吳玲梅 溫智清 楊雪冰 董國(guó)棟 李旭東 王飛 鄭曉聰 劉葒 賈鵬 毛明光

摘要：2019年6月，河南鄭州某鯉養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生鯉急性爛鰓病，累計(jì)死亡率約40%。為研究發(fā)病病因和疾病流行規(guī)律，對(duì)病魚解剖，進(jìn)行細(xì)菌和寄生蟲檢測(cè)、組織病理學(xué)檢測(cè)、PCR檢測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，病魚體表黏液增多，眼球凹陷，頭蓋骨凹凸不平，鰓腫脹并伴有潰爛，腎臟腫大至鰾間隔。體視鏡下可見(jiàn)病魚鰓絲末端鈍圓、呈棒狀，鰓絲間充滿大量黏液。組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)病魚鰓絲和鰓小片組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，鰓絲上皮細(xì)胞增生、壞死脫落，鰓弓遠(yuǎn)端和近端鰓小片均有明顯增生且相互融合。PCR方法從病魚中檢出鯉浮腫病毒（carp edema virus，CEV），而SVCV和KHV檢測(cè)結(jié)果為陰性。另外，病魚體表和鰓并未見(jiàn)任何寄生蟲，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)也未分離到任何與鯉爛鰓病相關(guān)的病原菌。遺傳進(jìn)化分析表明，此次檢出的CEV毒株屬于Ⅱa基因亞型，且與中國(guó)分離株（AS1、WJ2016）及日本分離株（CyPP3）的同源性最高，約為98.8%。初步推斷Ⅱa基因亞型CEV可能是引起此次鄭州鯉急性爛鰓病的主要病因，后續(xù)養(yǎng)殖中需加強(qiáng)對(duì)該病進(jìn)行防控。

關(guān)鍵詞：鯉急性爛鰓病;鯉浮腫病毒;癥狀;病原鑒定

中圖分類號(hào)：S941.42+4 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0167-06

2018年我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)總產(chǎn)量達(dá)4 991.06萬(wàn)t，約占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%，是世界上唯一水產(chǎn)品養(yǎng)殖總量超過(guò)捕撈總量的漁業(yè)國(guó)家。鯉魚作為我國(guó)第四大淡水養(yǎng)殖品種，2018年總產(chǎn)量達(dá)到296.2萬(wàn)t[1]，是我國(guó)消費(fèi)者動(dòng)物性蛋白的主要來(lái)源之一。河南省作為黃河鯉養(yǎng)殖大省，其2018年產(chǎn)量約23.0萬(wàn)t，居全國(guó)第三。然而，老病新發(fā)、外來(lái)病和新發(fā)疫病等情況成為鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，例如鯉春病毒血癥（spring viraemia of carp，SVC）和錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpes virus disease，KHVD）等老病以及鯉急性爛鰓病等新發(fā)疫病[2]。鯉急性爛鰓病作為一種新發(fā)疫病，自2003年在河南地區(qū)出現(xiàn)以來(lái)，逐漸在河南鯉養(yǎng)殖體系廣泛流行，養(yǎng)殖池塘發(fā)病率約60%，單個(gè)池塘累計(jì)死亡率為50%～80%[3-4]，對(duì)當(dāng)?shù)仵庰B(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2013年洛陽(yáng)市因該病造成約1 000 t鯉死亡，損失上千萬(wàn)元[3]。然而，對(duì)于這種新發(fā)疫病，無(wú)論鯉養(yǎng)殖從業(yè)者還是魚病研究人員均未能提出有效防控措施，究其原因是該病的病原尚不明確。2019年6月，鄭州某鯉養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)鯉急性爛鰓病，本研究采集樣品后對(duì)其進(jìn)行初步分析，以探究其發(fā)病原因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月，河南省鄭州市某鯉養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)鯉急性爛鰓病，發(fā)病鯉體質(zhì)量400～500 g，累計(jì)死亡率約40%，發(fā)病水溫23 ℃。隨機(jī)采集10尾瀕死鯉，低溫保存帶至實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步分析。

1.2 細(xì)菌和寄生蟲檢測(cè)

肉眼檢查病魚體表、鰓、肝臟、腸道等組織是否有寄生蟲。同時(shí)對(duì)鰓絲制備組織壓片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲觀察。

無(wú)菌條件下，用無(wú)菌環(huán)從病魚腎臟和肝臟挑取樣品，劃線接種于BHIA平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.3 鰓絲病理觀察

取部分病魚鰓置于含有生理鹽水的平皿中，輕輕漂洗1次，將其轉(zhuǎn)移至新的生理鹽水中，置于體視鏡（Leica，德國(guó)）下進(jìn)行形態(tài)觀察。同時(shí)，采集健康鯉的鰓作為對(duì)照。

1.4 組織病理學(xué)檢測(cè)

采集病魚的鰓組織樣本，切成約5 mm×5 mm組織塊，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。固定組織經(jīng)水洗、乙醇梯度脫水、甲苯透明、石蠟浸泡后包埋呈石蠟組織塊。在常溫下，采用Leica組織切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片（厚度5 μm），載玻片貼附37 ℃過(guò)夜后HE染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟-乙醇梯度復(fù)水-水洗-蘇木素染色-分化藍(lán)化-伊紅復(fù)染-乙醇梯度脫水-二甲苯透明-樹脂膠包埋-膠包70 ℃烤片48 h。HE染色結(jié)果為細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，脂滴和水泡不著色。染色結(jié)果經(jīng)光學(xué)顯微鏡（Zeiss，美國(guó)）觀察并拍照記錄。

1.5 PCR檢測(cè)

采集病魚的鰓、腦、腎臟和脾臟混合并勻漿，取約30 mg用于核酸抽提。使用TaKaRa MiniBEST viral RNA/DNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取總核酸（DNA和RNA），操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書?？偤怂嵊糜跈z測(cè)CEV、KHV和SVCV，PCR引物和擴(kuò)增靶基因見(jiàn)表1。CEV套式PCR體系和反應(yīng)條件參見(jiàn)溫智清等的研究方法[5]。KHV和SVCV檢測(cè)參考《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》“2.3.7”章[6]和“2.3.9”章[7]。PCR檢測(cè)樣品設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 電泳和測(cè)序分析

使用QIAxcel 全自動(dòng)凝膠電泳儀（QIAgen，德國(guó)）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用clustal W生物學(xué)軟件megalign方法對(duì)共計(jì)31條CEV序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA X生物學(xué)軟件maximum likelihood method中的Tamura 3-parameter模型進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，序列之間比對(duì)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

發(fā)病魚主要的臨床癥狀為在水面聚集慢游，鰓腫脹并潰爛（圖1-A），唇與鼻之間凹陷、頭骨凹凸不平（圖1-B），眼睛凹陷（圖1-C），腎臟腫大至鰾間隔（圖1-D）。

2.2 細(xì)菌和寄生蟲檢測(cè)

將挑去的肝臟和腎臟組織樣品置于BHIA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，未見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌落生長(zhǎng)。病魚體表和鰓絲壓片觀察未見(jiàn)寄生蟲。

2.3 鰓絲病變

正常鯉鰓絲末端呈尖狀，形態(tài)清晰，且無(wú)白色黏液（圖2-A）。體視鏡下，可見(jiàn)病魚鰓絲末端鈍圓，呈棒槌狀，形態(tài)不清，鰓絲周圍附有白色絮狀黏液（圖2-B）。

2.4 組織病理變化

組織病理學(xué)結(jié)果表明，健康鯉鰓絲組織結(jié)構(gòu)正常，鰓小片呼吸上皮細(xì)胞偶見(jiàn)空泡變性，鰓絲和鰓小片毛細(xì)血管豐富，偶見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落（圖3-A）?；疾◆~鰓絲、鰓小片組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，鰓絲上皮細(xì)胞增生、壞死脫落，鰓弓遠(yuǎn)端和近端鰓小片均有明顯增生，相互融合（圖3-B）。

2.5 PCR檢測(cè)

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，KHV和SVCV未見(jiàn)特異性擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果均為陰性;CEV套氏PCR第一步PCR和第二步PCR分別擴(kuò)增出528 bp和478 bp大小的目的條帶，表明CEV PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（圖4）。

2.7 CEV序列分析

對(duì)CEV第一步PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并以CEV P4a的357 bp基因片段進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，此次河南鄭州檢測(cè)到的CEV 20190530株屬于Ⅱa基因亞型（圖5），并且和中國(guó)分離株（AS1和WJ2016）和日本分離株（CyPP3）同源性最高，約為98.8%。

3 討論

根據(jù)病原和導(dǎo)致臨床癥狀的不同，通常將鯉急性爛鰓病分為寄生蟲性爛鰓、細(xì)菌性敗血癥性爛鰓和腎炎型急性爛鰓3種[3]。寄生蟲性爛鰓常見(jiàn)于黏孢子蟲[9]、指環(huán)蟲、車輪蟲[10]和三代蟲[11]等引起的爛鰓病，肉眼可見(jiàn)病魚體表、內(nèi)臟或鰓上的寄生

蟲，鰓上附有白點(diǎn)狀的黏孢子蟲包囊，顯微鏡下可見(jiàn)包囊中有大量孢子[12]。細(xì)菌性敗血癥性爛鰓主要是由柱狀屈橈桿菌[11]和柱狀黃桿菌[13]等引起，可分為慢性爛鰓和急性爛鰓，普通鯉、草魚和鰱等鯉科魚類均易發(fā)生。腎炎型急性爛鰓可能由KHV[14-15]等病毒性病原引起，常見(jiàn)于普通鯉和錦鯉感染后發(fā)病。河南地區(qū)流行的鯉急性爛鰓病也同樣分為寄生蟲性爛鰓、細(xì)菌性敗血癥性爛鰓和腎炎型急性爛鰓，這3種爛鰓病在河南地區(qū)發(fā)病占比分別為1%～2%、60%～70%和30%～40%[3]。多家科研單位從河南鯉急性爛鰓病病魚中鑒定出KHV、柱狀黃桿菌、維隆氣單胞菌、霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、腐敗瓦希菌群等[3]。因此，在發(fā)生鯉急性爛鰓病時(shí)，應(yīng)該通過(guò)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果加以區(qū)分，做到有針對(duì)性地治療。

CEV感染主要發(fā)生于15～25 ℃，表現(xiàn)為普通鯉體表浮腫或錦鯉嗜睡，鰓潰爛壞死，眼睛凹陷[16]。此次鄭州某鯉養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)鯉急性爛鰓病時(shí)水溫約為23 ℃，病魚出現(xiàn)以唇與鼻之間凹陷、頭骨凹凸不平、眼睛凹陷、腎臟腫大至鰾間隔的主要臨床癥狀，發(fā)病水溫和部分臨床癥狀與鯉浮腫病毒感染相似。體視鏡下可見(jiàn)病魚鰓絲末端鈍圓，呈棒槌狀，形態(tài)不清，鰓絲周圍附有白色黏液，患病魚鰓絲和鰓小片組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，鰓絲上皮細(xì)胞增生、壞死脫落，鰓弓遠(yuǎn)端和近端鰓小片均有明顯增生且相互融合，這和CEV的組織病理特征相吻合。Way等報(bào)道，被CEV感染的病魚鰓上皮細(xì)胞腫大并大量增生，鰓小片相互融合[16-17]。PCR方法從鄭州發(fā)病鯉僅檢出CEV，且基因序列與CEV中國(guó)分離株（AS1、WJ2016）及日本分離株（CyPP3）同源性約為98.8%，而細(xì)菌和寄生蟲檢測(cè)均為陰性，且養(yǎng)殖戶表述在鯉急性爛鰓病發(fā)生期間，使用抗生素?zé)o效反而加重其死亡，排除了致病性細(xì)菌和寄生蟲感染的可能。另外，徐立蒲等從河南5個(gè)出現(xiàn)有爛鰓癥狀的鯉養(yǎng)殖場(chǎng)中檢出CEV，而KHV均為陰性[18]。因此，初步推斷此次河南鄭州某鯉養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的鯉急性爛鰓病為腎炎型急性爛鰓病，其病原為CEV。但該結(jié)論還有待于通過(guò)柯赫氏法則做進(jìn)一步驗(yàn)證，并且由于鯉感染KHV后，其臨床癥狀和CEV感染的臨床癥狀十分相似[5，17]，所以臨床上可對(duì)CEV和KHV同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以盡快確定病因。

自1970年代日本新潟首次報(bào)道CEV以來(lái)，該病毒可能已通過(guò)錦鯉國(guó)際貿(mào)易傳播至世界其他國(guó)家[16]。2015年，我國(guó)首次在杭州某錦鯉養(yǎng)殖場(chǎng)鑒定出CEV[19]，隨后在云南[5]等多地均有確診。此次從河南鄭州患腎炎型急性爛鰓病病魚中檢出CEV，分析其P4a基因片段（357 bp）發(fā)現(xiàn)，與中國(guó)分離株（AS1和WJ2016）和日本分離株（CyPP3）同源性最高，均為98.8%，屬于Ⅱa基因亞型，推測(cè)CEV有可能通過(guò)錦鯉貿(mào)易從日本傳入我國(guó)，進(jìn)而從錦鯉養(yǎng)殖體系傳入普通鯉養(yǎng)殖體系。目前，基于CEV P4a基因的遺傳進(jìn)化分析，可將CEV主要分為Ⅰ和Ⅱ基因型;其中，CEVⅡ基因型可分為Ⅱa和Ⅱb這2個(gè)基因亞型[8]，并且隨著研究的逐步深入，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多新的CEV基因型[20]。但這些新的基因型也需要更多的研究結(jié)果證實(shí)其科學(xué)性。

目前，對(duì)因CEV感染引起的急性爛鰓病尚無(wú)有效的治療措施，濫用藥物、大換水、拉網(wǎng)捕撈等刺激性措施均會(huì)加重病魚死亡，所以應(yīng)以預(yù)防為主。日常應(yīng)提高養(yǎng)殖場(chǎng)管理水平，避免外來(lái)水生動(dòng)物或其他污染物進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng);定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行疫病監(jiān)測(cè);保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境，及時(shí)清理死魚;對(duì)水源進(jìn)行嚴(yán)格管理，養(yǎng)殖廢水要進(jìn)行無(wú)害化處理;同時(shí)在引進(jìn)苗種時(shí)，一定要做好隔離檢疫。

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