蔡靚，李麗，趙以琳，宗道寬，劉希茹，童國慶

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 201203)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)被定義為40歲之前卵巢功能出現(xiàn)衰竭的狀態(tài)，閉經(jīng)時間≥4～6個月或兩次月經(jīng)間隔4周以上，F(xiàn)SH>40 U/L，伴有雌激素降低及絕經(jīng)癥狀。隨著社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展，女性生育年齡的推后，以及環(huán)境與疾病的各種影響，POF的發(fā)病率逐年升高[1]。誘發(fā)卵巢衰老的原因包括遺傳、DNA損傷修復(fù)、端粒、能量代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌、卵巢微環(huán)境等因素[2]。但大多數(shù)POF患者仍無法找到具體原因，即不明原因POF。在POF早期發(fā)生的卵泡閉鎖過程中，卵母細胞首先發(fā)生凋亡，卵泡顆粒細胞由內(nèi)層向外層逐漸凋亡；而生長晚期的卵泡，顆粒細胞首先凋亡，誘導(dǎo)卵母細胞凋亡，觸發(fā)了卵泡閉鎖。因此不論何種原因?qū)е碌腜OF，卵巢中卵母細胞與顆粒細胞的凋亡都是POF發(fā)病的重要因素。目前激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)是最基本的治療方法之一。但最近一些研究表明，接受HRT治療也會伴隨不良作用[3]。近年來，祖國醫(yī)學(xué)應(yīng)用于此類疾病的治療案例屢見不鮮，針灸在治療婦科疾病如子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征(PCOS)等中成功的例子也多有報道。因此本文中，我們探討了POF發(fā)生發(fā)展中細胞凋亡的作用機制以及針灸干預(yù)治療POF的潛在效應(yīng)。

一、細胞凋亡誘導(dǎo)POF的發(fā)病機制

POF的發(fā)生與細胞凋亡有密切關(guān)系。卵母細胞的成熟依靠卵巢和卵泡微環(huán)境自身穩(wěn)態(tài)的維持。顆粒細胞產(chǎn)生多種物質(zhì)支持卵母細胞的生長成熟，卵母細胞也分泌多種細胞因子作用于顆粒細胞表面上相應(yīng)的受體，促進顆粒細胞的增殖和分化，卵母細胞和顆粒細胞間在卵泡發(fā)育的不同階段都存在著聯(lián)系[4]。二者之間的共同作用參與調(diào)節(jié)卵泡成熟及排卵的過程，該過程涉及到多種信號通路，如cAMP、PI3K/AKT、mTOR、MAPK、Beclin-1/Bcl-2等[5]。顆粒細胞的凋亡也會導(dǎo)致卵母細胞凋亡。卵母細胞與顆粒細胞的凋亡共同促進卵泡閉鎖加速，從而導(dǎo)致POF。但是基于卵巢特有的生理環(huán)境和卵泡發(fā)育過程，其凋亡的發(fā)生又有著特殊的調(diào)控因素和模式[6]。

近年來有研究提示氧化應(yīng)激可能在POF的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Yu等[7]的研究顯示，亞砷酸鈉可通過氧化應(yīng)激和對類固醇代謝的影響引起卵母細胞凋亡，從而進一步導(dǎo)致大鼠卵泡的閉鎖。Tokmak等[8]研究發(fā)現(xiàn)POF患者血清中的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和總抗氧化狀態(tài)(total antioxidant status，TOS)水平高于健康的育齡女性，均提示氧化應(yīng)激參與了POF過程。

二、卵巢顆粒細胞凋亡的內(nèi)在機制

卵泡顆粒細胞的增殖和分化是卵泡發(fā)育成熟的基本條件，顆粒細胞為卵母細胞供給生長發(fā)育所需的大部分營養(yǎng)，顆粒細胞的狀態(tài)對卵母細胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能有很大影響，其凋亡異常直接導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常[9]。顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的重要因素之一[10]，正常情況下顆粒細胞分裂增殖和凋亡共同存在，當顆粒細胞凋亡率達到一定程度時卵泡閉鎖發(fā)生。而一定數(shù)量的卵泡同時發(fā)生閉鎖，就會導(dǎo)致POF。與普通細胞一樣，顆粒細胞的凋亡也是細胞程序性死亡，具有凋亡的形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)變化：從接受凋亡信號到凋亡調(diào)控分子間相互作用再到蛋白水解酶caspase活化，最后進入連續(xù)反應(yīng)過程。有研究報道卵泡顆粒細胞凋亡與Fas/FADD信號通路及B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)的表達密切相關(guān)[11]。

1.顆粒細胞凋亡的線粒體途徑：線粒體途徑，又稱內(nèi)源性途徑，指當細胞受到各種因素影響時，如細胞缺氧、癌基因被激活、DNA損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生等，會改變線粒體膜的通透性，使促凋亡因子[如細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)]穿透線粒體膜，激發(fā)細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[12]。

Bcl-2家族對卵巢顆粒細胞凋亡起決定作用，Bcl-2家族蛋白存在于免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等正常組織中，亦存在于人卵巢組織中，位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上。研究顯示Bcl-2家族通過線粒體途徑調(diào)控顆粒細胞的凋亡：(1)作用于抗凋亡蛋白，如Bcl-2等：通過抑制促凋亡蛋白Bax的線粒體膜透化作用來阻礙細胞凋亡，若抗凋亡蛋白的表達被抑制，則會促進顆粒細胞凋亡[13]；(2)作用于促凋亡蛋白，如Bax和Bak：在細胞受到凋亡刺激因子作用后被激活，結(jié)合到線粒體外膜并在線粒體外膜上形成25～100 nm的圓形孔道[14]，促使Cyt C和其他促凋亡因子穿透線粒體膜進入胞質(zhì)，誘發(fā)凋亡；(3)作用于BH3-only蛋白：此類蛋白能夠直接激活Bax或Bak，導(dǎo)致細胞凋亡[15]。

2.顆粒細胞凋亡的死亡受體途徑：細胞凋亡的外源性信號通路是通過死亡受體介導(dǎo)的，死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族，其胞漿區(qū)有一個具有蛋白水解功能的同源氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，稱為“死亡區(qū)域”(deathdomain，DD)。其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有3條，分別為TNFR、TRAIL和Fas/FasL信號途徑。以Fas/FasL信號途徑為例，F(xiàn)asL和Fas結(jié)合激活的受體與FADD結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death inducing signalling complex，DISC)，從而激活下游的Caspase分子，誘發(fā)細胞凋亡的發(fā)生[16]。另一方面Fas激活的Caspase-8會進一步激活Bcl-2家族成員，致使線粒體外膜透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)的發(fā)生，線粒體釋放Cyt C，引發(fā)下一步級聯(lián)反應(yīng)[17]。

Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)as-L)和Fas，兩者均表達于顆粒細胞，是死亡受體途徑中最常見的引起顆粒細胞凋亡的蛋白。林鵬飛等[18]檢測顆粒細胞中Fas-FasL mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)Fas、Fas-L mRNA的表達隨細胞培養(yǎng)時間的延長而增高，由此可推測Fas/Fas-L通路的激活有可能是引發(fā)顆粒細胞凋亡的重要因素之一。

3.細胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑與ROS蛋白：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑(endoplasmic reticulum signaling，ERS)主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致Ca2+超載或者穩(wěn)態(tài)失衡，可以有兩種途徑誘發(fā)凋亡，一是直接激活Caspase分子，二是激活Bax和Bak，誘發(fā)線粒體凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，這也可以看作是凋亡內(nèi)源性途徑的補充。目前研究發(fā)現(xiàn)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細胞凋亡的途徑有2條，一是CHOP(C/EBP homologous protein)凋亡途徑，二是Ire1-JNK(c-Jun N-terminal kinase)凋亡途徑[19]?；钚匝醴肿?reactive oxygen species，ROS)和Ca2+的相互作用對凋亡發(fā)生與發(fā)展有重要影響，ROS過多會激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的細胞凋亡[20]，細胞內(nèi)的多種結(jié)構(gòu)都含有豐富的Ca2+，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會釋放Ca2+，從而線粒體內(nèi)Ca2+也會增加，誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致線粒體功能障礙，最后導(dǎo)致凋亡。

ROS是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡的重要因素，機體在正常情況下會產(chǎn)生少量ROS，ROS的產(chǎn)生和機體的抗氧化能力之間的平衡打破時，引起卵泡閉鎖，最終導(dǎo)致POF。

4.誘導(dǎo)顆粒細胞凋亡的其他相關(guān)蛋白：還有一些其他蛋白參與顆粒細胞的凋亡，比如NF-kB、FOXO3(forkhead box O3)、髓細胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis viral oncogene，Myc)和p53。研究發(fā)現(xiàn)，NF-kB能夠調(diào)控細胞的調(diào)亡，NF-kB能上調(diào)凋亡基因Fas、c-myc及TNF-α的表達，引起細胞凋亡[21]。FOXO3是FOXO的轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)FOXO3的表達能夠誘發(fā)顆粒細胞凋亡，促進卵泡的閉鎖。研究顯示，Myc蛋白可能具有促進顆粒細胞凋亡的作用，進而誘導(dǎo)卵泡膜細胞的凋亡[22]。Liang等[23]研究指出，p53促進顆粒細胞凋亡的機制可能是p53抑制顆粒細胞內(nèi)由轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的有關(guān)pri-miRNA的表達，繼而通過pri-miRNA影響卵巢顆粒細胞的生長、發(fā)展和凋亡的過程。p53的一個同系物TAp63作為DNA損傷凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，與磷酸化的c-Abl(一種原癌基因)相互作用，級聯(lián)激活Bax和Bak，誘發(fā)顆粒細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。

三、卵巢卵母細胞凋亡的內(nèi)在機制

1.卵母細胞凋亡的途徑：卵母細胞的凋亡主要是通過線粒體途徑及死亡受體途徑，其過程與發(fā)生在顆粒細胞中的凋亡類似。Bcl-2家族在卵母細胞的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明抗凋亡因子Bcl2-L10在卵母細胞中具有特異性表達，對卵母細胞的發(fā)育、成熟及受精都有重要影響，對于卵母細胞的減數(shù)分裂過程有關(guān)鍵作用[24]。在衰老的卵母細胞中，促凋亡因子Bax通過中和Bcl2-L10加速卵母細胞凋亡進程，Bax表達的升高激活后續(xù)caspase級聯(lián)凋亡反應(yīng)，卵母細胞出現(xiàn)凋亡相關(guān)的生化和形態(tài)學(xué)改變[25]。

卵母細胞凋亡的死亡受體信號通路主要由腫瘤壞死因子受體家族FAS和TNFR1介導(dǎo)，與它們的配體(Fasl和TNFa)結(jié)合后被激活。研究表明大鼠卵母細胞中，磷酸化Thr161 Cdk1(cyclin-dependent kinase 1)水平的降低，推動Fasl介導(dǎo)的卵母細胞凋亡，激活一系列后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)，最終激活caspase-3導(dǎo)致卵母細胞凋亡[26]。活化的caspase-3切割關(guān)鍵結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，導(dǎo)致DNA被破壞，這些被破壞的DNA片段能夠在凋亡的卵母細胞中被檢測到[27]。

2.ROS對卵母細胞凋亡的影響：ROS的產(chǎn)生或抗氧化系統(tǒng)的缺失也易導(dǎo)致卵母細胞的凋亡。ROS可導(dǎo)致線粒體膜電位的下降及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mtPTP)的開放，使Cyt C從轉(zhuǎn)換孔中釋放，與凋亡激活因子-1(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)結(jié)合，活化caspase-9，激活下游的效應(yīng)caspase，啟動細胞凋亡。研究表明，Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL，能夠促進mtPTP的開放，激活卵母細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[28]。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+載體(Ca2+ionophore，CI)通過增加細胞內(nèi)Ca2+水平誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生而導(dǎo)致小鼠卵母細胞的凋亡，cAMP和cGMP水平的降低也可增加Ca2+水平而誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[29]。ROS持續(xù)產(chǎn)生可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激降低了雙線期和MⅡ阻滯期卵母細胞內(nèi)的存活因子和成熟促進因子(maturation-promoting factor，MPF)的不穩(wěn)定性，持續(xù)降低MPF的不穩(wěn)定水平可激發(fā)卵母細胞的凋亡[30]。

四、針灸干預(yù)POF的作用機制

近年來有研究表明，針灸具有抗氧化、調(diào)節(jié)自由基代謝，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗衰老、抑制細胞凋亡、改善卵巢與子宮微環(huán)境、促進卵泡成熟等多種改善POF癥狀、延緩POF進程的作用[31]。有研究探討了針灸抑制卵巢細胞凋亡的機制，選取符合圍絕經(jīng)期特征的雌性大鼠為對象，采用針刺大鼠腎俞、足三里、三陰交穴位治療，與未接受針刺的大鼠對比發(fā)現(xiàn)，針刺治療后圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細胞 Fas mRNA表達明顯降低，而Bcl-2 mRNA表達明顯提高[32]。鄭艷華等[33]也發(fā)現(xiàn)低頻電針能夠降低大鼠卵巢組織中Bax的蛋白表達，下調(diào)Bax/Bcl-2比值；卵巢染色切片發(fā)現(xiàn)，接受針刺的大鼠卵巢可見多個黃體存在，囊性卵泡減少，顆粒細胞層明顯增厚?？梢酝茰y，針灸可能是通過線粒體途徑和死亡受體途徑抑制卵巢細胞凋亡，改善卵巢微環(huán)境，從而延緩POF的進程。

PI3K/Akt通路通過抑制細胞的凋亡，增加細胞的存活率，在減輕氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著重要的作用；當PI3K/Akt通路遭到影響，會增加氧化應(yīng)激的發(fā)生，抑制細胞增殖，進一步激發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)[34]。有研究以環(huán)磷酰胺腹腔注射SD雌性大鼠建造POF動物模型，將造模成功的大鼠分組后針刺干預(yù)，發(fā)現(xiàn)針刺組成熟卵泡數(shù)量增加，血清E2水平提高，F(xiàn)SH下降明顯，相關(guān)信號通路的PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達量呈升高趨勢，表明針刺對于POF的治療具有一定效果；其作用機制可能與上調(diào)PI3K/Akt通路的相關(guān)基因有關(guān)[35]。

p53在卵巢顆粒細胞凋亡中也起了重要作用。許多凋亡因子基因啟動子可與p53結(jié)合，激活后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)，促使凋亡相關(guān)因子Fas、FasL、促凋亡蛋白Bax等表達增高，誘導(dǎo)細胞凋亡。相珊等[36]研究發(fā)現(xiàn)，電針治療可以提高行IVF-ET的不孕癥女性獲胚數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎率，并且可以下調(diào)其卵巢顆粒細胞中p53 mRNA、Bad mRNA的表達。由此推測電針治療可以通過下調(diào)p53及Bad的過表達達到抑制卵巢顆粒細胞凋亡、保護卵巢功能的效果。

鄭艷華等[37]發(fā)現(xiàn)低頻電針能夠降低大鼠血清性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)、β細胞功能指數(shù)(modified βcell function index，MBCI)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及血糖水平，其機制可能是通過調(diào)節(jié)胰島β細胞的功能，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。有研究報道房繄恭教授的“調(diào)經(jīng)促孕針法”在促進排卵及恢復(fù)卵巢功能的治療上，也取得了很好的臨床療效，其機制在于“調(diào)經(jīng)促孕針法”能夠下調(diào)血清FSH、LH水平，從而達到改善POF的效果[38]。針灸可以通過減輕氧化應(yīng)激改善卵巢與子宮的功能，延緩卵巢與子宮的衰老進程，可能是針灸治療POF的機制之一。

五、結(jié)語

綜上，HRT的治療方案雖仍是目前治療POF的經(jīng)典方法之一，但激素潛在的致癌作用、影響肝腎代謝、增加血栓等風(fēng)險限制了其長時間應(yīng)用[39]。治療后一旦停止用藥，病情就容易反復(fù)，這些問題增加了POF患者的心理負擔(dān)，降低了依從性，使治療難以堅持，也限制了其長期應(yīng)用。現(xiàn)有多個研究證明針灸治療能調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌及代謝水平，明顯減少卵巢中發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低卵巢顆粒細胞及卵母細胞的凋亡；并通過延緩細胞的凋亡，來調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞的分泌功能，調(diào)控卵泡的發(fā)育，延緩卵巢衰老，降低POF的發(fā)生率。本文中，簡要介紹了針灸干預(yù)POF細胞凋亡途徑的作用機制。傳統(tǒng)中醫(yī)手段干預(yù)POF的發(fā)生發(fā)展，吸引了越來越多的關(guān)注，但這些治療方法仍缺乏高質(zhì)量控制的臨床試驗評估以及深入的機制研究。如果將針灸與HRT聯(lián)合應(yīng)用，可能會提高POF的治療效果，降低HRT療法的不良反應(yīng)，也許是綜合醫(yī)學(xué)的又一突破。鑒于POF女性對于HRT和自然療法的需求，有必要進一步研究針灸的作用機制，也需要更多證據(jù)來支持傳統(tǒng)中醫(yī)療法在POF治療中的應(yīng)用。