楊 陽 陳永進(jìn) 張 旻

牙本質(zhì)基質(zhì)中含有多種非膠原蛋白(NCP)，是牙本質(zhì)礦化的重要調(diào)控因子。多數(shù)NCP被認(rèn)為有高度酸性，可以為羥基磷灰石晶體成核和成熟提供動(dòng)力并減少激活能，這些都?xì)w功于其所含有的天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸等。牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)作為最重要的一種非膠原蛋白，是牙本質(zhì)涎磷蛋白的裂解產(chǎn)物，能夠參與纖維內(nèi)礦化，礦物晶體的初步形成及成熟等過程，在牙本質(zhì)的再礦化過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用[1]。

一、牙本質(zhì)磷蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

1.牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)的結(jié)構(gòu)：DPP中含有豐富的磷酸化的絲氨酸(45%～50%)和天冬氨酸(35%～38%),這些氨基酸以重復(fù)序列(Asp-Pse-Pse)n即(DSS)n，3≤n≤14,以及(Asp-Pse)m即(SD)m，m=2或3出現(xiàn)，使得DPP帶有非常多的陰離子，并有很強(qiáng)的鈣離子結(jié)合能力[2]。不同物種之間，DPP的等電點(diǎn)均有所不同，比如大鼠的為1.10，人的為2.65。許多證據(jù)表明，DPP由成牙本質(zhì)細(xì)胞合成后，經(jīng)過高爾基體轉(zhuǎn)送，并由細(xì)胞突輸送至礦化牙本質(zhì)前緣，并在此處分泌至細(xì)胞外基質(zhì)并與膠原直接結(jié)合[3]。DPP以可溶和不可溶兩種形式存在于牙本質(zhì)基質(zhì)中：可溶性DPP指只使用一般方法(如中性EDTA，0.6mol/L HCl等)處理牙本質(zhì)就可以從牙本質(zhì)中釋放的部分；不可溶性DPP與膠原結(jié)合緊密，只有使用一些變性劑如鹽酸呱啶等使膠原變性后，才能少量釋放。可溶性DPP的數(shù)量較不可溶性DPP的數(shù)量較多，盡管二者的存在形式、數(shù)量均不同，但其氨基酸組成相似。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同種屬動(dòng)物的DPP相對(duì)分子質(zhì)量明顯不同，即使是相同種屬動(dòng)物的DPP相對(duì)分子質(zhì)量也可以不同。這種結(jié)果可能是種屬差異造成的，也可能是提取DPP的方法不同導(dǎo)致的。MacDougall等[4]認(rèn)為翻譯后的修飾即磷酸化造成了不同種屬動(dòng)物DPP分子的不同。也有研究者認(rèn)為DPP相對(duì)分子質(zhì)量的不同也可能是由于提取過程中蛋白的降解或在進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳走膠時(shí)蛋白行為的異常引起的。

2.DPP的功能：DPP中含有許多特殊的氨基酸序列，即由絲氨酸(S)和天冬氨酸(D)形成的DSS序列，其磷酸根和羧酸根在肽鏈兩側(cè)形成許多突出的嵴，是鈣離子的高結(jié)合位點(diǎn)，可以在此部位誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體成核；DPP與細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原結(jié)合后還可以調(diào)控羥基磷灰石晶體的生長和成熟[5]。研究表明，溶液中游離的DPP分子可以抑制羥基磷灰石晶體的形成，而當(dāng)DPP固定于人工支持物表面或擴(kuò)散到凝膠體系時(shí)，低濃度可以促進(jìn)羥基磷灰石的形成，高濃度反而抑制其形成和生長[3,6]。因此，可以說體內(nèi)牙本質(zhì)生物礦化過程中，DPP發(fā)揮雙重作用。DPP與Ⅰ型膠原纖維結(jié)合后能形成一種新的蛋白排布，這種新的三維結(jié)構(gòu)可以更好地結(jié)合鈣離子和磷酸鹽進(jìn)而促進(jìn)羥基磷灰石初始晶體的形成；隨著礦化的不斷發(fā)生，高濃度的DPP與正在生長的晶體結(jié)合，抑制或減緩晶體的生長速度，從而影響晶體的形狀和大小。

二、仿生礦化研究概況

1.生物礦化和仿生礦化的定義：生物礦化是指在細(xì)胞的參與下，環(huán)境中的無機(jī)離子選擇性地沉積于特定的有機(jī)基質(zhì)的表面，從而形成礦物質(zhì)的過程，其實(shí)質(zhì)為在生物體內(nèi)所進(jìn)行的晶體生長過程。根據(jù)受生物控制的程度Lowenstam把生物礦化過程分為生物誘導(dǎo)(biologically induced)礦化和有機(jī)基質(zhì)調(diào)控(organic matrix mediated)礦化兩種作用類型。生物礦化中晶體的形成主要包括以下幾個(gè)步驟：在基質(zhì)內(nèi)蛋白表面形成晶核(即成核)；晶核成長為微晶并發(fā)育成熟(即晶核生長)；在某些因素的作用下小顆粒集聚并沉淀(即集聚)；形成的無定型磷酸鈣和磷酸八鈣在環(huán)境中pH值、溫度、Ca、P等濃度的影響下轉(zhuǎn)換為羥基磷灰石晶體(即固相轉(zhuǎn)換)。生物礦化的過程主要是通過有機(jī)基質(zhì)、細(xì)胞以及基因來進(jìn)行調(diào)控的。

仿生礦化(biomimetic mineralization)指通過模擬生物體的生物礦化，以有機(jī)基質(zhì)作為模板，對(duì)無機(jī)物的形成和生長進(jìn)行調(diào)控，從而在體外合成類骨及類牙樣物質(zhì)。通過仿生礦化可以制備具有獨(dú)特的微觀結(jié)構(gòu)和生物性能的材料。仿生礦化的過程主要包括以下步驟：①有機(jī)大分子自組裝為無機(jī)物的成核提供模板；②無機(jī)物在有機(jī)模板的端點(diǎn)與其相互識(shí)別，并在此部位迅速沉積；③有機(jī)模板的自組裝過程持續(xù)進(jìn)行并通過靜電作用、電荷、極性等對(duì)無機(jī)礦物的生長進(jìn)行調(diào)控；④最后亞單元礦物組裝形成與自然生物礦物結(jié)構(gòu)相類似的礦物質(zhì)[7]。Kikuchi等[8]已經(jīng)使用仿生合成技術(shù)合成了一種HAp/Col的復(fù)合物，這種復(fù)合物與骨的微觀結(jié)構(gòu)相似，所形成的直徑只有50～100nm的片狀羥基磷灰石晶體的c軸與Col纖維長軸平行排列。這種復(fù)合物被納入骨的重建過程后，可以被破骨細(xì)胞吸收并被成骨細(xì)胞形成新骨，就好像移植自體骨一樣[9]。

2.仿生礦化體外模型:在仿生礦化相關(guān)的體外研究中，體外礦化模型是獲得研究結(jié)果所必不可少的。目前應(yīng)用最多的仿生礦化系統(tǒng)包括有機(jī)基質(zhì)調(diào)控體系、有序膜模擬體系、凝膠礦化模型以及以陽離子選擇膜為基礎(chǔ)的雙膜礦化系統(tǒng)，利用這些體外礦化模型能夠有效的進(jìn)行仿生礦化的研究。

(1)有機(jī)基質(zhì)調(diào)控下進(jìn)行的仿生礦化:這種研究方法主要是直接采用生物體內(nèi)的有機(jī)基質(zhì)進(jìn)行體外模擬合成無機(jī)礦物。已經(jīng)有研究表明，利用膠原纖維作為有機(jī)基質(zhì)模板可以在體外成功的合成羥基磷灰石晶體和氟磷灰石晶體[10]。自組裝的釉原蛋白也可以誘導(dǎo)和控制羥基磷灰石的形成[11]。王天達(dá)等[12]和Coelfen[13]總結(jié)出在膠原纖維的礦化過程中，磷酸鈣微晶開始在復(fù)雜的聚合結(jié)構(gòu)間形成穩(wěn)定的礦化物滴，隨后礦化物滴在膠原纖維表面和膠原內(nèi)部的獨(dú)特區(qū)域結(jié)合膠原分子，膠原纖維內(nèi)部的液態(tài)礦化物滴彌散于膠原纖纖維固化為不定型的晶相，最后，在膠原有序化結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)下，不定型的礦化物晶相轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄏ虻囊欢ńY(jié)構(gòu)的磷灰石晶體。

(2)有序分子膜模型:有序分子膜體系就是單分子膜，具有非常規(guī)則的結(jié)構(gòu)排布，為晶體生長提供了良好的模板能較好的模擬生物礦化過程。目前，LB膜和自組裝單分子膜是有序分子膜的兩種基本形式。

LB膜(Langmuir-Blogett film)是在20世紀(jì)30年代由Langmuir和Blogett共同建立的，即將兩親分子在氣/水界面通過水平加壓使分子緊密有序排列而形成有序單分子膜，利用LB 膜技術(shù)進(jìn)行生物礦化已成為生物礦化仿生合成的一種重要方法。Kimiyasu等[14]在玻璃表面形成花生酸LB膜，并浸泡于模擬體液中，之后通過掃描電鏡、透射電鏡等觀察發(fā)現(xiàn)LB膜上有羥基磷灰石晶體形成。此外，還有研究者通過采用Langmuir-Blodgett(LB)技術(shù)在不銹鋼和鈦表面沉積了一種化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單的磷脂磷酸二十六烷基，利用該機(jī)制生成了碳化羥基磷灰石[15,16]。

自組裝單分子膜(self-assembled monolayers，SAMs)是近年來發(fā)展起來的一種新型有機(jī)超薄膜，在SAMs膜的表面反應(yīng)物能夠富集、定位并被催化。有研究發(fā)現(xiàn)在室溫下Ca/P摩爾比為1.66的礦化液中，以玻片表面形成的硬脂酸自組裝膜為模板成功地誘導(dǎo)了碳酸磷灰石薄膜的形成[17]。Wu等[18,19]在鈦板表面形成的磷酸(含有16個(gè)碳原子烷基)自組裝單分子膜能夠有效地促進(jìn)HA晶體的沉積。

(3)凝膠礦化模型:凝膠法是以凝膠作為擴(kuò)散和支持介質(zhì)，來模擬生物礦化的一種重要的方法。已經(jīng)有許多研究利用凝膠法來探索仿生礦化過程，如Boskey等[20]建立了凝膠和瓊脂擴(kuò)散體系，并且證明了非膠原蛋白在羥基磷灰石晶體形成過程中所起的促進(jìn)或抑制作用。Hunter等[21]利用丙烯酰胺凝膠體系來探索體外的礦化過程。Gajjeraman等[22]用硅膠鹽凝膠作為晶體形成的介質(zhì)來研究HA晶體的形成。

(4)雙膜體系:雙膜系統(tǒng)是近年來出現(xiàn)的一種新的體外礦化模型，由陽離子選擇膜(cation-selective membrane)和透析膜(dialysis membrane)組成，在陽離子選擇膜和透析膜之間形成反應(yīng)腔隙，鈣離子溶液通過陽離子選擇性膜進(jìn)入反應(yīng)腔隙，磷酸根離子透過透析膜進(jìn)入反應(yīng)腔隙。目前，應(yīng)用于牙齒生物礦化研究的多為雙膜系統(tǒng)。Iijima等[23]在雙膜系統(tǒng)中利用豬釉原蛋白和氟離子作為牙釉質(zhì)形成的模型，豬釉原蛋白和氟離子的結(jié)合會(huì)在調(diào)節(jié)習(xí)慣、尺寸定位及鈣磷晶體形成階段起到協(xié)同作用，從而形成類似于真實(shí)牙釉質(zhì)晶體的棒狀磷灰石晶體。

三、牙本質(zhì)磷蛋白在牙組織仿生礦化中的研究進(jìn)展

牙齒是人體唯一無細(xì)胞性，由外胚葉和間質(zhì)來源的堅(jiān)硬組織，結(jié)構(gòu)相對(duì)較簡單。牙體硬組織被破壞后是無法再生的。目前，大多數(shù)的牙體組織缺損修復(fù)均是使用復(fù)合樹脂、生物陶瓷等材料，但是這些材料與牙體組織在結(jié)構(gòu)、組成以及性質(zhì)等方面均有很大的差異；而且這些修復(fù)材料與牙體組織之間存在的界面問題，可引起邊緣微滲漏、牙本質(zhì)過敏、繼發(fā)齲等問題。因此，探尋一種可以使牙體組織“再生”的方法成為牙體硬組織缺損修復(fù)的關(guān)鍵。近年來，隨著仿生合成技術(shù)的迅速發(fā)展和成熟，一些研究者將目光放在仿生礦化上，以期在體外合成類牙體硬組織樣的結(jié)構(gòu)，用于修復(fù)各種原因引起的牙體硬組織的缺損。

NCPs如磷蛋白、骨橋蛋白、骨結(jié)合蛋白、骨鈣素等均富含酸性氨基酸，尤其是天冬氨酸和磷酸化的絲氨酸，被稱為陰聚離子蛋白。這些蛋白參與幾乎所有生物的礦化過程，這些聚陰離子蛋白可與膠原結(jié)合并結(jié)合鈣磷離子從而誘導(dǎo)晶體形成；而在可溶性條件下又可抑制鈣磷離子沉積于已形成的晶體上。有研究證實(shí)，在鈣磷酸鹽飽和溶液中加入Ⅰ型膠原和天冬氨酸陰離子模擬礦化環(huán)境中的富含天冬氨酸的NCPs，可以誘導(dǎo)礦化并在初期形成無定型磷酸鈣，并很快就在膠原支架中形成有序的類似骨的礦化[24]。

目前，DPP作為牙本質(zhì)中最重要的NCPs，被認(rèn)為是唯一的能夠形成類似于發(fā)育中的骨中所包含的礦化結(jié)節(jié)的蛋白，已經(jīng)被證實(shí)在牙齒的仿生礦化中起關(guān)鍵性作用，并且將其引入組織工程中能促進(jìn)誘導(dǎo)仿生礦物質(zhì)的形成。DPP與Ⅰ型膠原結(jié)合，并在該處結(jié)合鈣離子從而促進(jìn)HA在此處成核，DPP是羥基磷灰石晶體的形成和生長的一個(gè)重要的引發(fā)劑和調(diào)制器。體外研究表明，在中性pH值及較低的DPP/膠原比例時(shí)，在距離N-末端210nm處會(huì)產(chǎn)生唯一的結(jié)合位點(diǎn)，可以誘導(dǎo)膠原的局部構(gòu)想發(fā)生改變，使分子彎曲并減少其有效長度；當(dāng)DPP/膠原比例較高時(shí)，DPP可以結(jié)合所有的膠原纖維[25]。分子圖形進(jìn)一步表明，與膠原纖維比較DPP中羧酸與磷酸集團(tuán)之間的間隔可能是決定晶體生長取向所必需的，DPP可能提供礦物晶體與膠原纖維之間的內(nèi)在聯(lián)系[26]。體外成核現(xiàn)象表明，自然來源的DPP可以誘導(dǎo)羥基磷灰石成核，且這種晶體與礦化牙本質(zhì)中的晶體有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)；但是重組的DPP只能形成無定型磷酸鈣[27]。Suzuki等[28]通過研究DPP基因敲除的小鼠的牙齒，結(jié)果表明DPP在礦物成熟過程中(如系統(tǒng)有序地組裝晶體結(jié)構(gòu)中)是必不可少的。Sfeir等[29]研究發(fā)現(xiàn)在NIH3T3細(xì)胞中，DPP的表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)礦化形成礦物結(jié)節(jié)，這些結(jié)節(jié)通過X線衍射被證實(shí)為羥基磷灰石晶體。Deshpande等[2]研究表明非磷酸化的DPP不能影響膠原礦化，而磷酸化的DPP能夠?qū)е骂愃蒲例X中的高度礦化膠原纖維的形成；不同濃度的DPP及其磷酸化的程度不同會(huì)導(dǎo)致不同礦物相的形成。最新的研究表明，在松散排列的膠原纖維涂層中加入DPP可以誘導(dǎo)產(chǎn)生礦物結(jié)節(jié)，這些礦物結(jié)節(jié)是在骨發(fā)育中可以看到的；除此之外，這些礦物結(jié)節(jié)中的Ca∶P比例明顯高于正常骨組織中的[26]。DPP還是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)信號(hào)通路的共激活劑，在調(diào)節(jié)信號(hào)通路方面具有潛在作用。

綜上所述，生物礦化發(fā)展幾十年來，研究者提出了各種模型來研究和了解生物調(diào)控機(jī)制，但由于其復(fù)雜性，精確的分子機(jī)制還不是非常清楚。牙本質(zhì)磷蛋白雖然已經(jīng)被證實(shí)了在生物礦化中發(fā)揮重要的作用，但其作用機(jī)制、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)等尚不明確，因此需要在更接近口腔環(huán)境的條件下進(jìn)一步研究DPP的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制等，為開發(fā)仿生材料實(shí)現(xiàn)牙體硬組織再生奠定基礎(chǔ)。