組、次氯酸鈉組、雙氧水組、對照組(生理鹽水組)。氯己定組處理方式:根管預(yù)備期間采用5 mL 2%氯己定溶液沖洗。次氯酸鈉組處理方式:根管預(yù)備期間采用5 mL 1%次氯酸鈉溶液沖洗。雙氧水組處理方式:根管預(yù)備期間采用5 mL 3%雙氧水溶液沖洗。生理鹽水組:根管預(yù)備期間采用5 mL 0.9%生理鹽水溶液沖洗。

(2) 患牙常規(guī)上橡皮障,去除腐質(zhì),開髓,去除冠髓,手用K銼擴(kuò)通根管至25#,吸潮紙捻取樣。常規(guī)機(jī)用鎳鈦挫擴(kuò)挫,根管沖洗液沖洗,干燥,再次吸潮紙捻取樣。

(3) 根管滲出液提取方法:用25號吸潮紙尖放入根管內(nèi),達(dá)到工作長度,放置30 s,迅速拿出放回至消毒EP管內(nèi),重復(fù)取3次。樣品置-70 ℃低溫冰箱存貯。

(4) 樣品檢測,ELSA檢測MMP-8,MMP-9,MMP-2水平。

1.4 樣本處理

(1) 將放置試紙條的離心管加入500 μL的pH 7.2 0.1 M的PBS,反復(fù)沖洗吹打,最后離心10 000 轉(zhuǎn)15 min,取上清備用。

(2) 樣品采用雙抗體夾心ABC-ELISA法進(jìn)行檢測,依照試劑盒說明進(jìn)行樣品檢測。最后通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中MMP-8,MMP-9,MMP-2的濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計完成。采用配對樣本進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

(1) 3種根管沖洗液對MMP-9水平的影響 統(tǒng)計結(jié)果顯示不同根管沖洗液對MMP-9水平具有影響。數(shù)據(jù)表明治療后MMP-9濃度均較治療前降低,4組差別均有統(tǒng)計學(xué)意義,其中氯己定組和雙氧水組P<0.01,次氯酸鈉組和對照組生理鹽水組P<0.05(見表1)。

表1 3種根管沖洗液對MMP-9水平的影響

(2) 3種根管沖洗液對MMP-8水平的影響 統(tǒng)計結(jié)果顯示不同根管沖洗液對MMP-8具有影響。數(shù)據(jù)顯示治療后4組MMP-8水平均較治療前低,其中氯己定組和雙氧水組治療前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),其余3組差異無顯著性(見表2)。

表2 3種根管沖洗液對MMP-8水平的影響

(3) 3種根管沖洗液對MMP-2水平的影響 統(tǒng)計結(jié)果顯示不同根管沖洗液對MMP-2水平具有影響。數(shù)據(jù)表明氯己定組治療后MMP-2水平降低,差異有顯著性(P<0.01),其余3組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

3 討論

(1) MMPs和牙髓炎的關(guān)系 在牙髓炎的發(fā)展過程中,MMP家族蛋白在炎癥的進(jìn)展中扮演雙重角色,既能激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)參與防護(hù),也能引起組織的破壞。有研究顯示,細(xì)菌及其內(nèi)毒素能引起牙髓組織感染,刺激中性粒細(xì)胞脫顆粒,釋放炎癥因子,從而誘導(dǎo)MMPs的活化。Accorsi-Mendon?a T等采用明膠酶譜法和ELISA,檢測正常牙髓組織和炎癥牙髓組織中MMP-9,MMP-2,TIMP-2,MPO的濃度和活性,發(fā)現(xiàn)炎癥牙髓組織中MMP-9,MMP-2,TIMP-2和MPO的水平均有上升,且只有炎癥組織中能檢測到活化MMPs[9]。另外,在牙髓的膿腫組織和根管滲出液中,能發(fā)現(xiàn)高水平的MMP-8表達(dá)。而根管治療治療能降低MMP-8的表達(dá)[10]。實(shí)驗(yàn)中,4組患牙根管治療后MMP-9、MMP-8、MMP-2的水平均有不同程度下降,證明根管沖洗對MMP-9、MMP-8、MMP-2有明顯的抑制作用。

表3 3種根管沖洗液對MMP-2水平的影響Table 3 Effect of three kinds of root canal rinse solutions on the level of MMP-2

由于MMPs與牙髓炎的密切關(guān)系,有學(xué)者認(rèn)為MMPs可能成為牙髓炎的標(biāo)準(zhǔn)性生化指標(biāo),用于輔助牙髓炎的臨床診斷。牙髓炎的轉(zhuǎn)歸首選是牙髓復(fù)合體的修復(fù)和再生,否則,就是慢性炎癥持續(xù)存在或牙髓壞死發(fā)生。評價牙髓炎的嚴(yán)重程度,是預(yù)測臨床治療成功與否的必要條件。單純依靠臨床癥狀的評估方法,其局限性是顯而易見的。分子水平的檢測方法,可以成為臨床鑒別可逆與不可逆牙髓炎的輔助工具,提高保髓治療的成功率。Zanini等[11]對32篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析,綜述了炎性介質(zhì)在臨床診斷中的作用,認(rèn)為量化的炎癥介質(zhì)有助于臨床區(qū)別可逆與不可逆牙髓炎。并認(rèn)為IL-8和MMP-9的水平能夠表明中性粒細(xì)胞在牙髓組織中的水平,有可能成為牙髓炎癥的標(biāo)志性因子。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-9在牙髓炎根管滲出液的濃度明顯高于MMP-2,MM-8,表明MMP-9可能與牙髓炎癥的發(fā)生發(fā)展更加密切。

(2) 不同根管沖洗液對MMPs的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MMP-9、MMP-8、MMP-2在牙髓炎癥中均有表達(dá),其中MMP-9濃度最高。1%次氯酸鈉、2%氯己定、3%雙氧水、0.9%生理鹽水4種根管沖洗液均能使MMPs水平降低,其中2%氯己定能顯著降低MMP-9、MMP-8、MMP-2的濃度。1%次氯酸鈉能顯著降低MMP-9的水平,雙氧水能顯著降低MMP-9和MMP-8的濃度。4組沖洗液中,氯己定對基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制作用更加有效。

(3) 氯己定在牙體牙髓疾病治療中的作用 氯己定是一種雙胍類抗菌藥物,它含有對稱的2個 4-氯苯環(huán)和雙胍基團(tuán),中間由環(huán)己烷橋連結(jié)。常用的氯己定制劑有:葡萄糖酸氯己定、醋酸氯己定和鹽酸氯己定3種[12]。

氯己定是目前研究最多的非特異性MMPs抑制劑,Gendron等[13]首次研究發(fā)現(xiàn)氯己定有抑制 MMP-2、MMP-8、MMP-9 的作用,并認(rèn)為氯己定會成為新型的抗菌劑。目前氯己定是常用的口腔抗菌藥物,它能降低菌斑數(shù)量,減少牙齦出血,由于氯己定作用安全,副作用小,常添加于漱口水,用于牙周炎癥治療,也常用于窩洞消毒及根管沖洗。

氯己定抑制MMPs的機(jī)制可能是氯己定通過螯合作用結(jié)合鈣、鋅離子,從而抑制MMPs催化區(qū)域的活性[14]。氯己定的有效體積分?jǐn)?shù)為0.002%～4%,最常用的體積分?jǐn)?shù)是0.2%和2%。有研究顯示,氯己定能夠抑制牙本質(zhì)來源的半胱氨酸組織蛋白酶的蛋白水解活性,說明氯己定是牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體中半胱氨酸組織蛋白水解酶的抑制劑,還可能通過抑制半胱氨酸組織蛋白酶的作用參與炎癥的控制[15]。

近年的研究發(fā)現(xiàn),MMPs不僅與牙髓的炎癥有關(guān),還與牙本質(zhì)粘結(jié)修復(fù)密切相關(guān),根管沖洗液對樹脂粘結(jié)的影響也得到關(guān)注。Mohammadi等[16]綜述了1980—2016年間的相關(guān)文獻(xiàn),評價了根管沖洗液對牙本質(zhì)粘結(jié)的影響,包括常用的根管沖洗液次氯酸鈉、氯己定、乙二胺四乙酸、四環(huán)素、酸和清潔劑的混合物、臭氧。結(jié)果顯示,次氯酸鈉可能降低、加強(qiáng)或者對粘結(jié)強(qiáng)度無作用。氯己定、酸和清潔劑的混合物能顯著提高樹脂-牙本質(zhì)粘結(jié)的穩(wěn)定性,而臭氧治療對粘結(jié)強(qiáng)度的作用尚有爭議。

氯己定作為MMPs的非特異性抑制劑,能夠和MMPs競爭結(jié)合陽離子形成金屬螯合物,從而抑制MMPs的活性,在牙本質(zhì)粘結(jié)過程中,達(dá)到減緩膠原纖維降解,穩(wěn)定混合層,增加粘結(jié)效果,提高粘結(jié)耐久性的目的。實(shí)驗(yàn)也證明氯己定具有抑制MMP-9、MMP-8、MMP-2的作用。對于根管沖洗液的作用和選擇,需要綜合考慮到治療的各個步驟中。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),臨床常用的3類根管沖洗液均具有降低MMPs的作用,其中氯己定有最顯著抑制MMPs的效果。氯己定能夠有效的抑制牙髓炎癥組織中的MMPs,又可以增加牙本質(zhì)粘結(jié)強(qiáng)度,是牙體牙髓病治療與修復(fù)較好的治療選擇。