于靖，裴天仙

1天津市胸科醫(yī)院，天津300051；2天津藥物研究院新藥評價有限公司

多柔比星(DOX)又稱阿霉素，是從波賽鏈霉菌變種Streptomyces peucerius var. caesius發(fā)酵液中提取的一種蒽環(huán)類抗生素，屬于細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，抗瘤譜較廣，臨床療效高。DOX主要用于急性白血病、乳腺癌、淋巴瘤等的治療[1～3]，一般為二線藥物，可作為惡性淋巴瘤交替使用的首選藥物。DOX雖然廣泛用于治療各種癌癥，但毒性較大，長期使用可發(fā)生劑量依賴性的多器官毒性，這使其臨床應(yīng)用受到限制。目前從臨床檢驗(yàn)和毒理學(xué)角度，對DOX在多個臟器毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究較少。2018年6～12月，本研究觀察DOX對大鼠心臟、肝臟、腎臟及免疫器官的長期毒性作用，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級SD大鼠48只，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量140～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號SCXK(京)2012-0001。DOX購自海正輝瑞制藥有限公司，批號H33021980，將DOX用5%葡萄糖注射液充分溶解稀釋至濃度為0.23、0.47、0.93 mg/L；5%葡萄糖注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號A15033210-1；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)檢測試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)公司。BD FACS AriaⅡ型流式細(xì)胞儀專用試劑購自美國BD公司；全自動生化分析儀c701購自德國羅氏診斷有限公司；FACS Aria Ⅱ型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；BX53普通光學(xué)顯微鏡、DP71病理顯微攝影系統(tǒng)均購自奧林巴斯公司；梅特勒-托利多PL203電子天平購自廣州滬瑞明實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 動物分組及給藥 將48只SD大鼠隨機(jī)分為溶劑對照組及DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組，每組12只，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組分別給予0.23、0.47、0.93 mg/L DOX經(jīng)尾靜脈推注，給藥體積30 mL/m2；溶劑對照組給予等體積的5%葡萄糖注射液經(jīng)尾靜脈推注，均緩慢勻速推注。每3周給藥1次，共給藥4次。給藥結(jié)束，用20%烏來糖(4～6 mL/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，剖取心臟、肝臟、腎臟、胸腺、脾及腸系膜淋巴結(jié)以備用。

1.3 血液生化指標(biāo)檢測 經(jīng)大鼠腹主動脈取血3～5 mL，置于真空促凝采血管內(nèi)，靜置30 min，3000 r/min離心10 min，取上層血清備用，用羅氏全自動生化分析儀檢測ALT、AST、CK、BUN、CRE。

1.4 大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測 EDTA抗凝全血100 μL，加入10 μL抗大鼠抗體CD3+-FITC、CD4+-APC、CD8+-PE、CD45RA-PE-Cy5，室溫避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫避光孵育10 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次。采用流式細(xì)胞儀參照試劑盒說明書計(jì)數(shù)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，計(jì)算CD4+/CD8+，并計(jì)數(shù)CD45RA+B細(xì)胞亞群。

1.5 臟器系數(shù)測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱取大鼠體質(zhì)量，剖取心臟、肝臟、腎臟、胸腺、脾和腸系膜淋巴結(jié)，用4%甲醛固定，以備組織病理學(xué)檢查；剔除心臟、肝臟、腎臟、胸腺和脾臟附著的結(jié)締組織和脂肪，精密稱取質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6 大鼠臟器組織病理變化觀察 取大鼠心臟、肝臟、腎臟、胸腺、脾及腸系膜淋巴結(jié)置于4%甲醛固定液中，固定24～48 h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色、透明和封固，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的病理變化[4，5]。

2 結(jié)果

2.1 DOX對大鼠血液生化指標(biāo)的影響 與溶劑對照組比較，DOX 7.0 mg/m2組血液生化指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，DOX 14.0 mg/m2組AST、BUN、CRE高(P均<0.05)，DOX 28.0 mg/m2組ALT、AST、BUN、CRE高(P<0.05)；各組血清CK水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 DOX對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05

2.2 DOX對大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響 與溶劑對照組比較，DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群、CD45RA+B細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)低，CD4+/CD8+高，DOX 14.0、28.0 mg/m2組外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群、CD45RA+B細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 DOX對大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05

2.3 DOX對大鼠臟器系數(shù)的影響 與溶劑對照組比較，DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組大鼠心臟、肝臟、腎臟的臟器系數(shù)均高，胸腺、脾臟臟器系數(shù)均低。其中，DOX 14.0 mg/m2組的肝臟、腎臟、胸腺臟器系數(shù)及DOX 28.0 mg/m2組的各器官臟器系數(shù)與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 DOX對大鼠各臟器系數(shù)的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05。

2.4 DOX對大鼠各臟器組織的毒性作用 溶劑對照組心臟結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，間質(zhì)未見異常。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的心臟病變，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞空泡變性、壞死，部分伴有心耳血栓。溶劑對照組肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心排列整齊，細(xì)胞形態(tài)清晰，間質(zhì)無異常改變。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組肝組織未見明顯異常，DOX 28.0 mg/m2組可見肝細(xì)胞不同程度空泡變性。溶劑對照組腎臟皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管形態(tài)清晰正常，間質(zhì)未見明顯異常。DOX 7.0 mg/m2組腎臟組織未見明顯異常，DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的腎病綜合征表現(xiàn)：腎小球空泡化，基膜增厚，系膜增生，部分見新月體形成；腎小管變性、壞死、再生、擴(kuò)張、管型、基膜增厚；間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤。溶劑對照組胸腺結(jié)構(gòu)完整，皮髓質(zhì)分界清晰，皮質(zhì)內(nèi)密集分布大量胸腺細(xì)胞。DOX 7.0 mg/m2組胸腺組織未見明顯異常。而DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的胸腺萎縮，表現(xiàn)為皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)分界不清晰，皮質(zhì)內(nèi)胸腺細(xì)胞減少乃至缺失。溶劑對照組脾臟由白髓、邊緣區(qū)和紅髓組成，結(jié)構(gòu)完整清晰，紅髓包含脾索和血竇。DOX 7.0 mg/m2組胸腺組織未見明顯異常，DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的脾臟萎縮，表現(xiàn)為白髓淋巴細(xì)胞減少，其中邊緣區(qū)減少更為明顯。溶劑對照組腸系膜淋巴結(jié)見皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)清晰，淋巴小結(jié)增生活躍。DOX 7.0 mg/m2組胸腺組織未見明顯異常，DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的淋巴結(jié)萎縮，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少。

3 討論

DOX屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是具有代表性的細(xì)胞毒類藥物，在腫瘤內(nèi)科治療發(fā)展歷程中具有里程碑意義，已有50多年的應(yīng)用歷史。即使在靶向治療、免疫治療等新療法不斷涌現(xiàn)的今天，DOX仍然是很多實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的基礎(chǔ)性藥物[6]。DOX是由微生物產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的化學(xué)物質(zhì)，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用，但S期細(xì)胞對其最敏感。DOX可導(dǎo)致多器官毒性，可能的機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥、自由基的產(chǎn)生、DNA損傷、鈣超載、細(xì)胞凋亡等，但最可能的機(jī)制是氧化應(yīng)激[7，8]。

臟器系數(shù)又稱臟體比，是實(shí)驗(yàn)動物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比。正常時成年大鼠各臟器與體質(zhì)量的比值比較恒定。動物發(fā)生毒性病變后，受損臟器質(zhì)量可能發(fā)生改變，故臟器系數(shù)也隨之改變。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、血栓、空泡變性(水樣變、脂肪變或糖原沉積)、增生、肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。

心臟毒性是蒽環(huán)類藥物最為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，蒽環(huán)類藥物引起心臟毒性的主要機(jī)制為鐵介導(dǎo)的活性氧簇的產(chǎn)生及促進(jìn)心肌的氧化應(yīng)激[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX各組心肌細(xì)胞變性、壞死，部分血栓形成，同時臟器系數(shù)升高，28.0 mg/m2組升高尤為顯著，可見DOX有明顯的心臟毒性，這與相關(guān)研究[10]結(jié)果一致。但心肌酶譜中CK在各實(shí)驗(yàn)組并未明顯升高，其原因可能因?yàn)镃K靈敏度較低，如果采用敏感度較高的肌鈣蛋白和反映心肌張力變化的BNP或NT-proBNP來預(yù)測心肌細(xì)胞損傷，可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果。因目前實(shí)驗(yàn)室所用試劑盒只能檢測人血清，無法檢測鼠來源血清，因此未對以上指標(biāo)進(jìn)行檢測。

DOX主要在肝臟代謝，經(jīng)膽汁排泄，有少量經(jīng)腎臟由尿排出，因此其對肝腎功能的損傷也不容忽視。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX 28.0 mg/m2組肝臟中肝細(xì)胞空泡變性，DOX 14.0、28.0 mg/m2組為腎病綜合征，表現(xiàn)為腎小球空泡化，基膜增厚，系膜增生，腎小管變性、壞死和腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤；另外，DOX 14.0、28.0 mg/m2組肝臟和腎臟質(zhì)量增加，臟器系數(shù)升高?？梢?，DOX有明顯的肝腎毒性，有研究顯示，DOX導(dǎo)致肝腎毒性的機(jī)制可能與凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。

正常機(jī)體中各T淋巴細(xì)胞亞群相互作用，維持著機(jī)體的免疫功能。當(dāng)不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，機(jī)體就可導(dǎo)致免疫功能紊亂并發(fā)生一系列的病理變化。胸腺是中樞免疫器官，內(nèi)有大量的胸腺細(xì)胞，即分化發(fā)育的各期T細(xì)胞；脾臟和淋巴結(jié)是外周免疫器官，組織內(nèi)的淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞和T細(xì)胞，其中脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞中B細(xì)胞約占60%，T細(xì)胞約占40%；淋巴結(jié)以B細(xì)胞為主，T細(xì)胞主要分布在邊緣區(qū)[12]。本研究結(jié)果表明，在外周血中，DOX 14.0、28.0 mg/m2兩個劑量可致大鼠CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD45RA+B 細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，CD4+/CD8+升高，機(jī)體免疫功能紊亂。另外，DOX 14.0、28.0 mg/m2組胸腺和脾臟較小，臟器系數(shù)明顯降低。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，DOX 14.0、28.0 mg/m2組胸腺、脾臟、淋巴結(jié)發(fā)生不同程度的萎縮，表現(xiàn)為T和(或)B細(xì)胞減少。由此可見，14.0、28.0 mg/m2的DOX可致大鼠免疫器官萎縮，免疫功能降低。

綜上所述，DOX作為一種臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，其對大鼠心、肝、腎和免疫器官均有不同程度的毒性反應(yīng)。但本研究只是初步觀察了DOX的毒性作用，未對其致毒的機(jī)制進(jìn)行深入探討，這將是今后工作的方向和重點(diǎn)。