(廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心,廣西南寧 530021)

植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulators,PGRs)是一類天然或合成的用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的化合物[1],對農(nóng)作物起到增產(chǎn)、改善品質(zhì)、縮短生長周期、延長保鮮期的作用,廣泛用于果蔬生產(chǎn)。近年來種植戶受利益驅(qū)動(dòng)超范圍超劑量使用PGRs的事件屢有發(fā)生,如江西果農(nóng)使用氯吡脲不當(dāng)導(dǎo)致西瓜裂瓜，“毒豆芽”中添加4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤等,這些事件引起公眾和監(jiān)管部門對植物生長調(diào)節(jié)劑殘留毒性的高度關(guān)注。我國將植物生長調(diào)節(jié)劑納入農(nóng)藥進(jìn)行管理,PGRs大部分為高效、低毒、低殘留農(nóng)藥,但隨著人們對PGRs的逐步深入研究,發(fā)現(xiàn)一些殘留的植物生長調(diào)節(jié)劑通過食物鏈積累和生物放大,造成生殖障礙、性早熟[2]，引起肝損害[3],甚至致畸、致突變、致癌[4]。據(jù)農(nóng)藥信息網(wǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),我國登記使用的植物生長調(diào)節(jié)劑共51種,GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[5]中規(guī)定了24種PGRs的最大殘留限量,本文研究的15種植物生長調(diào)節(jié)劑中僅有2,4-二氯苯氧乙酸制定了果蔬中最大殘留限量并有配套檢測標(biāo)準(zhǔn),4-氟苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、赤霉素、多效唑、氯吡脲、噻苯隆、異戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸、吲哚乙酸10種農(nóng)藥規(guī)定在豆芽中不允許檢出[6],并且有補(bǔ)充檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[7]。矮壯素、丁酰肼、氯化膽堿、烯效唑4種農(nóng)藥尚未制定最大殘留限量且未指定檢測方法,缺失安全控制指標(biāo)。

植物生長調(diào)節(jié)劑一般以低濃度存在于復(fù)雜基質(zhì)中,對儀器的靈敏度要求高。用于植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的分析方法主要有氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]。色譜法作為曾經(jīng)的主流分析技術(shù),定性能力與抗干擾能力不足,無法應(yīng)對多殘留分析的挑戰(zhàn)。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其快速準(zhǔn)確、高靈敏度以及能夠同時(shí)檢測多種目標(biāo)化合物而逐漸成為農(nóng)藥多殘留分析的主流方法。低分辨質(zhì)譜如色譜-三重四級桿質(zhì)譜分辨力不足,容易受同位素離子干擾,局限于分析靶向性化合物。高分辨率質(zhì)譜技術(shù)能夠提供高分辨率、精確相對分子量、全掃描靈敏度以及高選擇性,推動(dòng)了靶向性和非靶向性化合物的篩查技術(shù)迅速發(fā)展[12],如飛行時(shí)間質(zhì)譜和靜電場軌道阱質(zhì)譜。飛行時(shí)間質(zhì)譜對電場的穩(wěn)定性要求極高,儀器的質(zhì)量準(zhǔn)確度受環(huán)境溫度影響較大[13]。特別是后者將四級桿與靜電場軌道阱相結(jié)合,提高了高分辨質(zhì)譜的定量能力[14],且操作簡單,易于維護(hù),目前廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)、復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留分析。

植物生長調(diào)節(jié)劑在植物體內(nèi)經(jīng)過代謝后殘留量低,植物中糖、色素、有機(jī)酸等基質(zhì)干擾目標(biāo)化合物的檢測,樣品需進(jìn)行提取、凈化及富集,提高方法靈敏度。目前PGRs前處理方法有固相萃取[15]、基質(zhì)固相分散萃取[16]、分子印跡固相萃取[17]、多壁碳納米管固相萃取[18]、磁固相萃取[19]和QuEChERS方法[20-21],其中經(jīng)典的QuEChERS方法采用有機(jī)溶劑提取、無水硫酸鎂和氯化鈉鹽析分層、N-丙基乙二胺(PSA)固相萃取劑凈化水果、蔬菜樣品。多壁碳納米管(MWCNTs)為新型納米固相萃取材料[22],因其獨(dú)特的中空結(jié)構(gòu)和大比表面積而具有卓越的吸附能力[23],本實(shí)驗(yàn)以MWCNTs替代PSA吸附水果和蔬菜基質(zhì)中的干擾物質(zhì)。

本文以韭菜、番茄、豆芽、葡萄、柑橘為樣品基質(zhì),采用改良的QuEChERS方法提取凈化樣品,結(jié)合超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術(shù)建立15種植物生長調(diào)節(jié)劑的測定方法,并對市售100批水果蔬菜中PGRs進(jìn)行快速篩查,以期為果蔬中植物生長調(diào)節(jié)劑風(fēng)險(xiǎn)篩查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、甲酸 色譜純,德國默克公司;無水硫酸鎂、乙酸、甲酸銨 分析純,北京化工廠;N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB) 天津博納艾杰爾科技有限公司;多壁碳納米管(MWCNTs、長度10～30 μm,外徑10～20 nm,內(nèi)徑5～10 nm,純度>95%,比表面積>200 m2/g) 南京先豐納米材料科技有限公司;QuEChERS提取鹽包(含6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水乙酸鈉) 美國waters公司;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、矮壯素、赤霉素、丁酰肼、多效唑、氯吡脲、氯化膽堿、噻苯隆、烯效唑、異戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸、吲哚乙酸 ,純度均大于99%,德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司;樣品共100批,韭菜、番茄、芹菜、黃瓜、葡萄、柑橘各10批,豆芽40批 采集于廣西各地農(nóng)貿(mào)市場與超市、水果蔬菜種植基地;將樣品切碎后用組織粉碎機(jī)充分粉碎混勻,別裝入潔凈容器中,密封并標(biāo)記,于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Ultimate 3000超高效液相色譜儀 美國Dionex公司;串聯(lián)Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀 配備加熱電噴霧離子源(HESI-Ⅱ源),美國Thermo Fisher Scientific公司;X3R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司;XS205 DU電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Vortex 3渦旋振蕩器 德國IKA公司;Multi Reax全自動(dòng)振蕩儀 德國Heidolph;Multivap氮吹儀 美國Organomation公司;Milli-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取與凈化 稱取10 g(精確至0.01 g)經(jīng)粉碎混勻的樣品,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入1%乙酸乙腈溶液10 mL,渦旋1 min,加入提取鹽包,劇烈振蕩2 min后4 ℃ 5000 r/min離心5 min,吸取1.5 mL上清液至內(nèi)含10 mg MWCNTs及200 mg硫酸鎂的15 mL離心管中,渦旋混勻2 min,4 ℃ 10000 r/min離心5 min,精密吸取1 mL上清液于10 mL離心管中,40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两?加乙腈定容至1 mL,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾,取續(xù)濾液,測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取15種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別精密量取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL,置于同一100 mL量瓶中,用乙腈稀釋并定容至刻度,得到10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液各1 mL,分別置于10、100 mL量瓶中,用乙腈稀釋并定容至刻度,分別得到1、100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取韭菜、番茄、芹菜、黃瓜、葡萄、柑橘、豆芽空白樣品(陰性樣品),每份10.00 g,與1.2.1同法操作,得到空白基質(zhì)溶液。分別取0.02、0.05 mL(濃度為100 μg/L)、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mL(濃度為1 μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至1 mL量瓶中,用空白基質(zhì)溶液稀釋成2.0、5.0、10. 0、20. 0、50.0、100. 0、500.0 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 色譜條件 Hypersil GOLD aq C18柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;流速:0.5 mL/min;流動(dòng)相:A為含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min,5% B;0.5～10 min,5%～95% B;10.0～12.0 min,95% B;12.0～15.0 min,5% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件 UPLC-Q-orbitrap液質(zhì)聯(lián)用儀配加熱的電噴霧電離(HESI-Ⅱ);鞘氣流速為45 arb;毛細(xì)管溫度為 320 ℃;噴霧電壓正離子為3.1 kV、負(fù)離子為2.75 kV;采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描(Full MS/dd-MS2);正、負(fù)離子模式;一級掃描參數(shù):掃描范圍為50～500 u,分辨率為70000,最大注入時(shí)間為 100 ms,控制目標(biāo)離子數(shù)為3×106;二級掃描參數(shù):分辨率為17500,二級為5×105,最大注入時(shí)間一級為50 ms,控制目標(biāo)離子數(shù)為5×105;歸一化碰撞能量為20%、40%、60%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對15種化合物進(jìn)樣測定獲得其精確質(zhì)量數(shù)、同位素、保留時(shí)間、二級碎片,通過Trace Finder數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)建立15種化合物的數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相是影響色譜分離一個(gè)重要因素,液相色譜柱中化合物的保留不僅受到流動(dòng)相的影響,還受到改性劑的影響。基于乙腈離子化能力強(qiáng)于甲醇,且基線噪音較低,故首選乙腈作為有機(jī)相。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察純水和0.1%甲酸、5 mmol/L甲酸銨、0.1%甲酸5 mmol/L甲酸銨溶液三種流動(dòng)相改性劑對目標(biāo)化合物的分離效果、峰形和響應(yīng)強(qiáng)度的影響(圖1),發(fā)現(xiàn)在純水系統(tǒng)中,4-氯苯氧乙酸、矮壯素、吲哚丁酸、吲哚乙酸峰形和分離效果差,赤霉素峰分裂。在0.1%甲酸溶液中,抑制了[M-H]-離子,2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素響應(yīng)低。在5 mmol/L甲酸銨溶液中,抑制了[M+H]+離子,矮壯素、丁酰肼、多效唑、吲哚丁酸、吲哚乙酸響應(yīng)強(qiáng)度低。在5 mmol/L甲酸銨溶液中添加0.1%甲酸,提高電離效率,穩(wěn)定離子,矮壯素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素峰形得到改善,4-氯苯氧乙酸、多效唑形成尖銳的峰形。綜上,選擇乙腈和含0.1%甲酸5 mmol/L甲酸銨作為流動(dòng)相。15種PGRs(濃度為100.0 μg/L)提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 15種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracting ion chromatograms of 15 plant growth regulators注:A為正離子模式;B為負(fù)離子模式。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取100.0 μg/L的15種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜,采用Full MS/dd-MS2 模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,Full MS定量,dd-MS2定性,分析15種農(nóng)藥的分子離子峰[M+H]+和[M-H]-精確質(zhì)量數(shù)。根據(jù)歐盟委員會(huì)衛(wèi)生和食品安全總局(2017)的SANTE文件的指導(dǎo)原則,高分辨質(zhì)譜確證識(shí)別點(diǎn)至少為4[24],本實(shí)驗(yàn)每種化合物選擇一個(gè)母離子和一個(gè)子離子,識(shí)別點(diǎn)為4.5,滿足檢測要求。首先在50～500 u掃描范圍內(nèi)獲得全掃描數(shù)據(jù),將獲取母離子質(zhì)量數(shù)列入包含列表(inclusion list)中,縮小掃描范圍,使目標(biāo)化合物得到盡可能多的數(shù)據(jù)點(diǎn),避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。當(dāng)全掃描監(jiān)測到列表里的母離子且信號(hào)超過設(shè)定值,母離子以20%、40%和60%的階梯式碰撞能量進(jìn)行二級碎裂,從而獲取碎片離子信息。分辨率和質(zhì)量數(shù)偏差是高分辨質(zhì)譜兩個(gè)重要參數(shù),分辨率高、質(zhì)量數(shù)偏差小,選擇性高,易造成假陰性結(jié)果;分辨率低、質(zhì)量數(shù)偏差大,易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,因此15種化合物的一級、二級分辨率分別設(shè)置為70000、17500,表1列出了15種化合物分子式、保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)偏差等參數(shù)。

表1 15種植物生長調(diào)節(jié)劑的分子式、保留時(shí)間和母離子Table 1 Molecular formula,retention time,precursor ions of 15 plant growth regulators

2.3 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)首先對提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化,基于所分析的目標(biāo)化合物均為極性物質(zhì),選擇韭菜樣品,分別考察甲醇、乙腈和含1%乙酸乙腈溶液提取效果,甲醇提取時(shí),發(fā)現(xiàn)大部分化合物回收率高于130%,應(yīng)該是甲醇共提物中極性雜質(zhì)成分較多引起基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)所致;比較乙腈與含1%乙酸乙腈溶液回收率,后者普遍高于前者,特別是含羧酸化合物回收率都在75%～109%,說明乙腈中加入一定量的酸,形成穩(wěn)定的緩沖體系,利于酸性化合物的離子化,因此選擇1%乙酸乙腈作為最佳提取溶劑。

2.4 吸附劑的選擇

果蔬中基質(zhì)干擾多為脂類、色素、糖、有機(jī)酸等,本實(shí)驗(yàn)考察N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、多壁碳納米管(MWCNTs)3種吸附劑的凈化效果。PSA去除有機(jī)酸、糖類、脂肪酸,GCB去除色素和甾醇,MWCNTs去除色素能力強(qiáng)[25]。選擇韭菜(富含硫化物和葉綠素)為基質(zhì),考察色素去除效果和回收率,取1.5 mL提取液分別單獨(dú)加入100、200 mg PSA和5、10、15、20 mg GCB、MWCNTs,色素去除效果MWCNTs>GCB>PSA,結(jié)果見圖2,隨著MWCNTs用量的增加,提取液基本接近無色,說明MWCNTs對色素有較強(qiáng)的吸附作用。采用200 mg PSA,2,4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、4-氟苯氧乙酸等酸性化合物和矮壯素、丁酰肼等強(qiáng)極性化合物回收率普遍低于60%,與PSA為極性吸附劑和對酸性化合物有吸附作用有關(guān)。GCB使用量為20 mg時(shí),4-氟苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸等具有平面結(jié)構(gòu)化合物回收率均低于35%～70%,這是由于GCB具有正六元環(huán)結(jié)構(gòu),易吸附平面結(jié)構(gòu)化合物[26]。MWCNTs加入量為20 mg時(shí),平面結(jié)構(gòu)化合物回收率在57%～89%,說明MWCNTs具有中空結(jié)構(gòu)對平面化合物吸附較弱,當(dāng)MWCNTs添加量為10 mg時(shí),化合物回收率在71%～109%,滿足檢測要求,綜合考慮只采用10 mg MWCNT作為吸附劑。

圖2 韭菜經(jīng)不同種類吸附劑凈化后提取液的照片F(xiàn)ig.2 Photography of cleanup performance of extract for leek with different sorbents注:A～B：200、100 mg PSA；C～F：5、10、 15、20 mg GCB；G～J:5、10、15、20 mg MWCNTs。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect,簡稱ME)普遍存在痕量分析的物質(zhì)中,影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[27],根據(jù)基質(zhì)成分對目標(biāo)化合物響應(yīng)強(qiáng)度的不同影響,基質(zhì)效應(yīng)分為基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)采用韭菜、豆芽空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與乙腈為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的比值評價(jià)ME,當(dāng)ME介于0.9～1.1時(shí),基質(zhì)干擾程度較低;當(dāng)ME<0.9或>1.1時(shí),為基質(zhì)抑制或增強(qiáng)。表2結(jié)果表明大部分化合物存在基質(zhì)效應(yīng),因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線定量,以消除基質(zhì)對檢測結(jié)果造成的誤差。

2.6 線性范圍和定量限

以基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣測定,用外標(biāo)法定量,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/L),15種目標(biāo)化合物在2.0～500.0 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r均大于0.990,見表2?；诟叻直尜|(zhì)譜的色譜圖中通常不存在背景噪音,檢出限(LOD)和定量限(LOQ)的計(jì)算不宜采用信噪比的方法,將回收率在70%～120%范圍內(nèi)且RSD<20%的最低加標(biāo)水平定為方法的定量限[11,24],15種目標(biāo)化合物中吲哚乙酸、赤霉素LOQ為20.0 μg/kg,其余13種化合物L(fēng)OQ均為10.0 μg/kg。

2.7 回收率與精密度

以韭菜、豆芽為基質(zhì),取10.00 g樣品,置于50 mL聚丙烯具塞離心管中,分別添加0.01、0.05、0.1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL),加入1%乙酸乙腈溶液至10 mL,其余按1.2.1方法操作,進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)添加水平測定6次,平均回收率為69.8%～107.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～9.9%,結(jié)果見表3。

2.8 實(shí)際樣品的測定

采用本方法對韭菜、番茄、芹菜、黃瓜、葡萄、柑橘、豆芽共100批樣品測定15種植物生長調(diào)節(jié)劑,結(jié)果16批豆芽檢出4-氯苯氧乙酸鈉,含量在0.032～0.24 mg/kg,根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告(2015年第11號(hào))[6],豆芽不允許檢出6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、赤霉素等物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)同時(shí)按照SN/T 3725-2013 《出口食品中對氯苯氧乙酸殘留量的測定》標(biāo)準(zhǔn)方法測定,本方法與其他方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.8%,說明本方法準(zhǔn)確可靠。

表2 15種植物生長調(diào)節(jié)劑基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、相關(guān)系數(shù)Table 2 Matrix effect,linear ranges,correlation coefficients(r)of the 15 plant growth regulators

表3 15種植物生長調(diào)節(jié)劑的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recovery rates and RSD of the 15 plant growth regulators(n=6)

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究建立了以1%乙酸乙腈為提取劑、多壁碳納米管為吸附劑的改良QuEChERS方法,結(jié)合超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法對100批韭菜、番茄、芹菜、黃瓜、葡萄、柑橘、豆芽中的15種PGRs殘留量進(jìn)行測定,其中16批豆芽檢出4-氯苯氧乙酸鈉,且殘留量超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,表明果蔬中植物生長調(diào)節(jié)劑存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。該方法簡便快速、靈敏度高,能夠滿足果蔬中的植物生長調(diào)節(jié)劑日常檢測和風(fēng)險(xiǎn)篩查要求。