栗召輝 梁武毅 黃永欣 朱云楓 明宏艷 梁少軍 何洪濤 張建明 廣州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東，廣州，510623）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是一個(gè)重要的全球公共衛(wèi)生問題，全球約有20 億人感染結(jié)核分枝桿菌，而兒童結(jié)核分枝桿菌感染率達(dá)到9%［1］。盡管世界各國(guó)對(duì)結(jié)核病采取了有效措施，但兒童結(jié)核病多無(wú)典型臨床癥狀， 臨床表現(xiàn)與普通感染性疾病不易區(qū)別，導(dǎo)致診斷困難，這也為全球到2035 年消除結(jié)核病的戰(zhàn)略目標(biāo)提出了挑戰(zhàn)［2］。 結(jié)核菌素皮試（tuberculin skin test，TST） 是長(zhǎng)期以來(lái)用以快速診斷結(jié)核感染的唯一手段。 然而TST 存在諸多缺陷：在易受結(jié)核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低；在普遍接種卡介苗（BCG）的地區(qū)造成非常高的“假陽(yáng)性”率［3-4］。 此外，皮試的操作和結(jié)果的解釋存在主觀依賴性，降低了檢查的準(zhǔn)確性。T-SPOT.TB則是以特異性抗原為刺激源，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）診斷結(jié)核感染的新方法。 使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC），通過細(xì)胞因子γ 干擾素（IFNγ）的分泌檢測(cè)抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)情況，進(jìn)而對(duì)患者的結(jié)核感染狀態(tài)進(jìn)行判斷。 本研究通過對(duì)TST 和T-SPOT.TB 進(jìn)行比較分析， 旨在探討赴美移民體檢結(jié)核病感染篩查中兩種方法的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

按照美國(guó)CDC 有關(guān)移民人群結(jié)核病篩查的技術(shù)指導(dǎo)， 對(duì)2012 年1 月-2013 年10 月來(lái)我中心體檢的2～14 歲移民申請(qǐng)人進(jìn)行結(jié)核篩查。 其中2012年1-12 月共5 388 例申請(qǐng)人采用結(jié)構(gòu)菌素試驗(yàn)（PPD） 試驗(yàn)；2018 年1-12 月共3 486 例采用TSPOT.TB 試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 PPD 組：在申請(qǐng)人左上肢前臂掌側(cè)皮下注射0.1ml PPD 試劑（成都生物制品研究所），于48～72h內(nèi)測(cè)量注射處硬結(jié)直徑。 所有結(jié)果均由同一組檢測(cè)人員判讀。

1.2.2 T-SPOT.TB 組：肝素抗凝管采取5mL 外周靜脈血；分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）；收集外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）并計(jì)數(shù)，配制每100μL 含有25萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL；采用IGRA 試劑盒（上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司）進(jìn)行IGRA 檢測(cè)；每個(gè)測(cè)定樣本需4 個(gè)檢測(cè)孔（空白對(duì)照、測(cè)試孔A 和測(cè)試孔B、陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照）；加入50μL 細(xì)胞培養(yǎng)液至每個(gè)空白對(duì)照孔內(nèi)； 加入50μL 抗原A 溶液至每個(gè)必要的檢測(cè)孔內(nèi)； 加入50μL 抗原B 溶液至每個(gè)必要的檢測(cè)孔內(nèi)； 加入50μL 陽(yáng)性質(zhì)控至每個(gè)細(xì)胞功能控制孔內(nèi)。 每個(gè)樣本使用4 個(gè)檢測(cè)孔，每個(gè)檢測(cè)孔加入100μL 細(xì)胞終溶液 （含有25 萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞）；然后在37℃，保持濕潤(rùn)的含有5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育16～20h。 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液；每個(gè)反應(yīng)孔加入200μL PBS 緩沖液；棄去PBS 緩沖液； 用新鮮的PBS 緩沖液重復(fù)洗滌至少3遍； 用PBS 緩沖液200 倍稀釋濃縮標(biāo)記抗體試劑。每個(gè)反應(yīng)孔加入50μL 標(biāo)記抗體工作液，2～8℃孵育1h；棄去標(biāo)記抗體工作液，按上述的步驟洗滌。 每個(gè)反應(yīng)孔加入50μL 底物顯色溶液，室溫孵育7min。用蒸餾水徹底洗滌培養(yǎng)板終止反應(yīng)； 把培養(yǎng)板放在37℃溫箱干燥4h； 記數(shù)每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)深藍(lán)色清晰的斑點(diǎn)。

1.2.3 PPD 或T-SPOT.TB 陽(yáng)性的申請(qǐng)人需進(jìn)一步拍攝胸部后前位數(shù)字X 線片，設(shè)備為日本島津公司生產(chǎn)的數(shù)字化X 線攝影系統(tǒng)。

1.3 結(jié)果判定

PPD 組：皮下硬結(jié)橫徑＜10mm 為陰性；皮下硬結(jié)橫徑≥10mm 為陽(yáng)性。

T-SPOT.TB 組：①當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≤5 時(shí)，抗原A 孔和/或抗原B 孔斑點(diǎn)數(shù)－陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6 為陽(yáng)性； 抗原A 孔和抗原B 孔斑點(diǎn)數(shù)－陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＜6 為陰性。②當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6 時(shí)，抗原A 孔和/或抗原B 孔斑點(diǎn)數(shù)≥2×陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為陽(yáng)性； 抗原A 孔和抗原B 孔斑點(diǎn)數(shù)＜2×陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用卡方檢驗(yàn)（Chi-Square test）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組試驗(yàn)結(jié)果比較

5 388 例采用PPD 試驗(yàn)的2～14 歲移民申請(qǐng)人，陽(yáng)性530 例， 陽(yáng)性率為9.84%；3 486 例采用TSPOT.TB 試驗(yàn)的2～14 歲移民申請(qǐng)人，陽(yáng)性61 例，陽(yáng)性率為1.75%， 兩種方法陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝222.666，P＜0.01）。

2.2 X 線結(jié)果比較

PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性的移民申請(qǐng)人中X 光異常者6例，X 光異常發(fā)現(xiàn)率為1.13%（6/530）；T-SPOT.TB試驗(yàn)陽(yáng)性的移民申請(qǐng)人中X 光異常者11 例，X 光異常發(fā)現(xiàn)率為18.03%（11/61）， 兩種方法X 光異常發(fā)現(xiàn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2＝55.930，P＜0.01）（見表1）。

表1 T-SPOT.TB 試驗(yàn)和PPD 試驗(yàn)的檢出率（例）

3 討論

我國(guó)是全球22 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10 萬(wàn)［5］，其中兒童結(jié)核病約占全部結(jié)核病的10%［6-7］。 2000 年我國(guó)兒童活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為91.8/10 萬(wàn)， 其中痰細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性的兒童肺結(jié)核患病率為12.3/10 萬(wàn)［8］。 而2016 年我國(guó)0～14 歲兒童的結(jié)核病患者達(dá)到10 萬(wàn)人左右［9］。 美國(guó)CDC 制定的赴美移民體檢指導(dǎo)指出，赴美移民2～14 歲的申請(qǐng)人必需進(jìn)行（tuberculin skin test，TST） 或γ 干擾素釋放分析結(jié)核菌素皮試實(shí)驗(yàn)（interferon-γ release assay，IGRA）試驗(yàn)來(lái)篩查肺結(jié)核。 TST 作為長(zhǎng)期以來(lái)快速診斷結(jié)核感染的唯一手段，受卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）影響較大，在普遍接種BCG 的地區(qū)造成非常高的“假陽(yáng)性”率，降低了檢查的準(zhǔn)確性。自從Lalvani 等［10］首先將ELISPOT（T-SPOT.TB 即為ELISPOT 診斷方法的商品化）用于活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷以來(lái)，T-SPOT.TB 的應(yīng)用迅速發(fā)展。 T-SPOT.TB 繼2004 年、2005年在歐洲和加拿大被批準(zhǔn)使用后， 美國(guó)FDA 也在2008 年完成審批。 T-SPOT.TB 是目前IGRA 診斷結(jié)核感染的最主要方法之一。 T-SPOT.TB 以T 細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的γ-干擾素（γ-IFN）釋放實(shí)驗(yàn)，其原理是結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞（PBMC）中存在的特異性T 細(xì)胞在受到被RDl 編碼抗原活化后分泌γ 干擾素，后者被微孔板上γ 干擾素抗體結(jié)合，通過顯色形成色素沉淀斑點(diǎn)，從而診斷結(jié)核感染。

Cruz 等［11］在 對(duì)210 名 兒 童 的 前 瞻 性 研 究 中 發(fā)現(xiàn)，診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核兒童的T-SPOT.TB 的敏感病為92%，高于TST 的77%。 Lalvani［12］綜合5 項(xiàng)研究總計(jì)1 136 例密切接觸者后認(rèn)為。 T-SPOT.TB 與BCG 接種無(wú)明顯相關(guān)，提示了更高的特異度，且TSPOT.TB 與結(jié)核分枝桿菌暴露程度的相關(guān)性優(yōu)于TST，顯示了良好的靈敏度。Detjen 等［13］通過73 名結(jié)核患兒觀察TST 和INF-γ 釋放試驗(yàn)在兒童結(jié)核病中的診斷價(jià)值， 發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB 的特異度為98%，高于TST 的58%，而兩者的敏感度均為100%。國(guó)內(nèi)張衛(wèi)平等［14］對(duì)0～14 歲75 例疑似肺結(jié)核患兒用兩種方法對(duì)比分析顯示，T-SPOT.TB 靈敏度為80.6%，特異度為89.5%， 假陰性率為19.4%， 假陽(yáng)性率為10.5%。 在結(jié)核病組中，T-SPOT.TB 陽(yáng)性率顯著高于TST 試驗(yàn)（80.6% vs 48.4%）。 李明武等［15］對(duì)62 名例患兒進(jìn)行對(duì)比分析研究顯示，T-SPOT.TB 試驗(yàn)診斷兒童結(jié)核病的敏感度為90.6%，特異度為96.8%，而且受其它干擾因素的影響較小， 可用于兒童結(jié)核病的早期快速診斷。 孫琳等［16］通過對(duì)1990-2011 年TSPOT.TB 在兒童結(jié)核病和潛伏結(jié)核感染診斷篩查中的應(yīng)用研究進(jìn)行Meta 分析，結(jié)果顯示PPD 試驗(yàn)因受卡介苗接種的影響，特異度較低；γ-干擾素釋放試驗(yàn)不受卡介苗接種的影響而具有較高的特異度。 其他研究［17-18］也顯示T-SPOT.TB 檢測(cè)能顯著提高結(jié)核診斷的靈敏度和特異度，有利于早期診斷和治療。

本次研究結(jié)果顯示， 針對(duì)2～14 歲的移民申請(qǐng)人，T-SPOT.TB 篩查結(jié)核感染的陽(yáng)性率 （1.75%）明顯低于PPD 試驗(yàn)的陽(yáng)性率（9.84%）；而T-SPOT.TB陽(yáng)性人群中X 光異常檢出率（18.03%）顯著高于PPD陽(yáng)性人群（1.13%）。 由此可知，T-SPOT.TB 檢測(cè)在赴美移民結(jié)核篩查中的敏感性和特異性優(yōu)于PPD 試驗(yàn)。 根據(jù)赴美移民體檢指導(dǎo)的要求，T-SPOT.TB 或PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性的2～14 歲申請(qǐng)人需進(jìn)行胸部X 光檢查，而T-SPOT.TB 試驗(yàn)可以排除BCG 的干擾，降低了假陽(yáng)性率， 使大量的2～14 歲移民申請(qǐng)人避免了不必要的胸部X 光檢查。

Brodie 等［19］研 究 顯 示，T-SPOT.TB 陽(yáng) 性 結(jié) 果 與肺結(jié)核密切接觸史顯著相關(guān)， 而TST 陽(yáng)性結(jié)果受BCG 接種影響，T-SPOT.TB 診斷潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI） 較TST 更加準(zhǔn)確。Bakir 等［20］對(duì)908 名肺結(jié)核接觸者兒童進(jìn)行了前瞻性研究，T-SPOT.TB 結(jié)果為陽(yáng)性的接觸者中，最終11 名發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核， 其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是TSPOT.TB 陰性接觸者的3.86 倍。 而且與TST 相比，以T-SPOT.TB 為標(biāo)準(zhǔn)能夠更加準(zhǔn)確地診斷結(jié)核感染。 T-SPOT.TB 的斑點(diǎn)數(shù)越多，發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核的可能性越大，而且短期內(nèi)有過結(jié)核接觸史的患者TSPOT.TB 的斑點(diǎn)數(shù)較多時(shí)更有意義。 Janssens 等［21］研究了T-SPOT.TB 在鑒別潛伏結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核中的作用，顯示T-SPOT.TB 的檢測(cè)數(shù)值在活動(dòng)性結(jié)核患者中顯著高于潛伏性結(jié)核感染人群，但仍難以區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染。 T-SPOT.TB 的斑點(diǎn)數(shù)雖然并不精確地與結(jié)核活動(dòng)程度呈正相關(guān)，但仍然存在著結(jié)核活動(dòng)程度越高斑點(diǎn)數(shù)越多的趨勢(shì)。 其它研究［22-24］也顯示如果T-SPOT.TB 的斑點(diǎn)數(shù)在短時(shí)間內(nèi)顯著增加， 則強(qiáng)烈提示體內(nèi)結(jié)核活動(dòng)，有必要給予預(yù)防性的治療。 斑點(diǎn)數(shù)的檢測(cè)對(duì)于結(jié)核病的治療也能起到輔助性作用，同時(shí)對(duì)評(píng)估治療效果有較高的應(yīng)用價(jià)值。田建嶺等［25］研究發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的數(shù)量可反映體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷，T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在活動(dòng)性TB 患兒中顯著高于LTBI 兒童，但還不能用于區(qū)分兒童活動(dòng)性TB 與LTBI。

目前國(guó)內(nèi)的研究大多還局限在少數(shù)的疑似結(jié)核或確診結(jié)核病例，還沒有對(duì)大規(guī)模的普通人群進(jìn)行對(duì)比分析研究。 本研究對(duì)大量2～14 歲赴美移民申請(qǐng)人的結(jié)核篩查情況進(jìn)行了分析。 赴美移民體檢指導(dǎo)要求，TST 或T-SPOT.TB 試驗(yàn)陽(yáng)性而胸部X 光正常的申請(qǐng)人應(yīng)被指定為L(zhǎng)TBI。經(jīng)對(duì)比分析本研究也發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB 試驗(yàn)較TST 更能準(zhǔn)確地診斷LTBI。盡管很多研究結(jié)果表明，T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)還不能明確用于鑒定活動(dòng)性TB 和LTBI，但T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的數(shù)量越多，發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核的可能性越大。 我們可以加強(qiáng)T-SPOT.TB 試驗(yàn)陽(yáng)性人群的后期隨訪，尤其是活動(dòng)性肺結(jié)核接觸者的隨訪。總之，T-SPOT.TB在赴美移民結(jié)核篩查中的優(yōu)勢(shì)明顯優(yōu)于PPD 試驗(yàn)。本研究的遺憾之處在于， 大多數(shù)人員入境美國(guó)后，其隨訪資料無(wú)法獲得。