吳芹 許子洋 劉麗萍 張文英 宋思遠

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，鹽城 224005）

高血壓是最常見的慢性病之一，也是心、腦、腎疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點。據(jù)《中國心血管病報告2018》概要報道，我國現(xiàn)有2.45億高血壓患者［1］。當今社會節(jié)奏快，競爭壓力大，長期過度的腦力工作負荷、持續(xù)緊張、長期情緒或精神刺激、煩惱、焦慮等心理應(yīng)激，使高血壓及其并發(fā)癥心、腦、腎等疾病的發(fā)病率持續(xù)上升，嚴重威脅人群健康，并且造成巨大的社會和家庭負擔。這些與現(xiàn)代生活方式相關(guān)的慢性應(yīng)激，正在成為新的心血管疾病的風(fēng)險因素［2］。如果這些應(yīng)激因素持續(xù)存在，可能引起長期的高血壓，通常稱為應(yīng)激性高血壓（Stressinduced hypertension，SIH）［3-4］。近來的研究顯示，高血壓的發(fā)生與腸道菌群的變化相關(guān)［5-6］，菌群對宿主血壓有直接影響［7］。無菌鼠的血壓相對降低［8］。用16S rRNA檢測高血壓大鼠和高血壓患者糞便的結(jié)果顯示，腸道菌群豐度和多樣性顯著下降，厚壁菌門（Firmicutes，F(xiàn)）/擬桿菌門（Bacteroidetes，B）的比率增加，標志腸道菌群紊亂［9］。但慢性應(yīng)激引起的應(yīng)激性高血壓是否與腸道菌群的變化相關(guān)尚不清楚。本研究觀察應(yīng)激情況下，腸道菌群的變化以及通過四聯(lián)抗生素制備偽無菌鼠，研究腸道菌群的變化與應(yīng)激性高血壓發(fā)生的相關(guān)性，為預(yù)防應(yīng)激性高血壓提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24只200-250 g雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司［動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）-2018-0004］。大鼠進行隨機編號并稱重，分籠飼養(yǎng)。控制飼料、飲水、室溫等條件均相同。保持12 h光照/12 h黑暗日周期，自由采食和飲水。所有動物實驗均經(jīng)過江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院動物實驗倫理委員會同意，并嚴格遵守實驗動物護理和使用指南開展相關(guān)實驗。

1.1.2 儀器和試劑 應(yīng)激性高血壓造模系統(tǒng)（上海繼德教學(xué)實驗器械廠），Illumina公司的Miseq PE300測序平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司）；氨芐西林、萬古霉素、新霉素、甲硝唑購自上海源葉生物科技有限公司，去甲腎上腺素（NE）的ELISA試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)激性高血壓大鼠模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，使用計算機控制的足底電擊結(jié)合噪聲的刺激方法，制備應(yīng)激性高血壓大鼠模型。電擊和噪聲的間隔時間與組合均隨機。電擊籠的尺寸為22×22×26 cm3，底部鋪有銅柵，銅柵上可以通間斷性交流電。模型制備時，電擊電壓為35-80 V，同時隨機由蜂鳴器發(fā)出強度為90-100 db的噪聲，每次持續(xù)50 ms。應(yīng)激性高血壓大鼠（stress組）每天上、下午各接受1次（每日2次）應(yīng)激刺激，每次2 h，中間間隔4 h，共14 d。對照組大鼠（sham組）飼養(yǎng)條件同stress組，并且每天2次，每次2 h放入同樣的電擊籠，但不給予任何應(yīng)激刺激。造模結(jié)束，于上午8：00前留取糞便標本，然后使用PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)測量股動脈血壓后留取血液等標本備用。

1.2.2 偽無菌鼠模型制備 根據(jù)文獻［10］，使用四聯(lián)廣譜抗生素（Antibiotics，AB）制備偽無菌鼠。12只大鼠分為抗生素組（sham_AB）和應(yīng)激抗生素組（stress_AB），每組6只。在飲用水中加入1g/L氨芐西林、500 mg/L萬古霉素、1 g/L新霉素、1 g/L甲硝唑四種抗生素（所有抗生素均購自于Sigma公司），飲用水4 d更換一次。2周后，stress_AB組大鼠和stress組大鼠一起接受應(yīng)激；4周之后，收集大鼠糞便用于后續(xù)的測序分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗方法（ELISA） 檢測血漿去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）根據(jù)ELISA試劑盒說明書，按梯度稀釋標準品8個濃度，用于制作標準曲線。分別設(shè)空白對照孔、標準孔和待測樣品孔?？瞻讓φ湛撞患訕悠芳懊笜嗽噭溆喔鞑襟E操作相同；標準孔加不同濃度的標準品各100 μL；待測樣品孔加血清100 μL?；靹?，封板，37℃，溫育30 min。洗滌5次，拍干。所有標準孔和待測樣品孔各加酶標試劑50 μL。37℃，溫育30 min，洗滌5次，拍干。空白對照孔、標準孔和待測樣品孔按序依次加入顯色劑A 和B各50 μL，混勻，37℃，避光顯色15 min，加終止液50 μL用于終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。加終止液后15 min內(nèi)，使用酶標儀測定各孔OD值。酶標儀設(shè)定在450 nm波長。根據(jù)標準品濃度和OD 值計算標準曲線的直線回歸方程式。根據(jù)樣品的OD 值計算樣品濃度。

1.2.4 腸道菌群測序及分析 每天上午8：00在超凈臺中采集大鼠的新鮮糞便于無菌凍存管中，所有樣品立即于-80℃保存?zhèn)溆?。所有樣品干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rRNA的測序。引物名稱：338F_806R；F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；R端序列：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；長度：468；測序方式：PE300。采用 Illumina MiSeq 測序技術(shù)，測定大鼠糞便中微生物 16S rRNA V3-V4 區(qū)序列，并對群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行了比較分析。使用I-Sanger云平臺比較分析樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)、組成和差異［11］。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差（x-±s）表示，n表示大鼠的例數(shù)。兩組間單因素分析采用Student’s t-test檢驗；血壓和心率等數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析，進行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)激性高血壓大鼠行為、體重、血壓、心率及NE的變化

應(yīng)激性高血壓組（stress組）大鼠每天接受2次應(yīng)激刺激，每次2 h，中間間隔4 h，持續(xù)14 d。與對照組（sham組）大鼠相比，stress組大鼠從第2天開始就發(fā)生明顯的行為方面的改變。表現(xiàn)為高度警覺，躁動不安。在電擊籠中，呼吸加深加快、體毛豎立，出現(xiàn)緊張恐懼和逃避行為，常表現(xiàn)為呈直立狀攀附在電擊籠側(cè)壁。而sham組大鼠行為正常，表現(xiàn)為悠閑狀態(tài)。無論是sham組還是stress組大鼠的體重均呈增長趨勢，但是stress組大鼠的體重增長緩慢。應(yīng)激造模14 d，與sham組大鼠相比，stress組大鼠體重增長明顯低于sham組大鼠（圖1-C）。造模結(jié)束次日，使用PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)測量sham組和stress組大鼠股動脈血壓和心率。與sham組相比，stress組大鼠的血壓升高、心率增快（圖1-A-B）。大鼠處死前留取靜脈血5 mL，分離血清后-80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂肊LISA方法檢測大鼠血清NE含量，用于評價大鼠外周交感神經(jīng)興奮狀態(tài)。與sham組相比，stress組大鼠血清NE含量顯著增高（圖1-D）。

圖1 應(yīng)激性高血壓大鼠血壓、心率、體重增長及血清去甲腎上腺素的變化

2.2 慢性應(yīng)激降低大鼠腸道菌群α多樣性

α多樣性反映群落中所含物種的種類數(shù)目和群落中各物種的相對密度是否均勻。分別取sham組和stress組大鼠糞便，進行群落多樣性測序及交互式分析。α多樣性分析顯示，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群OTU數(shù)目少于對照組（圖2-A）；chao和ace 指數(shù)均小于對照組，表明群落豐富度低于對照組（圖2-B-C）；Shannon指數(shù)低于對照組，而Simpson指數(shù)高于對照組，說明群落多樣性高于對照組（圖2-DE）；converge顯示對照組和應(yīng)激組的物種覆蓋度沒有差異（圖2-F）。結(jié)果顯示，引起高血壓的慢性應(yīng)激顯著降低了腸道菌群的豐富度。

2.3 慢性應(yīng)激改變大鼠腸道菌群OUT水平物種組成和β多樣性

通過Venn 圖分析應(yīng)激性高血壓大鼠與對照大鼠腸道菌群的物種組成，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群OTU數(shù)目為560種，低于stress組大鼠的613種，兩組共有的OTU數(shù)目為521種（圖3-A）。為了進一步評估兩組樣本間OTU組成的相似性和差異性，進行β多樣性分析，基于bray_curtis距離PCoA分析，應(yīng)激性高血壓大鼠各樣本在平面圖的分布區(qū)域與對照組明顯不同，相互距離較遠，分界清楚（圖3-B），顯示了慢性應(yīng)激降低了大鼠腸道菌群物種數(shù)目，并改變了物種組成。

圖2 慢性應(yīng)激對大鼠腸道菌群α多樣性的影響。

2.4 慢性應(yīng)激改變腸道菌群門水平的物種組成

慢性應(yīng)激14 d大鼠腸道菌群的組成發(fā)生顯著改變。用Circos圖反映各組Phylum（門）分類學(xué)水平下物種的分布比例情況，對照組和應(yīng)激組樣本中物種比較豐富，以厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主（圖4-A）。

抗生素制備的偽無菌鼠腸道菌群的豐度和多樣性顯著下降。Sham_AB和stress_AB組物種單一，基本均為變形菌門（Proteobacteria）（圖4-B）。用Kruskal-Wallis秩和檢驗（Kruskal-Wallis H test）對4組樣本在Phylum（門）水平下進行顯著性差異分析，與Circos圖結(jié)果一致，對照組和應(yīng)激組大鼠的優(yōu)勢菌是厚壁菌門和擬桿菌門，而sham_AB和stress_AB組的優(yōu)勢菌是Proteobacteria（圖4-C）。用PCA圖比較sham_AB和stress_AB組腸道菌群的β多樣性的結(jié)果顯示，sham_AB和stress_AB組樣本點非常接近，表明兩組物種組成在門水平相似（圖4-D），即飲用抗生素水的大鼠，腸道除了少量的變形菌門外，沒有其他菌群物種存在，提示慢性應(yīng)激不能明顯改變偽無菌大鼠的腸道菌群在門水平的組成。

圖3 慢性應(yīng)激對大鼠腸道菌群組成和多樣性的影響

2.5 慢性應(yīng)激不改變偽無菌鼠BP、HR、體重及血清NE濃度

SD大鼠接受14 d的慢性足底電擊結(jié)合噪聲應(yīng)激后，血壓升高、心率加快、體重增長緩慢及血清去甲腎上腺素濃度增加。飲用含四聯(lián)抗生素飲用水的偽無菌鼠，其血壓、心率、體重增長及血清去甲腎上腺素濃度與正常飲水組大鼠相比，無顯著變化。飲用四聯(lián)抗生素水的偽無菌鼠接受相同應(yīng)激刺激后，未出現(xiàn)正常大鼠應(yīng)激后血壓升高、心率加快、體重增長緩慢及血清去甲腎上腺素濃度增加的變化（圖5），顯示應(yīng)激引起的這些變化對腸道菌群的依賴性。

3 討論

本研究采用足底電擊結(jié)合噪聲刺激方法建立應(yīng)激性高血壓動物模型。這一方法是國際上普遍認可的大鼠應(yīng)激性高血壓造模方法［12-13］。本研究結(jié)果顯示，這種應(yīng)激方法，使大鼠血壓升高、心率增快，體重增長緩慢，血清NE濃度增加，表明高血壓模型成功。大鼠糞便標本應(yīng)用16S rRNA測序分析顯示，腸道菌群豐富度、多樣性下降，物種組成數(shù)目下降。大鼠飲用含四聯(lián)廣譜抗生素水一個月后，腸道菌群基本殺滅，成為偽無菌鼠。給予偽無菌鼠相同的足底電擊結(jié)合噪聲的慢性應(yīng)激，不再引起大鼠的血壓升高、心率增快和血清NE濃度增加。這些結(jié)果提示，應(yīng)激性高血壓的發(fā)生與腸道菌群的紊亂密切相關(guān)。

應(yīng)激可通過激活交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸引起血壓升高等應(yīng)激反應(yīng)［14-15］。本文通過足底電擊結(jié)合噪聲的方法建立的應(yīng)激性高血壓大鼠模型一般在電擊第5天開始，血壓和心率就明顯升高，第10天達到峰值，持續(xù)應(yīng)激到14 d，期間的血壓和心率維持在最高水平。應(yīng)激性高血壓大鼠除了血壓和心率的變化，在行為上還表現(xiàn)為躁動不安、警覺性增高、且易于激惹；在飲食上發(fā)現(xiàn)飲水增多，但食用飼料量減少，有厭食現(xiàn)象，因此體重增長緩慢［16］。這些現(xiàn)象都顯示，應(yīng)激引起了交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的激活。就血壓而言，交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的激活最終通過增加外周交感神經(jīng)的活動引起血壓升高。外周血中的NE濃度可反映交感活動的狀態(tài)。我們使用ELISA方法檢測大鼠血清NE濃度，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激性高血壓大鼠血清NE濃度明顯增加，說明交感神經(jīng)興奮性增強，是應(yīng)激引起血壓升高的機制。

圖4 抗生素對腸道菌群豐度和多樣性的作用

研究表明，應(yīng)激改變腸道菌群［17］。菌群介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)得到了用益生菌和/或抗生素處理的無菌小鼠等嚙齒類動物實驗及臨床試驗的支持。無菌成年小鼠可放大應(yīng)激誘導(dǎo)的腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮的釋放，無菌小鼠的這種應(yīng)激反應(yīng)可以通過移植對照動物的糞便部分逆轉(zhuǎn)［18］。益生菌降低大鼠急性應(yīng)激時的腸道通透性和下丘腦-垂體-腎上腺軸反應(yīng)［19］；給予成年人補充益生菌植物乳桿菌P8可緩解壓力和焦慮，提高社會情緒認知、口頭學(xué)習(xí)和記憶能力，降低血漿皮質(zhì)醇水平和促炎細胞因子IFN-γ、TNF-α等水平［20］。本實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群的OTU數(shù)目下降，α多樣性分析顯示應(yīng)激引起菌群的豐富度下降；通過β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群多樣性下降，且引起了菌群物種組成與正常組明顯差異。這些改變提示，應(yīng)激引起了腸道菌群紊亂。高血壓的發(fā)生與腸道菌群的變化相關(guān)［7］的研究提示，應(yīng)激引起的腸道菌群紊亂可能是應(yīng)激性高血壓的原因。為了進一步探討應(yīng)激引起的腸道菌群變化與應(yīng)激性高血壓的發(fā)生存在因果關(guān)系，我們將四聯(lián)廣譜抗生素加在大鼠飲用水中4周，制備偽無菌鼠。使用抗生素清除腸道菌群是觀察菌群在疾病發(fā)生機制中的一種方法，比直接使用無菌鼠更便于實驗的開展。本研究使用抗生素的時間較長，一是應(yīng)激性高血壓造模周期需2周時間，二是盡可能清除腸道菌群。本文對使用四聯(lián)抗生素4周大鼠糞便的進行16S rRNA測序分析顯示，僅存少量的變形菌門，基本達到無菌的目的。本實驗結(jié)果顯示，引起正常大鼠產(chǎn)生高血壓的慢性應(yīng)激方法不再引起偽無菌大鼠的交感神經(jīng)活動增強、血壓升高，這一結(jié)果表明，腸道菌群參與了應(yīng)激性高血壓的發(fā)生。雖然許多研究都顯示，腸道菌群紊亂與人和動物高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，但腸道菌群紊亂引起高血壓的機制還不清楚［21］。最近的文獻表明，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）參與高血壓的調(diào)節(jié)，腸道菌群紊亂引起SCFAs減少可能成為血壓升高的因素［5，22］。在血管緊張素 II誘發(fā)的高血壓小鼠模型中，補充丁酸鹽可顯著降低血壓，而高血壓患者循環(huán)丁酸鹽降低［23］。SCFAs可通過通過分布在腎臟或血管內(nèi)膜上的受體對血壓進行調(diào)節(jié)［24］。臨床研究顯示通過高纖維食物補充SCFAs具有抗高血壓的作用［25］。腸道菌群紊亂可能導(dǎo)致交感神經(jīng)活性增加而成為高血壓的機制［26］。我們過去的工作表明，下丘腦室旁核小膠質(zhì)細胞激活引起的神經(jīng)炎癥是應(yīng)激性高血壓發(fā)生的重要機制［13］，下丘腦室旁核促炎型小膠質(zhì)細胞增多，炎癥因子表達增加丁酸具有抑制促炎型小膠質(zhì)細胞的作用，在應(yīng)激情況下，是否由于腸道丁酸的減少，影響室旁核神經(jīng)炎癥的機制引起血壓的改變等，都有待進一步探討。

圖5 慢性應(yīng)激對偽無菌大鼠血壓、心率、體重增加及血清去甲腎上腺素濃度的變化

4 結(jié)論

應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群豐富度和多樣性下降，菌群物種組成變少，差異性變大?？股靥幚硇纬傻膫螣o菌鼠，腸道菌群物種單一，僅有少量的變形菌門。給予偽無菌鼠慢性應(yīng)激，不再引起大鼠血壓升高，心率增快，血清去甲腎上腺素濃度未升高。這提示了應(yīng)激性高血壓的發(fā)生對腸道菌群的依賴性。