劉航，李顯，張林，王光輝，丁杰

(1.貴州省人民醫(yī)院 a.胃腸外科，b.乳腺外科，貴陽 550002； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義563003)

結(jié)直腸癌已成為世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤。有數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第三位，在女性中居第二位，且近年來發(fā)病率逐漸呈年輕化趨勢[1]。在臨床就診的患者中，晚期結(jié)直腸癌患者數(shù)量眾多且常伴轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳，5年生存率不足10%[2]。因此，癌癥的早期診斷對提高患者生存率具有重要意義。近年來，多種新型診療手段(如液體活檢、基因測序、免疫治療)不斷出現(xiàn)，可能有效改善患者預(yù)后的診療方式。液體活檢技術(shù)是近年來腫瘤診斷領(lǐng)域的一大突破性技術(shù)，通過捕獲和分析外泌體、核酸、蛋白質(zhì)及細(xì)胞等腫瘤衍生物質(zhì)來解讀癌細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。液體活檢技術(shù)包括了3種體外診斷技術(shù)，即血液的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA和外泌體的檢測，其中探究外泌體包含物中的微RNA(microRNA，miRNA)作為腫瘤診斷標(biāo)志物是一項(xiàng)關(guān)鍵性研究。而針對外泌體的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體由供體細(xì)胞分離后可參與細(xì)胞的多種生理或病理過程[3]。腫瘤來源的外泌體包含的miRNA，較循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量更多、更易富集，且穩(wěn)定性更高，包含信息量更大，甚至具有用于治療的潛能，是目前研究的熱點(diǎn)[4]。現(xiàn)就外泌體miRNA與結(jié)直腸癌診斷的最新研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體概述

外泌體最初被認(rèn)為是網(wǎng)織紅細(xì)胞在分化過程中多囊核內(nèi)體或多囊小體與細(xì)胞膜融合后形成的囊性小泡，屬于細(xì)胞外囊泡的一種，其大小目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[5]。外泌體廣泛存在于外周血、唾液甚至尿液中，但豐度卻不同[6-7]。細(xì)胞囊泡運(yùn)輸機(jī)制被發(fā)現(xiàn)后，外泌體成為細(xì)胞間信號分子的重要載體之一，在腫瘤精準(zhǔn)治療中蘊(yùn)藏著巨大潛能，而基于下一代基因組測序的分子分析方法應(yīng)用于外泌體囊泡內(nèi)容物的檢測，可更加全面、多參數(shù)綜合分析其內(nèi)容物中核酸分子變異等信息，提升對腫瘤形成、發(fā)展過程的認(rèn)知，這是實(shí)現(xiàn)對腫瘤早期診斷、精準(zhǔn)用藥及預(yù)后分析的先決條件[8-9]。

1.1外泌體內(nèi)容物及miRNA 目前，外泌體的內(nèi)容物成分分析主要通過高通量技術(shù)進(jìn)行，其測序數(shù)據(jù)被收錄于exoRBase、EVpedia、Vesiclepedia以及ExoCarta等生物信息數(shù)據(jù)庫中。外泌體外周由雙分子脂質(zhì)膜包裹，內(nèi)部包含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、短肽鏈、信使RNA、miRNA、長鏈非編碼RNA等，這些成分與其來源的細(xì)胞和自身狀態(tài)密切相關(guān)[10]。在這些功能性分子中，蛋白質(zhì)所占比例最高，可大致分為兩類：①外泌體通用的涉及膜轉(zhuǎn)運(yùn)、融合及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的相關(guān)蛋白(如GTPases蛋白、膜聯(lián)蛋白、脂筏標(biāo)記蛋白等)、分子伴侶熱激蛋白70、熱激蛋白90和組織相容性體Ⅱ類抗原呈遞分子，甚至是胞內(nèi)信號通路蛋白(如Wnt通路相關(guān)蛋白)等[11]；②具有特殊細(xì)胞來源的蛋白，如腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中存在的轉(zhuǎn)化生長因子-β、凋亡相關(guān)因子配體等[12]。此外，核酸成分也是內(nèi)容物之一，如環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌患者血清中被發(fā)現(xiàn)，且表達(dá)豐度上調(diào)[13]，一部分miRNA已被證實(shí)在腫瘤患者中存在差異表達(dá)[6]，可能成為潛在的診斷標(biāo)志物。

miRNA是一種含有22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，主要靶向調(diào)控信使RNA的轉(zhuǎn)錄后沉默。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過50%的蛋白質(zhì)編碼基因受哺乳動物基因組中的miRNA調(diào)節(jié)，幾乎涉及所有生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫微環(huán)境以及細(xì)胞周期調(diào)控等[14-16]。非編碼RNA在體內(nèi)受到精準(zhǔn)的調(diào)控，通常在發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)后核酸分子即被降解，但miRNA可穩(wěn)定存在于外泌體中并被轉(zhuǎn)運(yùn)至全身各處發(fā)揮生物學(xué)作用，其未被降解的原因可能由于部分miRNA與蛋白形成了復(fù)合物[17]。

1.2外泌體及miRNA的作用機(jī)制 外泌體廣泛存在于體液循環(huán)中，通過旁分泌或內(nèi)分泌將功能性分子運(yùn)送至全身各處的受體細(xì)胞，參與機(jī)體生理病理過程。早在1996年就有研究者發(fā)現(xiàn)，EB病毒轉(zhuǎn)化后的B淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生具有免疫促進(jìn)作用的外泌體[18]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞來源的外泌體質(zhì)膜上表達(dá)熱激蛋白70，可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，包括誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子和腫瘤壞死因子[19-21]。此外，含組織相容性體Ⅱ類分子的外泌體可刺激成熟的樹突狀細(xì)胞的免疫活性[22]。然而，Wen等[23]發(fā)現(xiàn)，乳腺腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可直接抑制T淋巴細(xì)胞增殖和自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程需要外泌體參與建立一個(gè)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，使靶點(diǎn)細(xì)胞緩解變?yōu)橐子谀[瘤發(fā)生的環(huán)境，并最終導(dǎo)致免疫逃逸，值得注意的是，外泌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移過程在轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞膜上均存在特異性的靶點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)為以外泌體為載體的靶向治療提供了新思路。除影響機(jī)體免疫系統(tǒng)外，腫瘤來源的外泌體還可通過內(nèi)分泌、旁分泌甚至自分泌方式轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)分子，并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的基因表達(dá)，在腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥中起關(guān)鍵作用[24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-375可能靶向磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路或靶向凋亡抑制因子5等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[25]。Zaharie等[26]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶的miR-375可介導(dǎo)酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2和轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達(dá)，抑制腫瘤侵襲。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是在腫瘤進(jìn)展中起主導(dǎo)作用的關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞。Bhome等[27]在結(jié)腸癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)了miR-21的表達(dá)缺失，但卻在外泌體中富集，通過建立過表達(dá)miR-21的成纖維細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞的原位移植瘤模型，導(dǎo)致結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移增加，而外泌體即基質(zhì)成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間miR-21的載體。

2 外泌體miRNA與結(jié)直腸癌的診斷

目前，結(jié)直腸癌診斷主要依靠肛門指診、影像學(xué)、結(jié)腸鏡及鏡下活檢后病理診斷確診，而通常獲取樣本需要侵入性手段，因此常受到各種因素的限制，且無法對腫瘤進(jìn)展進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。同時(shí)，結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)多已為晚期?？梢?，結(jié)直腸癌的早期特征診斷技術(shù)亟待提高。無創(chuàng)的液體活檢技術(shù)可在多個(gè)時(shí)間段重復(fù)取樣，其中針對外泌體miRNA的分析技術(shù)具有巨大的潛力[28]。

2.1外泌體miRNA表達(dá)譜在腫瘤發(fā)展不同時(shí)期的表達(dá)差異 在早期的研究中，科學(xué)家對多個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行miRNA系統(tǒng)的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與信使RNA相比，miRNA可更加精準(zhǔn)反映腫瘤的發(fā)育譜系和分化狀態(tài)，且miRNA表達(dá)譜可區(qū)分一部分腫瘤在病理學(xué)上難以定義的分化類型[29]。由于miRNA可攜帶重要的遺傳學(xué)信息，因此針對結(jié)腸腫瘤細(xì)胞所分泌的外泌體與正常細(xì)胞分泌的外泌體之間存在的異質(zhì)性，分析結(jié)直腸癌患者血清中外泌體的miRNA有助于診斷結(jié)直腸癌。Ogata-Kawata等[4]利用微陣列分析試驗(yàn)組(88例結(jié)腸癌患者)和對照組(11例正常人)患者血清中外泌體miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種miRNA(let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a)在腫瘤發(fā)生的早期表達(dá)顯著上調(diào)，這一結(jié)果在結(jié)腸癌細(xì)胞株中同樣得到了驗(yàn)證?；诖税l(fā)現(xiàn)，有研究者指出，miR-125a-3p、miR-4772-3p亦可作為早期結(jié)直腸癌診斷的標(biāo)志物之一[30-31]。此外，Zhao等[32]對miRNA檢測方式進(jìn)行了改良，與直接從血清中提取miRNA相比，先從血清中分離外泌體，再從外泌體中提取miRNA的方式可以提高miRNA的穩(wěn)定性和完整性；進(jìn)一步結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)，miR-21水平在結(jié)直腸癌首次診療前已顯著升高，因此miR-21被認(rèn)為是結(jié)直腸癌早期診斷中最具潛力的分子標(biāo)志物之一。但miR-21的差異表達(dá)似乎并不具有特異性，在肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤甚至炎癥反應(yīng)中均可發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)水平升高，這也是許多其他外泌體miRNA標(biāo)志物在臨床檢測應(yīng)用中遭遇的瓶頸[33-36]。

不僅存在于腫瘤發(fā)生的早期，外泌體存在于整個(gè)腫瘤生長、侵襲的過程[37]。Matsumura等[38]利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測124例結(jié)直腸癌患者的血清樣本發(fā)現(xiàn)，外泌體中miR-17-92a的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)有密切關(guān)系；同時(shí)，該樣本中TNM分期越晚的結(jié)直腸癌患者miR-19a表達(dá)的豐度越高，提示更差的預(yù)后，表明miR-19a可作為患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測因子。這一發(fā)現(xiàn)對結(jié)直腸癌的診斷、評估預(yù)后意義重大。在進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者中，下調(diào)穹隆體主蛋白相關(guān)基因后，miR-193a在血清外泌體中富集，且濃度與結(jié)直腸癌進(jìn)展程度呈正相關(guān)；另外，miR-193a還可靶向Caprin1蛋白，誘導(dǎo)Ccnd2和c-Myc表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞在G1期增殖抑制[39]。除miR-193a外，miR-217也是臨床Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌潛在的診斷、預(yù)后生物學(xué)靶點(diǎn)。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌的常見轉(zhuǎn)移途徑，也是影響患者生存率的重要因素之一，及時(shí)評估是否存在肝轉(zhuǎn)移對于指導(dǎo)結(jié)直腸癌診治方案具有重大意義。研究顯示，血清外泌體中miR-638、miR-29均可提示肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和更差的預(yù)后[40-42]。

針對外泌體miRNA的研究已深入到多種腫瘤中，而腫瘤細(xì)胞外泌體miRNA的表達(dá)豐度有顯著差異。利用這一特點(diǎn)，在早期診斷較為困難的結(jié)直腸患者中，外泌體miRNA作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值仍有巨大發(fā)掘空間。雖然目前多種商用檢測試劑盒已經(jīng)在推廣測試中，但尚未有權(quán)威機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的、基于外泌體miRNA對于結(jié)直腸癌臨床診斷、治療或預(yù)后的臨床試驗(yàn)，其檢測方式也仍未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

2.2外泌體miRNA豐度與腫瘤相關(guān)基因突變的關(guān)系 結(jié)直腸癌進(jìn)展是一個(gè)多基因、多因素的過程。p53基因突變參與了人類大多數(shù)癌癥的發(fā)病機(jī)制，功能獲得性的p53蛋白主要通過與其他細(xì)胞信號蛋白的相互作用干擾細(xì)胞代謝，并誘發(fā)腫瘤脅迫的微環(huán)境[43]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是實(shí)體瘤的標(biāo)志之一，并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[44]。在結(jié)直腸癌中，攜帶p53基因突變的腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間的“溝通橋梁”正是由癌細(xì)胞選擇性釋放的富含miR-1246的外泌體，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)為腫瘤支持和抗炎狀態(tài)，并在腫瘤微環(huán)境中增加轉(zhuǎn)化生長因子-β的活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[45]。

結(jié)直腸癌患者中有30%～40%存在KRAS(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突變[46]。與正常及腺瘤組織相比，腫瘤患者中KRAS基因突變率更高，因此KRAS基因突變被認(rèn)為是腫瘤早期形成的誘導(dǎo)因素之一，同時(shí)KRAS基因突變也是預(yù)后不佳的指標(biāo)[47]。雖然人們已經(jīng)較為深入地研究了KRAS基因突變對于結(jié)直腸癌細(xì)胞行為的影響，但其非細(xì)胞自主作用目前尚不明確。Demory Beckler等[48]的早期報(bào)道顯示，與KRAS野生型純化的外泌體相比，由表達(dá)KRAS突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞中分離的外泌體含有更多的促腫瘤蛋白(KRAS、表皮生長因子受體、Src家族激酶和整聯(lián)蛋白等)，可促進(jìn)受體細(xì)胞的生長和侵襲性。有報(bào)道指出，胞內(nèi)KRAS蛋白豐度受miR-146a調(diào)控，且miR-146a是結(jié)直腸癌干細(xì)胞外泌體miRNA的主要成分，其分泌過程受β聯(lián)蛋白/T細(xì)胞因子-4活化的RAB27B表達(dá)調(diào)控；同時(shí)，患者血清中檢測到高豐度的外泌體miR-146a，且誘導(dǎo)腫瘤過濾性CD66+的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，而腫瘤浸潤性CD8+的T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，間接促進(jìn)了抑制性免疫微環(huán)境的形成[49]。

精準(zhǔn)醫(yī)療是腫瘤治療未來的發(fā)展趨勢，這一治療理念是基于對基因?qū)用娴纳钊敕治龊髮颊哌M(jìn)行個(gè)性化的精準(zhǔn)治療。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與多種基因序列的改變密切相關(guān)，在多種新型治療策略(如免疫治療)中具有高突變負(fù)荷的亞型患者獲益更多[50-51]。外泌體miRNA在一定程度上可反映特定的基因突變現(xiàn)象，且可在非侵入性操作下盡早獲得靶點(diǎn)基因相關(guān)的miRNA豐度水平，通過推測可能出現(xiàn)的基因型改變，使結(jié)直腸癌患者在早期診療中獲益。

2.3外泌體miRNA與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 有研究證實(shí)，賴氨酸特異性去甲基酶1、上皮鈣黏素等異常表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[52]。進(jìn)一步研究證實(shí)，賴氨酸特異性去甲基酶1是EMT過程的重要環(huán)節(jié)，而EMT的逆轉(zhuǎn)過程中，間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[53]。EMT和間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞間交互作用廣泛，外泌體的參與也是其中重要的一環(huán)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的HCT-8結(jié)腸癌細(xì)胞株，其轉(zhuǎn)移細(xì)胞對氟尿嘧啶等化療敏感性降低，使用電子顯微鏡觀察可見HCT-8細(xì)胞可分泌外泌體且被轉(zhuǎn)移細(xì)胞攝?。慌c細(xì)胞內(nèi)水平相比，外泌體中miR-210豐度顯著上調(diào)，因此miR-210可能是EMT的始動因子，并引導(dǎo)轉(zhuǎn)移細(xì)胞至新的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)[54]。另有研究指出，miR-210可通過靶向液泡膜蛋白1在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，是提示腫瘤預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[55]。

在胃腸道腫瘤中，有關(guān)外泌體miRNA與EMT的相關(guān)研究尚不多見，結(jié)直腸癌腫瘤患者中外泌體miRNA直接參與EMT相關(guān)過程的研究報(bào)道較少。但有研究表明，外泌體參與EMT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，導(dǎo)致腹膜擴(kuò)散而預(yù)后不良；進(jìn)一步對化療后的患者腹水樣本進(jìn)行高通量測序，鑒定出29個(gè)外泌體miRNA與治療前有差異表達(dá)，在治療中可用于抑制腹膜轉(zhuǎn)移[56]。此外，在肺癌[57]、前列腺癌[58]、早期肝癌[59]中的研究已有外泌體miRNA診斷價(jià)值的報(bào)道，可能為結(jié)直腸癌的研究提供思路。

3 小 結(jié)

傳統(tǒng)的診斷方式很難使結(jié)直腸癌的早期診斷率實(shí)現(xiàn)質(zhì)的提升，但液體活檢技術(shù)解決了這一不足。目前，已有多個(gè)miRNA作為結(jié)直腸癌的早期診斷標(biāo)志物展現(xiàn)出了巨大潛力，且對監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等生物學(xué)行為亦有益，可幫助臨床工作者更加全面了解患者腫瘤進(jìn)展，并制訂更加精準(zhǔn)的個(gè)體化治療方案。然而，針對來源復(fù)雜的外泌體內(nèi)容物檢測方法尚存在爭議，對于檢測的靈敏度與準(zhǔn)確度、檢測方法、成本高昂等問題尚未有明確的優(yōu)化方案，外泌體miRNA檢測在臨床中的大規(guī)模推廣應(yīng)用仍受到限制[60]。但在臨床采用外泌體miRNA作為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物仍具有巨大潛力。