余 偲,張寶善,李 娜,劉 巧,李愛萍,孫聿珩,毛偉文,趙 育

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,陜西西安 710119)

啤酒作為一種古老的酒精飲料,已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪凶钇毡樽钍軞g迎的飲品。據(jù)相關(guān)部門統(tǒng)計,我國啤酒年產(chǎn)量在2013年達到峰值5062萬千升,其后逐年下降;2017年,我國人均啤酒消費量為31.9升。啤酒通常被認為是一種生物穩(wěn)定性較高的飲料,因為含有一系列不利于微生物生長的抑制因子,包括啤酒花苦味酸(約為17～55 ppm),酒精(0.5%～10%,w/w),高濃度的二氧化碳(約為0.5,w/v),低pH(pH3.8～4.7),低溶氧量和極低的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。然而,一些微生物仍能在啤酒中生長繁殖,使啤酒腐敗變質(zhì)[2],這些微生物被稱為啤酒腐敗微生物或啤酒腐敗菌(beer spoilage microorganisms)。迄今為止,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的啤酒腐敗菌達50多種,主要包括:乳酸菌(lactic acid bacteria)、果膠桿菌屬(Pectinatus)、巨型球菌屬(Megasphaera)和野生酵母(wild yeast)等[3]。其中,革蘭氏陽性乳酸菌為最主要的啤酒腐敗微生物,它能夠耐受啤酒花的脅迫,導致啤酒變粘、渾濁、產(chǎn)酸,同時產(chǎn)生不愉悅的風味,影響啤酒的品質(zhì),產(chǎn)生的生物胺等有害物質(zhì)還可能威脅消費者的健康,給啤酒廠帶來巨大的經(jīng)濟損失[4];因此,必須及時檢測啤酒廠的腐敗菌,并采取相應(yīng)措施進行控制,以保證啤酒的質(zhì)量和安全。

表1 啤酒腐敗菌檢測培養(yǎng)基Table 1 Culture medium for detection of beer spoilage microorganisms

注:LAB：乳酸菌;G(-):革蘭氏陰性菌。

然而,對于這些腐敗菌,尤其是腐敗乳酸菌的檢測一直以來都是啤酒工業(yè)的一大難題,也是研究人員研究的重點。本文從方法、原理、優(yōu)缺點等多個方面闡述了近年來國內(nèi)外對啤酒腐敗菌的檢測方法,以期為啤酒生產(chǎn)過程中腐敗菌的檢測提供參考。

1 培養(yǎng)基檢測法

1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)基檢測法

傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測法是將待檢的樣品接種到固體或液體選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng),根據(jù)固體培養(yǎng)基上是否有菌落的生成或者液體培養(yǎng)基是否變渾濁,來檢測啤酒中的腐敗菌污染情況[5]。

國內(nèi)外研究人員已經(jīng)研發(fā)出了眾多選擇性培養(yǎng)基,用于啤酒腐敗菌的檢測(表1)[1，7]。盡管對于林氏乳桿菌(L.lindneri)和類丘狀乳桿菌(L.paracollinoides)這類在培養(yǎng)基上不易生長的菌株[6],Suzuki等[7]研發(fā)出了一種模擬啤酒環(huán)境的ABD(advanced beer detection)培養(yǎng)基,然而至今為止仍未發(fā)現(xiàn)適合所有啤酒腐敗菌生長培養(yǎng)基,且檢測這類菌株也耗時較長。為縮短傳統(tǒng)培養(yǎng)基法的檢測時間,Deng等[8]在MRS(de man,rogosa and sharpemedium)中添加過氧化氫酶,以提高腐敗微生物的生長速度和菌落大小,結(jié)果表明,改良后的培養(yǎng)基能夠較快速的檢測出耐酸乳桿菌(L.acetotolerans),包括一些生長緩慢的腐敗菌在5 d之內(nèi)均被檢測出來。

目前,傳統(tǒng)培養(yǎng)基法仍是啤酒廠檢測腐敗菌最主要的方法,由于具有操作簡單、準確率高、使用儀器少和前期投資成本低,不受啤酒企業(yè)規(guī)模的限制的優(yōu)點,使該檢測方法一直被廣泛沿用。但它的缺點是非常耗時,且實驗步驟繁鎖,需要花費大量的人力[5],專一性比較差。

1.2 微菌落法

由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測方法耗費大量的時間和人力,近年來,研究人員通過微菌落法來快速檢測啤酒中的腐敗菌。該法是將單細胞培養(yǎng)到微小菌落階段(未能用肉眼觀察到時),利用顯微成像技術(shù)捕捉細胞生長的一種方法[9]。Asano等[10]建立了一種結(jié)合熒光探針羧基二乙酸酯(CFDA)染色的微菌落法來檢測啤酒腐敗菌,結(jié)果表明,熒光微菌落技術(shù)檢測L.brevis需20 h、L.lindneri需62 h左右、L.paracollinoides需40 h左右,相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)基法檢測L.brevis需3 d、L.lindneri需5 d、L.paracollinoides需4～5 d,節(jié)省了大量時間;Zhao等[11]利用微菌落法對用消毒劑處理后的短乳桿菌(L.brevis)進行檢測,其檢測時間縮短至2 d,此外,結(jié)合熒光染液PI染色,可以觀察到死細胞在微菌落中的分布情況。

微菌落法能夠?qū)ζ【聘瘮【M行快速、準確的檢測,其實驗周期短、靈敏度高、特異性好[9]。結(jié)合特定的熒光染液,還可以監(jiān)測到單細胞間的差異。但相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基法它的缺點是需要配備熒光顯微鏡,使檢測成本增加。

2 生物、化學發(fā)光檢測法

2.1 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生物發(fā)光檢測法

ATP生物發(fā)光法先是由螢火蟲螢光素和ATP反應(yīng)形成螢火蟲熒光素腺苷酸和磷酸,然后螢火蟲熒光素腺苷酸和氧反應(yīng),最終形成氧化熒光素和腺苷單磷酸,同時釋放出焦磷酸(pyrophosphoric acid,PPi)的過程[12];在這一過程中氧化熒光素成為電子激發(fā)態(tài),釋放光子,發(fā)射出可見的黃綠光[13]。但該方法測定的熒光強度和菌落形成單位(colony forming unit,CFU)之間沒有直接關(guān)系,一是因為每種菌的ATP含量不同,所檢測到的熒光強度中可能還含有酵母和其他非生物的ATP,不只是一種菌中ATP的總量;二是CFU中一個菌落可能是由好幾個細胞形成的,這就使得推算出的腐敗菌數(shù)量與實際不符。此外,該方法不適用于檢測含有酵母的啤酒發(fā)酵液,也無法對微生物的種屬進行鑒定[14],但是能夠在短時間內(nèi)完成對啤酒腐敗菌的快速檢測。

ATP生物發(fā)光檢測方法的最大優(yōu)點是操作簡便、快速和測定范圍廣,能夠滿足清酒和成品啤酒中菌落總數(shù)的快速檢測。但需要樣品中的細菌濃度(檢出限)高于103CFU/mL,所以在檢測之前通常需要富集培養(yǎng);同時,該方法易受外界環(huán)境干擾,使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性,也不能鑒定微生物種類等的缺點[15]。其反應(yīng)原理如圖1[13]所示:

圖1 ATP與熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)Fig.1 Luminescence reaction of ATP and luciferase

2.2 氧化還原反應(yīng)檢測法

氧化還原反應(yīng)檢測是以多種細胞脫氫酶輔助因子NADH2的存在為基礎(chǔ),通過檢測微生物細胞中NAD/NADH和NADP/NADPH氧化還原反應(yīng)的一種化學發(fā)光法。Preissler等[16]發(fā)現(xiàn)可以通過刃天青由氧化型(藍色)變?yōu)檫€原型(粉色)來指示啤酒腐敗菌的氧化還原代謝反應(yīng),以檢測腐敗菌的存在和生長。結(jié)果顯示,使用刃天青作為脫氫酶活性的指示劑能夠在2 d內(nèi)區(qū)分腐敗菌株和非腐敗菌株。此方法檢測時間較短,操作方便且價格低廉,同時可以檢測具有難以培養(yǎng)狀態(tài)的菌株,但對所用培養(yǎng)基的pH范圍有一定要求(pH>5.5),使得檢測具有局限性[17]。

3 基于聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)的檢測法

PCR技術(shù)是一種用特異性引物通過PCR儀擴增特定DNA片段的方法。該方法在6～10 h內(nèi)便能完成對腐敗菌的測定,加上富集菌體,在2 d之內(nèi)便可完成檢測。除此之外,該方法具有檢測靈敏度高、速度快和專一性強等優(yōu)點[18]。但缺點是不能區(qū)分腐敗、非腐敗菌株[19];同時也無法區(qū)分死、活菌株,所以會導致檢測結(jié)果易出現(xiàn)較高的假陽性。但馬艷琳等[20-21]通過將疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide,EMA)或疊氮溴丙錠(propidiummonoazide,PMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合來檢測啤酒中的腐敗菌,由于EMA和PMA可以和死細胞的DNA形成共價化合物,從而使死細胞的DNA不被擴增,使檢測結(jié)果更加準確。

隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展,各種基于PCR的新技術(shù)也被應(yīng)用于啤酒腐敗菌的檢測中,如隨機擴增多態(tài)性DNA的PCR(RAPD-PCR)、實時定量PCR(real-time PCR)、多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex PCR)和反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)等。除此之外,近年來,許多學者發(fā)現(xiàn)啤酒腐敗菌中含有與菌種無關(guān)的抗啤酒花基因,這些基因通過單獨或多重組合存在,具有腐敗啤酒的能力。Zhao[19]總結(jié)了horA、horB、horC、hitA、bsrA、bsrB、arsR、cinA、fabZ等主要啤酒腐敗標記基因,日本和加拿大的研究人員通過設(shè)計特異性引物對上述一系列標記基因進行檢測,也成功檢測并鑒定出4種啤酒腐敗菌,結(jié)果顯示該方法靈敏度和準確度高且假陽性低[22-23]。Yin等[24]以horA為靶點,建立基于horA基因介導滾動圓放大的啤酒腐敗乳酸菌快速檢測方法,具有靈敏度高、專一性好、操作簡單,還能降低檢測成本的優(yōu)點。因此,這種不依賴菌種特性、基于標記基因的PCR檢測方法近年來成為快速檢測啤酒腐敗菌的主要方法之一。然而,啤酒腐敗標記基因的數(shù)量和作用一直存在分歧和爭議。有研究報道,horA、horC和hitA等并非存在于每一個腐敗菌中,且即使存在,那些菌株也未必具有在啤酒中生長的能力[25-26]。所以,基于標記基因的PCR檢測技術(shù)不能完全準確的判斷菌株是否為啤酒腐敗微生物。但隨著全基因組測序技術(shù)和比較基因組分析方法的高速發(fā)展,通過對越來越多未知啤酒腐敗菌進行全基因組測序和比對,一定會有更多的啤酒腐敗標記基因被發(fā)現(xiàn),并將用于更全面更準確的檢測啤酒腐敗菌[27,29]。

環(huán)介導的等溫擴增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)是一種新的核酸擴增技術(shù),具有高靈敏性、高特異性,靈敏性是PCR技術(shù)的10倍以上[30]。其操作簡單、快速、無需昂貴的儀器設(shè)備投資,適合現(xiàn)場快速檢測。將LAMP和實時定量PCR聯(lián)用檢測啤酒腐敗菌時,能夠在1.5 h左右鑒定出啤酒腐敗微生物中的短乳桿菌(L.brevis)、林氏乳桿菌(L.lindneri)、有害片球菌(P.damnosus)和果膠桿菌屬(Pectinatus)[31],極大提高了對擴增產(chǎn)物檢測的靈敏性和特異性。同時該技術(shù)還可以與熒光免疫、化學發(fā)光、PCR等方法聯(lián)用,能夠降低檢測結(jié)果的假陽性,具有較強的特異性、靈敏性和簡便性,在未來該方法很有可能替代PCR被用來檢測啤酒腐敗菌。但缺點是它對靶序列和引物長度有很高要求,在引物設(shè)計上難度也很大。

4 基于核酸雜交的檢測方法

4.1 熒光原位雜交(Fluorescencein situ hybridization,FISH)技術(shù)

早在20世紀90年代早期,FISH就被用作一種新的檢測和識別微生物的技術(shù),且逐漸變得越來越重要。該方法是基于堿基互補的原則[32],利用核酸分子雜交技術(shù)直接探測溶液中或固定在膜上的同源核酸序列[33]。此方法不依賴PCR分子技術(shù),是一種高度特異性的全細胞檢測技術(shù)。使用時不需要進行富集培養(yǎng),因此該方法所需檢測時間短、靈敏度高、特異性強,同時還可以檢測到VBNC狀態(tài)的菌株[34]。但是,其探針設(shè)計比較局限,也易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[35]。

Asano等[10]通過微菌落法和FISH結(jié)合的方法,不僅快速檢測到了樣品中的腐敗菌短乳桿菌(L.brevis)、林氏乳桿菌(L.lindneri)和類丘狀乳桿菌(L.paracollinoides),還降低了結(jié)果的假陰性。因FISH技術(shù)無需進行長時間富集培養(yǎng),并能在短時間內(nèi)進行定性和定量檢測,能夠滿足啤酒廠快速檢測的要求[36]。因此,基于FISH技術(shù)的試劑盒也應(yīng)運而生,如VIT?-beer kit(vermicon AG,Germany),其熒光探針可特異性結(jié)合腐敗菌的rRNA,樣品處理后只需短短3 h便可定量測定出啤酒中的腐敗乳酸菌[13],為啤酒腐敗菌提供了一種簡單、快速的檢測方法。

4.2 寡核苷酸微陣列檢測方法

寡核苷酸微陣列又稱“DNA芯片”,通過特定的儀器對雜交信號進行高效地檢測,來分析目的分子的數(shù)量及序列,從而確定檢測樣品中存在的微生物種類和數(shù)量[37]。Weber等[38]把16S～23S rRNA之間的基因間隔區(qū)(ISR)作為靶標來檢測活菌,再結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶,將ISR進行PCR擴增,通過寡核苷酸微陣列來鑒定啤酒腐敗菌。Cimaglia等[39]也表明用微陣列法可檢測啤酒中腐敗的酵母、乳酸菌、醋酸菌,并且在很低的濃度(104CFU/mL)就能檢測到,靈敏性更高。

寡核苷酸微陣列方法最突出的特點就是能夠檢測和識別復雜微生物群落的樣品中單一的細菌種類,并有高通量的特性,可一次性檢測多種樣品,獲得多種基因的差別表達圖譜,具有微型化、高效率、低消耗、高靈敏度的優(yōu)點。然而,由于分析儀器的成本高、結(jié)果分析較為復雜等問題,其使用和推廣受到一定的限制。

5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)

近年來,MALDI-TOF-MS已作為一種高通量工具用于物種水平檢測與鑒定[40]。該方法已成功的應(yīng)用于不同啤酒腐敗菌株的鑒定,不但能區(qū)分腐敗和非腐敗菌株[41],還能對其進行物種水平的鑒定,除此之外,該方法也能夠迅速檢測到啤酒中野生酵母的污染,區(qū)別發(fā)酵瓶底部和頂部的發(fā)酵菌[42]。

該方法主要是根據(jù)離子的質(zhì)量-電荷比(m/z)與離子的飛行時間成正比來分析和檢測離子,采集到相關(guān)的微生物蛋白質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜[43],再將質(zhì)譜圖中的峰型與已經(jīng)構(gòu)建好的數(shù)據(jù)庫中的參考光譜進行比較,以此對微生物進行鑒別[41,44]。由于MALDI-TOF-MS鑒定,是通過檢測核糖體蛋白圖譜來進行的,因此,它的鑒定結(jié)果更為準確和直接[45]。Kern等[41]已成功地利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對不同短乳桿菌進行鑒定;Turvey等[42]通過對比已建立的參考光譜,用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測和鑒定啤酒腐敗微生物,能夠?qū)⒓毦驼婢M行準確的檢測和識別,檢測結(jié)果具有高的精確度;Vávrová等[46]利用MALDI-TOF-MS方法對啤酒污染物直接鑒定并對腐敗菌生物膜進行分析,為檢測啤酒中的腐敗菌提供了一種可靠的方法;Wieme等[40]采用該技術(shù),從14個變質(zhì)啤酒中,收集了348種物種進行鑒定,其中327株(94%)菌種被直接鑒定出來,表明該方法具有高效性和高準確性。

將腐敗菌進行培養(yǎng)收集通過MALDI-TOF-MS,大約在15 min左右完成檢測,證明它是一種快速有效的檢測方法,同時靈敏度極高、樣品制備簡單、非常適合快速、高通量和準確識別腐敗菌等[47]。隨著標準譜圖數(shù)據(jù)庫以及分析方法的逐漸完善,該技術(shù)將成為啤酒腐敗菌快速檢測和鑒定的重要手段,總之,MALDI-TOF-MS被認為是一種很有前途的新技術(shù)。但該方法最大的缺點是需要建立完善的細菌檢測和鑒定的標準譜圖數(shù)據(jù)庫[45],檢測前需要富集培養(yǎng);由于該技術(shù)較新,儀器設(shè)備的初始投資成本和后續(xù)維護費用過高,不適合中小型啤酒廠購買和使用。

6 總結(jié)和展望

啤酒一般被認為是生物穩(wěn)定性較高的飲料,但仍有一些腐敗菌可以在啤酒中生長,直接威脅著啤酒的質(zhì)量和安全。為了減少啤酒廠的經(jīng)濟損失,檢測和清除生產(chǎn)過程中的腐敗菌尤為重要,同時,這種檢測技術(shù)需要滿足啤酒工業(yè)的切實要求,即簡單、快速、準確、靈敏度高和成本低。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)基方法耗時較長,隨著顯微成像技術(shù)和熒光染色技術(shù)的不斷發(fā)展,微菌落檢測法更快速,信息量更大。同時,分子生物學技術(shù)、生物信息學技術(shù)的不斷發(fā)展,基于PCR和基于核酸雜交檢測啤酒腐敗菌的技術(shù)的不斷出現(xiàn)和更新,使得檢測時間更短、靈敏度更高。當然,這些新技術(shù)還存在一定問題,如使用PCR前仍需要富集菌體,菌種特異性的引物不能區(qū)分腐敗菌和非腐敗菌,標記基因不能完全準確的反映菌株是否具有腐敗作用等等;核酸雜交的探針設(shè)計較為局限,檢測設(shè)備要求較高;MALDI-TOF-MS方法更適合于微生物的鑒定,而不是早期啤酒腐敗菌的檢測。但隨著全基因組測序、生物信息學等技術(shù)的高速發(fā)展,越來越多的標記基因會被發(fā)現(xiàn),探針引物的設(shè)計也會越來越科學和全面,檢測價格也會越來越低廉,檢測結(jié)果也會也來越準確。除此之外,一些新的檢測方法也在不斷的出現(xiàn),楊超等[48]根據(jù)不同腐敗菌產(chǎn)生生物胺、有機酸、風味物質(zhì)的不同,用高效液相進行色譜分析,檢測啤酒腐敗菌。因此,在當前的啤酒生產(chǎn)檢測中,需要根據(jù)實際操作條件及環(huán)境,選擇符合啤酒工廠條件的檢測方法進行啤酒腐敗菌的診斷,并及時采取相應(yīng)的消毒等衛(wèi)生措施,以保證啤酒的質(zhì)量和安全。