包雯

國家藥品監(jiān)督管理局 醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100081

我國體外診斷產(chǎn)業(yè)正處于蓬勃發(fā)展的階段，新的產(chǎn)品層出不窮，尤其是用于惡性疾病輔助診斷的試劑，其主要類別之一為腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑。已上市的產(chǎn)品積累了一定的技術(shù)基礎(chǔ)，但尚存在性能驗證不充分的問題。如何在符合我國國情的前提下，指導企業(yè)科學合理地開展腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑的性能評價，從而加速相關(guān)產(chǎn)品的注冊申報，成為亟待解決的問題。這就要求企業(yè)不僅應(yīng)重視臨床試驗的開展，也須系統(tǒng)而全面地進行臨床前性能的研究，以綜合評價產(chǎn)品的安全有效性。

臨床前研究指的是從產(chǎn)品原材料的選擇、反應(yīng)體系的確認、企業(yè)參考品的設(shè)置、生產(chǎn)工藝的研究到產(chǎn)品分析性能評估，以及陽性判斷值的確定的階段。本文結(jié)合作者的工作經(jīng)驗，闡述了腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑的技術(shù)審評關(guān)注點。旨在通過梳理企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)過程中面臨的共性問題，指導相關(guān)產(chǎn)品的注冊申報，其他一般性要求可參照相關(guān)的規(guī)范性文件。需要注意的是，企業(yè)應(yīng)使用在有效運行的生產(chǎn)質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的多批產(chǎn)品進行分析性能評估，以及確定陽性判斷值。

此外，有效評價體外診斷試劑的分析性能，正確確定陽性判斷值，將會大幅提高臨床評價指標滿足驗收標準的概率，反之可能對臨床試驗結(jié)果（如靈敏度和特異性）造成不利影響。

1 腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑的背景

人類基因組DNA的甲基化目前發(fā)現(xiàn)存在于“CG”二核苷酸中的胞嘧啶堿基（C）上，是人類的表觀遺傳修飾方式之一，能夠調(diào)節(jié)基因的表達?；騿幼訁^(qū)CpG島的甲基化通常被認為是基因表達降低甚至沉默的標志。正常人群中的抑癌基因啟動子區(qū)CpG島一般為低甲基化狀態(tài)，當其發(fā)生異常高甲基化時，將會使細胞逃逸凋亡、DNA修復(fù)缺陷、血管生成或發(fā)生黏附功能缺失等。于是，特定基因DNA甲基化水平和模式的改變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。例如，相對于正常結(jié)直腸組織，SDC2基因在不同分期的結(jié)直腸癌和部分進展期腺瘤組織中呈高水平甲基化狀態(tài)，提示對其進行檢測具有輔助診斷結(jié)直腸癌和進展性腺瘤的臨床應(yīng)用價值[2-3]。另外，美國FDA已批準KRAS基因突變、BMP3/NDRG4基因甲基化和便隱血聯(lián)合檢測試劑，用于50歲及以上典型平均風險的結(jié)直腸癌患者篩查，但不能替代高風險人群的結(jié)直腸鏡檢查。

甲基化試劑的研發(fā)分為臨床前研究和臨床試驗兩個階段。我國已有Septin9和SDC2基因甲基化檢測試劑盒等數(shù)個產(chǎn)品上市，用于結(jié)直腸癌的輔助診斷。目前有多個產(chǎn)品正在注冊申報過程中，通過聯(lián)合檢測多個基因的甲基化狀態(tài)，用于結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌等的輔助診斷。該類產(chǎn)品一般基于實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測糞便、血液或組織樣本中腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)。預(yù)期用途為結(jié)合影像學、病理學等其他檢測手段，用于對有相關(guān)適應(yīng)癥疑似癥狀患者的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供臨床醫(yī)生參考，不作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他檢測指標進行綜合判斷。

2 腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑企業(yè)參考品的設(shè)置

此類產(chǎn)品目前尚無適用的國家參考品，企業(yè)應(yīng)在保證產(chǎn)品原材料和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可靠的基礎(chǔ)上，科學合理地設(shè)置企業(yè)參考品，并相應(yīng)地進行產(chǎn)品性能驗證以及后續(xù)的產(chǎn)品檢驗。

陽性參考品考慮檢出能力的驗證，建議設(shè)置為不同濃度水平的相關(guān)適應(yīng)癥患者樣本或標準細胞系。陰性參考品則考慮檢測特異性的評價，可為其他相關(guān)腫瘤類型的患者樣本、其他基因甲基化的樣本或標準細胞系等。精密度參考品包含中等強度陽性、弱陽性和陰性水平樣本。檢出限參考品包含不同背景核酸濃度下、目標基因不同甲基化比例的樣本；可采用臨床樣本或細胞系，基質(zhì)建議使用臨床陰性樣本。注意，不建議采用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA（bisDNA）作為企業(yè)參考品的原料。

3 腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑反應(yīng)體系的研究

3.1 樣本要求

對樣本采集與處理的過程進行充分研究，包括樣本采集方法、原始樣本用量和核酸用量等。建議納入數(shù)十例臨床樣本，充分評價樣本采集、核酸提取和轉(zhuǎn)化過程的精密度。

3.2 核酸提取、轉(zhuǎn)化和純化環(huán)節(jié)的性能

首先評價核酸提取試劑的提取效率、濃度和純度。另外對甲基化轉(zhuǎn)化過程進行研究，即轉(zhuǎn)化能力的評價，包括核酸回收率、轉(zhuǎn)化效率和保護效率。建議與焦磷酸測序或其他商業(yè)化轉(zhuǎn)化試劑盒進行比較。

注意，須采用臨床真實樣本充分評價轉(zhuǎn)化前后DNA的含量、內(nèi)參基因的量值、各個基因的甲基化狀態(tài)以及比例等。

4 腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑的分析性能評估[4]

體外診斷試劑的通用要求是由相關(guān)企業(yè)在主要原材料和反應(yīng)體系經(jīng)過確認、生產(chǎn)工藝得到有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，制訂方案并相應(yīng)地開展研究。試驗人員應(yīng)經(jīng)過必要的培訓，熟悉檢測系統(tǒng)的操作程序、樣本制備方式和試驗方案，嚴格執(zhí)行校準和質(zhì)量控制方法。在對結(jié)果進行數(shù)據(jù)檢查后，選擇適當?shù)慕y(tǒng)計方法進行分析，并形成研究報告。

以下闡述了腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑的具體評價內(nèi)容，包括推薦的研究方法以及采用的樣本類型。

4.1 測量準確度（accuracy of measurement）[5-7]

測量準確度包括正確度和精密度，受系統(tǒng)誤差和隨機誤差共同影響。建議綜合考慮不精密度和偏倚的影響，首選采用總分析誤差較小的對比方法進行比較研究。

4.1.1 正確度（trueness） 首選采用與臨床診斷結(jié)果進行比較研究的方式，評價試劑的診斷靈敏度?；虿捎门c已上市同類產(chǎn)品進行方法學比較研究的方式，通過計算陰陽性符合率和總符合率，評價試劑與同類產(chǎn)品的一致性。如無同類產(chǎn)品，也可采用核酸序列測定方法，如高通量測序或數(shù)字PCR法等。

建議使用臨床真實樣本，納入不同分期的相關(guān)腫瘤適應(yīng)癥樣本進行符合性研究，另外納入其他易轉(zhuǎn)移至原發(fā)腫瘤部位的癌癥類型、腫瘤部位的其他良性疾病、其他相關(guān)腫瘤類型的患者樣本對試劑進行特異性評價。

樣本可為有明確診斷結(jié)果的患者樣本或者參考樣本盤等。

4.1.2 精密度（precision） 即重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性，主要變量包括操作者、儀器、運行、試劑批次、校準品批次、校準周期、時間、地點等。

建議使用臨床樣本進行評價，包括陰性、弱陽性以及中等陽性水平的樣本。

4.2 分析靈敏度（analytical sensitivity）[8]

對于定性檢測試劑而言即為最低檢測限。選取特定濃度的陽性樣本梯度稀釋進行最低檢測限的確定。建議設(shè)置多個濃度梯度，每個濃度重復(fù)檢測不少于3次，以100%可檢出的最低濃度水平作為預(yù)設(shè)檢測限。在此濃度附近制備若干濃度梯度樣品，每個濃度至少重復(fù)檢測20次，將具有95%陽性檢出率的最低濃度作為最低檢測限。建議使用臨床陰性樣本作為基質(zhì)，充分評價在不同DNA濃度下，試劑對于不同甲基化比例目標基因的檢出能力。

樣本可為標準細胞系或特定濃度的臨床陽性樣本。注意應(yīng)對其甲基化狀態(tài)進行確認，可采用進行甲基化轉(zhuǎn)化后測序，驗證甲基化序列位點的方法。

4.3 分析特異性（analytic specificity）

4.3.1 交叉反應(yīng)（cross reactivity） 包括具有同源性序列的核酸片段、其他基因甲基化樣本等。

4.3.2 干擾物質(zhì)（interference）[9]包括血紅蛋白、脂質(zhì)、膽紅素、自身免疫抗體、常用藥物及其代謝物、患者使用的治療藥物、抗凝劑和已有報道的干擾物質(zhì)等。

建議對樣本中可能存在的內(nèi)源性及外源性干擾物質(zhì)進行研究。具體方法為使用多份弱陽性、陽性的臨床樣本，分別添加醫(yī)學決定水平濃度的干擾物質(zhì)（建議為可能存在的最高濃度水平），每個樣本重復(fù)檢測不少于3次，評價待測物的回收率，確定是否產(chǎn)生干擾。

5 腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑陽性判斷值的確定[10-11]

陽性判斷值在鑒別良性與惡性疾病、確定疾病進程等方面具有重要意義。正確制定陽性判斷值能夠充分體現(xiàn)試劑的臨床性能，如診斷準確性等。下述內(nèi)容包括推薦的研究方案以及采用的樣本類型。

對于包含多個腫瘤相關(guān)基因甲基化的檢測試劑，可分別確定不同單個目標基因和內(nèi)參基因Ct值的差值或拷貝數(shù)的比值，判定檢測結(jié)果的陰陽性。在此基礎(chǔ)上，采用邏輯回歸模型分析，初步建立公式，具體為賦予各個自變量（ΔCt值）不同的回歸系數(shù)并計算總體分值，以達到與診斷結(jié)果一致性最佳的目的。再根據(jù)上述分值進行ROC曲線分析，選擇約登指數(shù)最大值點或者平衡臨床性能最優(yōu)的靈敏度和特異性界值，從而確定試劑的陽性判斷值。其量值單位可為ΔCt值或者分值。

陽性判斷值的確定過程包括建立與確認兩個階段。建議區(qū)分訓練集和驗證集，分別納入不同的樣本子集，以保證算法模型的可靠性。注意采用臨床真實樣本進行研究，應(yīng)來源于試劑預(yù)期的適用人群以及相關(guān)適應(yīng)癥并充分覆蓋不同的亞組。樣本總數(shù)量可為數(shù)百例。

另外，考慮到確定陽性判斷值時使用的樣本對于目標人群的代表性有限，建議通過臨床試驗進一步確認陽性判斷值的準確性。

6 結(jié)語

隨著腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑的涌現(xiàn)，針對產(chǎn)品設(shè)計開發(fā)過程中存在的技術(shù)難點以及合規(guī)性問題，必要的解決手段之一是指導企業(yè)如何規(guī)范地開展臨床前研究，不但能夠提高臨床試驗成功的可能性，并且有助于后續(xù)產(chǎn)品注冊的順利進行。

本文結(jié)合國際通用注冊申報規(guī)范性文件、相關(guān)技術(shù)指南等，對腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑反應(yīng)體系研究、分析性能評估以及陽性判斷值確定的關(guān)鍵要素進行了初步探討，期望有助于相關(guān)企業(yè)更具針對性地進行相關(guān)試劑的臨床前研究，相應(yīng)地大幅提高產(chǎn)品的注冊申報效率。此外，期待與各方協(xié)作探索更加優(yōu)化的評價方法，共同努力提升研究質(zhì)量。