郭鶴寶 王星 何山文 張曉霞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）屬于芽孢菌屬，該菌株在自然界中的分布中極其廣泛，例如土壤、秸稈、植物根際、甚至湖泊污水中均可分離得到。解淀粉芽孢桿菌形態(tài)、培養(yǎng)特征以及生理生化、16S rRNA基因等方面均與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）等極其相似，常規(guī)鑒定方法難以確定相關(guān)類(lèi)群的分類(lèi)地位。隨著鑒定檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，持家基因如gyrA、gyrB、rpoB等片段［1］分析以及全基因組測(cè)序等方法應(yīng)用于解淀粉芽孢桿菌及其相近種類(lèi)的比較鑒定［2-3］。

2008年Wang等［4］通過(guò)DNA-DNA的相關(guān)性分析得出貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）是解淀粉芽孢桿菌的同物異名（B. amyloliquefaciens）。2016年Dunlap等［5］通過(guò)對(duì)“B. oryzicola”的基因組進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌并不是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，經(jīng)過(guò)基因組比較分析顯示甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（B. methylotrophicus）、解淀粉芽孢桿菌植物亞種和貝萊斯芽孢桿菌的基因組僅有微小差異，模式菌株間DNA-DNA雜交值均大于84%，遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)物種閾值70%。因此，將甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌植物亞種FZB42應(yīng)重新歸類(lèi)于貝萊斯芽孢桿菌的類(lèi)群中。

另外，解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌相關(guān)類(lèi)群具有廣泛的生物學(xué)功能，該類(lèi)群具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，其分泌的抗生素以及抗菌蛋白等物質(zhì)有抑制細(xì)菌和真菌的能力［6］，可以起到較好的生物防治效果；還能作為一種天然的防腐劑，并將其應(yīng)用于各種食品行業(yè)當(dāng)中，可以抑制腐敗真菌和致病菌的生長(zhǎng)［7］。此外，該類(lèi)群還發(fā)現(xiàn)能夠消除殘留的化學(xué)農(nóng)藥［8］、作為動(dòng)物的益生菌等功能［9］。據(jù)“中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）”數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，該菌株ACCC 19742對(duì)茄子灰霉病、黃瓜枯萎病的病原菌有一定的抑制作用，其發(fā)酵產(chǎn)物還可以促進(jìn)作物根系的生長(zhǎng)，可用于制備微生物肥料和生物有機(jī)肥等。

中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種中心庫(kù)藏菌株ACCC 19742是2014年從山東蔬菜大棚的土壤中分離并保藏，在ACCC數(shù)據(jù)庫(kù)中分類(lèi)地位為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。在菌種中心定期轉(zhuǎn)接保藏過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該菌株在同一培養(yǎng)基上出現(xiàn)兩種不同的菌落形態(tài)，兩株菌的16S rRNA基因相似性為100%，因此推測(cè)為同一株菌的不同形態(tài)變異型。經(jīng)16S rRNA基因和基因組比較，并結(jié)合API 20NE、BIOLOG及脂肪酸組成等表型特征分析，確定該菌株的分類(lèi)地位，并確定不同形態(tài)菌落的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及培養(yǎng)基 供試菌株：解淀粉芽孢桿菌ACCC 19742-1和ACCC 19742-2來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。培養(yǎng)基：BUG合成培養(yǎng)基（Biolog，Inc.）；TSA 合成培養(yǎng)基（DifcoTM）［10］；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；R2A 瓊脂培養(yǎng)基（DifcoTM），配方見(jiàn)參照文獻(xiàn)［10］。

1.1.2 主要試劑及儀器 API20 NE試驗(yàn)條及相關(guān)試劑耗材購(gòu)自生物梅里埃公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；革蘭氏染料試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 革蘭氏染色法 分別在R2A、TSA、BUG、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種19742-1和19742-2菌株，30℃培養(yǎng)過(guò)夜后觀察菌落形態(tài)；菌體使用革蘭氏染色試劑盒法進(jìn)行染色，參照文獻(xiàn)［11］。

1.2.2 脂肪酸分析法 具體方法參照Ichihara K等［12］文獻(xiàn)。

1.2.3 BIOLOG GEN-Ⅲ微孔板檢測(cè) 將19742-1和19742-2菌株在BUG培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；按照要求將菌液濁度調(diào)到90%后混勻，制成接種液；使用排槍將菌懸液按每孔100 μL的量加入到Gen-III微孔板的96孔內(nèi)；適溫培養(yǎng)4-6 h，12-24 h后通過(guò)BIOLOG鑒定系統(tǒng)（Microlog-M，MicroStation，Omnilog?）中的軟件讀取 Gen-III微孔板上所表現(xiàn)出的表型圖譜來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.2.4 API 20NE試劑條法 首先在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種19742-1和19742-2菌株，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，使用無(wú)菌棉簽挑取單菌落，逐量加入滅菌的0.85%生理鹽水，使用比濁管調(diào)節(jié)菌懸液的濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。按說(shuō)明書(shū)接種，30℃培養(yǎng)24 h，參考說(shuō)明表判讀最終結(jié)果。

1.2.5 16S rRNA及持家基因gyrB擴(kuò)增與分析 （1）DNA提?。喊凑毡本┨旄?xì)菌基因組DNA試劑盒中的說(shuō)明書(shū)提??；通用引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）；PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)中［10］方法。（2）持家基因gyrB提?。哼\(yùn)用試劑盒法提取總基因組DNA獲得模板；上游引物（5'-GA AGTCATCATGATGACCGTTCTGCA-3'）、 下 游 引 物（5'-AGCAGGGTACGGATG TGCGAGCC-3'）；PCR 擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)［13］。將擴(kuò)增完成的目的片段送往上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，序列結(jié)果在Ezbiocloud網(wǎng)站上（www.ezbiocloud.net/eztaxon）進(jìn)行比對(duì)，整理后的序列最后用Mega 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.6 19742-1和19742-2菌株基因組拼接與注釋 （1）基因組拼接：基因組DNA提取按照北京天根細(xì)菌基因組DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，純度和濃度符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)后，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行基因組框架圖測(cè)定。采用 FastQC（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制；使用AdapterRemoval（ver.2.1.7）［14］將低質(zhì)量的reads和污染的接頭去除；采用A5-miseq v2015052［14］軟件對(duì)去除接頭序列的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝，構(gòu)建contigs和scaffolds。（2）基因組預(yù)測(cè)與注釋 ：通過(guò) KEGG［15］（https：//www.kegg.jp/）、GO 注 釋?zhuān)?6］（http ：//www.geneontology.org/）以及使用在線(xiàn)軟件 tRNAscan-SE 1.21［17］和RNAmmer 1.2［18］對(duì)tRNA及rRNA操縱子等進(jìn)行預(yù)測(cè)和注釋。

1.2.7 ANI和DDH值分析 使用JSpeciesWS軟件［19］計(jì)算ANI值，網(wǎng)站（http：//ggdc.dsmz.de/ggdc.php）得到菌株的DDH值，并上傳菌株相應(yīng)的fasta或fna文件后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)比較分析

分別在R2A、BUG、TSA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上連續(xù)進(jìn)行3次劃線(xiàn)培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)19742-1和19742-2的菌落形態(tài)存在一定差別。如表1匯總所示。

圖1 19742-1（左）和 19742-2（右）菌落形態(tài)

表1 19742-1和19742-2菌落結(jié)構(gòu)特征

2.2 BIOLOG碳源利用和API 20NE試劑條分析

BIOLOG碳源利用：通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知19742-1能利用25種碳源，19742-2能利用20種碳源，其中有17種碳源被兩種菌共同利用。對(duì)于α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、1%乳酸鈉、D-山梨醇、D-甘露醇、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸等反應(yīng)兩者均呈陽(yáng)性；對(duì)于 D-松二糖、水蘇糖、α-D-乳糖、N-Acetyl-β-D甘露糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、肌苷、D-阿拉伯醇、D-阿拉伯醇等反應(yīng)兩者均呈陰性。不同的是，葡聚糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、β-Methyl-D葡萄糖苷、果膠和L-乳酸這8個(gè)反應(yīng)中，19742-1菌株呈陽(yáng)性，而19742-2則呈陰性；明膠、L-精氨酸和L-組氨酸這3個(gè)反應(yīng)中，19742-2菌株呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性，而19742-1呈陰性。以上結(jié)果說(shuō)明19742-1與19742-2利用碳源的能力相似，但存在一定的差別。

API 20NE試劑條：結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)吲哚產(chǎn)生、精氨酸雙水介酶、脲酶、半乳糖甙酶、癸酸、乙二酸、苯乙酸同化反應(yīng)19742-1和19742-2均為陰性，其余均為陽(yáng)性。僅葡萄糖酸鹽同化反應(yīng)19742-1顯示為陰性，而19742-2顯示為陽(yáng)性反應(yīng)。具體如表2所示。

表2 利用BIOLOG GEN III和API 20NE試劑條分析19742-1和19742-2差異

2.3 全細(xì)胞脂肪酸分析

脂肪酸測(cè)定結(jié)果如表3所示，菌株19742-1與19742-2均含有Bacillus屬中主要的脂肪酸成分，其主 要 脂 肪 酸 均 為 anteiso-C15：0，iso-C15：0，anteiso-C17：0和iso-C17：0，由此可以看出這兩株菌的脂肪酸主要組成相同，只是含量方面略微有差異。

表3 19742-1和19742-2的全脂肪酸分析

2.4 基于16S rRNA基因和持家基因gyrB系統(tǒng)發(fā)育分析

19742-1和19742-2的16S rRNA基因片段長(zhǎng)度分別為1 547 bp和1 547 bp，Genbank登錄號(hào)分別為MK779999和MK780002，將兩者測(cè)序得到的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，表明兩株菌間的16S rRNA基因序列相似性為100%，與B. velezensisCR-502T相似度最高，分別為99.86% 和99.79%。同時(shí)，19742-1和19742-2菌株的gyrB基因片段長(zhǎng)度分別是1 156 bp和1 163 bp，gyrB基因序列相似性為99.4%，登錄號(hào)分別為MK792247和MK792248。構(gòu)建基于16S rRNA和gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)果可以看出，19742-1和19742-2 均與B.velezensisCR-502T菌株親緣關(guān)系最近，因此進(jìn)一步說(shuō)明二者可能是同一株菌的不同形態(tài)型。

2.5 19742-1和19742-2基因組分析

19742-1的基因組全長(zhǎng)為3 883 546 bp，GC含量為46.41%，含有3 897個(gè)基因，可編碼3 897個(gè)蛋白，Genbank登錄號(hào)為SSNF00000000；19742-2基因組全長(zhǎng)為3 882 439 bp，GC含量46.59%，含有3 896個(gè)基因，可編碼3 896個(gè)蛋白，Genbank登錄號(hào)為SSNG00000000，二者基因組大小并無(wú)很大差別。另外，19742-1基因組中有2161個(gè)蛋白序列能與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)匹配并得到功能分類(lèi)；有2 741個(gè)基因得到GO分類(lèi)注釋?zhuān)换蚪M中預(yù)測(cè)到71個(gè)tRNA，5個(gè)rRNA。而19742-2的基因組中有2 162個(gè)蛋白序列能與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)匹配并得到功能分類(lèi)；有2 742個(gè)基因得到GO分類(lèi)注釋?zhuān)换蚪M中預(yù)測(cè)到66個(gè)tRNA，4個(gè)rRNA。此外，從基因組分析來(lái)看，19742-1菌株特有的基因是12個(gè)，而19742-2菌株特有的基因是10個(gè)。綜上可以看出，19742-1和19742-2菌株在基因組預(yù)測(cè)方面并無(wú)很大差別。

2.6 ANI和DDH值分析

19742-1和19742-2及其與相關(guān)模式菌種的ANI和DDH值見(jiàn)表4所示。根據(jù)計(jì)算結(jié)果可知，19742-1和19742-2菌株的ANI值為99.95%，DDH值為99.62%；兩株菌與B. amyloliquefaciensDSM 7T的ANI值分別為93.53% 和93.54%，DDH值分別為66.42% 和66.43%；與B. velezensisNRRL_B 41580T的ANI值分別為97.01% 和97.03%，DDH值分別為77.22% 和77.28%。一般來(lái)講，同種之間 ANI值≥ 95%，DDH 值≥ 70%［20］。19742-1和19742-2菌株與B. velezensisNRRL_B 41580T的ANI及DDH值均大于種分類(lèi)水平的臨界值，而與B.amyloliquefaciensDSM 7T的ANI及DDH值均小于種分類(lèi)水平的臨界值，因此ACCC 19742屬于貝萊斯芽孢桿菌而并非解淀粉芽孢桿菌。

圖2 鄰接法構(gòu)建19742-1和19742-2菌株16S rRNA和gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表4 19742-1和19742-2及與其相近種模式菌的ANI和DDH值（%）

3 討論

在細(xì)菌分類(lèi)學(xué)上，當(dāng)同種或同亞種內(nèi)不同菌株之間的性狀差異不足以分為新的亞種時(shí)，可以細(xì)分為不同的“型”，但他們不是正式的分類(lèi)等級(jí)［21］。從表型來(lái)看，兩株菌具有不同的形態(tài)，19742-2 菌落粘性相對(duì)較強(qiáng)，推測(cè)其可能含有更多的糖類(lèi)物質(zhì)，而19742-1菌株表面相對(duì)干燥，出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象可能是由于某個(gè)特異性基因突變或重組而引起在形態(tài)特征和生理類(lèi)型等方面的差異［22］。同時(shí)，已報(bào)道的貝萊斯芽孢桿菌菌落形態(tài)也存在著明顯差異。如王偉等［23］篩選到一株可拮抗大麗輪枝菌的B. velezensis12-51，其菌落形態(tài)呈白色，邊緣整齊且光滑，中間略微凸起，菌體生長(zhǎng)物可向四周呈云霧狀擴(kuò)散。而連彩等［24］分離的抗蘭花枯萎病貝萊斯芽孢桿菌單菌落形態(tài)呈圓形，表面褶皺，菌落中央凹陷呈火山口狀?？梢?jiàn)，不同的B. velezensis菌株形態(tài)不盡相同。

根據(jù)API 20NE、BIOLOG以及脂肪酸分析等生理生化分析結(jié)果，19742-1和19742-2十分相似，結(jié)合16S rRNA基因、gyrB以及基因組分析，可以確定二者是同一株菌不同的形態(tài)型；從目前的結(jié)果也可以看出，這兩株菌在功能方面并沒(méi)有很大的分化，只是形態(tài)結(jié)構(gòu)有所差異。進(jìn)一步確定了該菌株屬于貝萊斯芽孢桿菌而并非解淀粉芽孢桿菌?；蚪M分析來(lái)看，19742-1與19742-2分別具有12個(gè)和10個(gè)特有基因，可能是由于進(jìn)化過(guò)程中的基因突變和自然選擇適應(yīng)［25］造成的，具體原因還有待我們后續(xù)深入進(jìn)行探究。

菌落形態(tài)特征是判斷菌種是否污染的最直接、最快速且一直以來(lái)認(rèn)為是無(wú)爭(zhēng)議的一種方法，本研究的結(jié)果旨在闡明在微生物檢測(cè)、生產(chǎn)及菌種資源的保藏過(guò)程中，應(yīng)結(jié)合不同的方法判斷菌種的純度。解淀粉芽孢桿菌及貝萊斯芽孢桿菌均為微生物飼料和微生物肥料重要的生產(chǎn)菌株，本研究修正了ACCC 19742的分類(lèi)地位，從不同角度證明了同一株菌存在不同的菌落和菌體形態(tài)。本研究為微生物肥料以及飼料等相關(guān)微生物產(chǎn)品的檢測(cè)，尤其對(duì)于菌種保藏中心保藏及共享工作提供了重要參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本文通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化、基因組等多方面綜合分析，證實(shí)19742-1和19742-2為來(lái)源于同一菌株的不同形態(tài)，而并非污染造成；同時(shí)根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)、ANI和DDH值分析得知，該菌株ACCC 19742 的分類(lèi)地位屬于貝萊斯芽孢桿菌而并非解淀粉芽孢桿菌，研究結(jié)果對(duì)菌種保藏工作具有一定指導(dǎo)意義。