邵 靚 張 萍 蔡新勇 肖 斌 梅松被

1.江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330000；2.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西南昌 330000

糖尿病是臨床的常見病和多發(fā)病，具有較高的發(fā)病率，好發(fā)于中老年群體中，占到了總數(shù)的90%以上[1]。近年來，受到人口老齡化加劇的影響，糖尿病的發(fā)病率明顯上升，臨床防治形勢不容樂觀。糖尿病的病程長、進展慢，但若未及時得到有效治療，會引發(fā)相應的并發(fā)癥。在糖尿病早期，糖尿病主要引起微血管病變，是指由于毛細血管基底膜增厚導致的毛細血管以及毛細血管前小動脈病變心肌微血管病變和心肌代謝紊亂引起心肌廣泛缺血、灶性壞死纖維化，這是糖尿病慢性心肌缺血損傷的病理生理特點[2]。同時，糖尿病可以加速動脈粥樣硬化的發(fā)展，激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），破壞冠脈斑塊穩(wěn)定性，導致冠脈急性閉塞，這是糖尿病急性心肌缺血損傷的病理生理特點[3-4]。本研究中為了進一步了解Toll 樣受體3（TLR3）基因突變rs3775291 點突變在糖尿病急慢性心肌缺血中的損傷作用及其機制，選取由南昌大學實驗動物中心提供80只基因敲除SD 大鼠作為研究對象展開分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1?4月由南昌大學實驗動物中心提供80只基因敲除SD 大鼠作為研究對象。本研究已經(jīng)通過南昌大學醫(yī)學院動物倫理委員會審查。SD 大鼠均體重為250?300 g，2?3月齡，置于清潔級（SPF）動物實驗室飼養(yǎng)，每籠5只，自由進食、飲水，室內(nèi)溫度20?25℃，相對濕度40%?70%，在光/暗周期為12 h/12 h的條件下飼養(yǎng)。

1.2 方法

制作大鼠缺血/再灌注模型，實驗前禁食12 h，3.5 ml/kg的10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，生產(chǎn)批號H37022673）麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定，氣管插管，接人工呼吸機（呼吸頻率：70 次/min，潮氣量：20 ml）。開胸結(jié)扎冠脈左前降支，胸骨左側(cè)2 mm切開皮膚，鈍性分離肌肉見肋骨，在三四肋間，用拉鉤拉開胸壁，小心剪開心包膜，在左心耳下緣3?4 mm進針，進針深約1.5 mm，斜向右上方肺動脈圓錐方向進針，針距3?4 mm。穩(wěn)定1 min 后，收緊結(jié)扎線，30 min后輕拉松結(jié)線，擴開血管再灌注，縫合。

采用隨機數(shù)字表法，將80只缺血/再灌注模型SD 大鼠分為野生型組（40只）和突變型組（40只）。野生型組大鼠僅絲線穿過冠狀動脈，但左室支不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水。突變型組大鼠選取TLR3基因敲除大鼠制作模型。

1.3 觀察指標及評價標準

比較兩組大鼠的TLR3和核因子κB（NF-κB）蛋白表達、血清趨化因子（IP-10）、白細胞介素-8（IL-8）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性指標水平。

（1）Western blot 法檢測TLR3、NF-κB蛋白表達，制模結(jié)束后處死手術(shù)處理后的存活大鼠，按試劑盒說明書步驟提取總蛋白，碾磨心肌組織，BCA 蛋白定量法進行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣品后轉(zhuǎn)膜，常溫下洗膜緩沖液（TBST）封閉過夜，加入一抗后室溫下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗2 h，顯影，定影，掃描。

（2）測定兩組各項炎癥指標，包括IP-10、IL-8 與TNF-α。清晨空腹狀態(tài)下，抽取3 ml 大鼠靜脈血，離心處理，取上層清液送檢，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TLR3、NF-κB蛋白表達水平的比較

突變型組的TLR3、NF-κB蛋白表達均高于野生型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 兩組TLR3、NF-κB蛋白表達水平的比較（±s）

表1 兩組TLR3、NF-κB蛋白表達水平的比較（±s）

組別 TLR3 NF-κB野生型組（n=40）突變型組（n=40）t值P值0.308±0.123 0.856±0.254 12.280 0.000 0.216±0.104 0.748±0.241 12.819 0.000

2.2 兩組IP-10、IL-8 與TNF-α 水平的比較

兩組的IP-10、IL-8、TNF-α 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

表2 兩組IP-10、IL-8 與TNF-α 水平的比較（±s）

表2 兩組IP-10、IL-8 與TNF-α 水平的比較（±s）

組別 IP-10（pg/ml）IL-8（ng/L）TNF-α（ng/L）野生型組（n=40）突變型組（n=40）t值P值201.58±32.31 206.81±33.09 0.715 0.477 11.35±4.39 12.08±4.17 0.763 0.448 6.08±2.37 6.12±2.40 0.075 0.940

3 討論

糖尿病心臟病是糖尿病患者致死的主要原因之一，糖尿病心臟病患者與非糖尿病患者比較，常常起病更早，病情隱匿不宜發(fā)現(xiàn)[5]。糖尿病患者伴心肌損傷，常表現(xiàn)為無痛性心肌梗死，梗死面積大，穿壁梗死多，病情嚴重，預后差，病死率高[6]。TLR3 在糖尿病及冠心病中均起到了重要作用，然而TLR3 基因rs3775291位點的突變在糖尿病心肌的損傷作用和具體機制尚未闡明[7]。不少研究表明，動脈粥樣斑塊的形成和斑塊的不穩(wěn)定，以及胰島細胞的凋亡均與Toll 樣受體（TLR）有關(guān)[8]。TLR是一類重要的天然自身免疫因子，迄今已在哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)十余種TLR，稱為TLR 受體家族[9]。

TLR 蛋白作為單個的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，具有保守的分子結(jié)構(gòu)。當微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時，TLR 可以識別它們，并激活機體產(chǎn)生免疫細胞應答[10]。大部分TLRs是通過髓樣分化因子（MyD88）信號途徑激活不同的細胞因子和化學激活因子，從而在病變的演變中發(fā)揮作用[11]。TLR3 與TLRs 家族中的其他成員有所不同，TLR3 主要通過TRIF 信號途徑（MyD88 非依賴的信號傳導途徑）起到作用[12]。在TLR3的研究中顯示，野生型TLR3 基因可以減少三酰甘油的合成，加快體內(nèi)脂質(zhì)的清除，提升血清高密度脂蛋白（HDL）水平，維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)，對動脈血管內(nèi)皮起到一定的保護作用；而TLR 基因突變可導致胰島β 細胞分泌減少，糖和脂質(zhì)代謝紊亂，內(nèi)皮功能失調(diào)，引起細胞凋亡[13]。

人TLR3 基因定位于4q35，由17 570個核苷酸組成，編碼由904個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其獨特的結(jié)構(gòu)是其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中不含有其他TLR 中保守的脯氨酸，而是由丙氨酸替代，這種替代在人和小鼠中是保守的[14]。在TLR3 基因中，rs3775291位于第4 外顯子上，rs3775291 發(fā)生突變時，等位基因G/C 突變?yōu)锳/T，所編碼的亮氨酸（Leu）被錯譯為苯丙氨酸（Phe）[15]。本研究結(jié)果提示，突變型組的TLR3、NF-κB蛋白表達均高于野生型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），兩組的IP-10、IL-8、TNF-α 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示TLR3 基因rs3775291位點突變，會造成糖尿病急慢性心肌缺血損傷，通過TLR3、NF-κB蛋白表達和炎癥反應表達的作用機制，促使病情進展。

綜上所述，TLR3 基因rs3775291位點突變是糖尿病急慢性心肌缺血損傷的作用機制，會加重患者病情，需加強防治。