李登紅，陸建偉，梁健嘉，王洪濤

1 巴迪泰（廣西）生物科技有限公司 （廣西南寧 530031）；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 （廣西南寧 530022）

生長刺激表達基因2蛋白（growth stimulation expressed gene 2，ST2）是于1989年由Tominaga[1]發(fā)現(xiàn)的，但直到2002年Weinberg等[2]報道其可以由心肌細胞在心肌應(yīng)激時表達，才引起人們對其心血管作用的興趣。ST2是白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）受體超家族的成員之一，包括4種亞型，即可溶性ST2（soluble ST2，sST2）、跨膜型ST2（growth stimulation expressed gene 2L，ST2L）、多變型ST2（growth stimulation expressed gene 2V，ST2V）及跨膜多變型ST2（growth stimulation expressed gene 2LV，ST2LV）。其中sST2、ST2L是心力衰竭的重要研究對象。2005年，Schmitz等證實白介素-33（IL-33）為ST2的功能性配體，IL-33/ST2L能夠抗心肌纖維化，從而起到保護心臟的作用[3]。當心肌受到損傷時，sST2會在心肌細胞大量產(chǎn)生并作為“誘餌”受體與IL-33競爭性結(jié)合，導(dǎo)致IL-33/ST2L信號通路被切斷，繼而造成心肌纖維化，加速心肌重構(gòu)等癥狀[4-6]。因此，選擇一種快速、準確地檢測sST2的方法對于心力衰竭患者的診斷、預(yù)后評估意義重大。

目前，臨床檢測sST2的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，國外出現(xiàn)了分子印跡納米粒子多重傳感器分析技術(shù)、雙色上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光側(cè)流分析技術(shù)及熒光免疫層析法等，而國內(nèi)的熒光免疫方法發(fā)展迅速，出現(xiàn)了時間分辨熒光免疫分析法、循環(huán)增強熒光免疫法等檢測方法。目前，國內(nèi)外未見有關(guān)于sST2檢驗方法的綜述，希望通過本研究的闡述，為sST2相關(guān)研究者提供一些思路。

1 檢測方法

1.1 ELISA 法

ELISA法以免疫酶技術(shù)為基礎(chǔ)，目前在臨床檢測上應(yīng)用廣泛，技術(shù)成熟[7]。雖然該技術(shù)在檢測時間、操作等方面存在弊端，但其在靈敏度、特異度、酶標記物穩(wěn)定性、試劑價格等方面占有優(yōu)勢。ELISA法的分析物可在室溫下保持48 h穩(wěn)定，在4 ℃下穩(wěn)定7 d，在-20 ℃和-80 ℃下穩(wěn)定至少2個月[8]。這種方法符合實驗室醫(yī)學(xué)質(zhì)量規(guī)范的要求，因此也被美國食品和藥物管理局推薦用于臨床評估急性、慢性心力衰竭患者的預(yù)后。目前，臨床上使用的sST2試劑盒主要由美國4家公司生產(chǎn)，其中Critical Diagnostics公司（以下簡稱：CD公司）的Presage ST2試劑盒使用最廣泛[9-10]。彭劍橋[11]對CD公司的Presage ST2試劑盒進行性能驗證研究，發(fā)現(xiàn)sST2檢測試劑盒批內(nèi)精密度變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）%分別為4.8%和2.8%，批間精密度CV%分別為5.9%和6.7%，線性范圍為0.000～206.622 ng/ml，說明Presage ST2 檢測試劑盒的性能符合臨床檢測的需求。戴謙等[12]使用CD公司的Presage ST2試劑盒測試上百例正常人血清中sST2 含量，分別確立了中國華東地區(qū)男性和女性的sST2參考區(qū)間（男性10.2～41.0 μg/L，女性8.9～28.1 μg/L），且該研究發(fā)現(xiàn)健康人群的sST2不受年齡、腎小球濾過率、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）等指標的影響[13]。

1.2 熒光免疫層析法

熒光免疫層析法采用免疫熒光快速定量檢測技術(shù)結(jié)合干化學(xué)層析方法，利用樣本中的sST2抗原與試紙條上或緩沖液中熒光標記的sST2抗體結(jié)合形成抗原-抗體結(jié)合物，混合樣本流經(jīng)或加入試紙條時，該結(jié)合物被試紙條上的另一個sST2抗體捕捉，形成抗體-抗原-抗體夾心結(jié)合物[14]。因此，樣本中的sST2抗原越多，試紙條上的抗體-抗原-抗體夾心結(jié)合物堆積得也越多。熒光信號的強度反饋被捕捉的sST2抗原數(shù)量，通過配套的免疫熒光分析儀的判斷，能夠定量檢測出樣本中sST2抗原的濃度。Dieplinger 等[15]對CD公司的ASPECT-PLUS ST2 Test 試劑盒進行性能驗證研究并與MBL和PRESAGE ST2 ELISA進行了分析和臨床分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低濃度（20.8 ng/ml）時批內(nèi)CV%為16.8%，總CV%為17.0%；中間濃度（65.6 ng/ml）時批內(nèi)CV%為10.1%，總CV%為10.2 %；高濃度（131.8 ng/ml）時，批內(nèi)CV%為9.6%，總CV%為10.0%；在23.6～229.6 ng/ml 范圍內(nèi)，線性良好，說明ASPECT-PLUSTM ST2 Test 試劑盒的精密度、線性范圍均符合臨床檢測要求；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)MBL ST2檢測、PRESAGE ST2檢測和ASPECT-PLUS ST2 Test 檢測之間分別存在常數(shù)和比例偏差，但是，在建議的35 ng/ml 的臨界值下，通過PRESAGE ST2檢測和ASPECTPLUS ST2 Test 檢測獲得的sST2結(jié)果相似。在臨床測試中，這3種檢測被認為對診斷心力衰竭（AUC：MBL ST2檢測為0.670，PRESAGE ST2檢 測 為0.626，ASPECT-PLUS ST2 Test 檢測為0.630）和預(yù)測呼吸困難患者的年死亡率（AUC：MBL 檢測為0.743，PRESAGE ST2檢測為0.742，ASPECTPLUS ST2 Test 檢測為0.752）同樣有用。

1.3 分子印跡聚合物結(jié)合納米粒子多重傳感器分析技術(shù)

分子印跡傳感器技術(shù)因具有高的靈敏度、好的選擇性、簡單的操作、較低的價格，在食品檢測、藥品分析和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16]。Crapnell 等[17]研究心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（heart-type fatty acid bindingprotein，H-FABP）和sST2的分子印跡聚合物結(jié)合納米粒子（molecularly imprinted polymer nanoparticles，nanoMIPs）多重傳感器分析技術(shù)，通過表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）分析表明，nanoMIPs 的親和力與市售抗體相似。此外，這種傳感器平臺能夠以最小的交叉，選擇性地同時測量H-FABP 和sST2；通過對流通池內(nèi)的熱流分布進行建模，3個熱電偶平行放置的形式具有最高的靈敏度。因此，該技術(shù)由于高選擇性、測量時間短，并且該陣列格式的成本低，可替代傳統(tǒng)的免疫測定。

1.4 雙色上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光免疫分析技術(shù)

上轉(zhuǎn)換納米粒子( upconversion nanoparticles，UCNPs) 是一種稀土離子混雜的無機納米材料，具備稀土離子的獨特能級結(jié)構(gòu)和反斯托克斯發(fā)射的性質(zhì)，與其他熒光材料相比，其發(fā)射峰窄、發(fā)光易于調(diào)控、光學(xué)穩(wěn)定性好、壽命長、毒性低等特性，現(xiàn)已被科研人員爭相進行廣泛開發(fā)研究，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力[18-20]。目前，雙色上轉(zhuǎn)換納米粒子（dual-colour UCNPs）已經(jīng)在多組分物質(zhì)分析檢測中得到很好的應(yīng)用[21]。

You 等[22]開發(fā)了一種高靈敏度和特異度的可定量的家庭預(yù)后平臺（UC-LFS 平臺），該平臺集成了基于智能手機的閱讀器和dual-colour UCNPs 熒光免疫分析技術(shù)，利用dualcolour UCNPs 可同時定量腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）與sST2，檢測結(jié)果可以快速與臨床醫(yī)師共享。為確認UC-LFS 平臺檢測結(jié)果的準確度、可靠性，該平臺檢測了38個臨床血清樣本，成功檢測到這些臨床樣本中sST2的最低濃度為29.92 ng/ml，BNP 的最低濃度為17.46 pg/ml，并與美國食品和藥物管理局批準的臨床方法檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果兩者具有良好的線性相關(guān)性，表明UC-LFS 平臺在臨床上具有實際的可靠性和穩(wěn)定性。

1.5 其他檢測方法

經(jīng)在國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢sST2的其他檢測方法后發(fā)現(xiàn)，星童醫(yī)療技術(shù)（蘇州）有限公司注冊了循環(huán)增強熒光免疫法的sST2檢測試劑盒，北京利德曼生化股份有限公司注冊了磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的sST2測定試劑盒，天津歐爾克醫(yī)藥科技有限公司注冊了時間分辨熒光免疫層析法的sST2檢測試劑盒，北京熱景生物技術(shù)有限公司注冊了磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法的sST2測定試劑盒，廣州春康生物科技有限公司注冊了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的sST2檢測試劑盒。但以上方法未見相關(guān)的文獻報道。

2 小結(jié)與展望

sST2是近年發(fā)現(xiàn)的重要的心力衰竭生物標志物之一，分別在2013年被美國心臟病協(xié)會/美國心臟學(xué)會（American College of Cardiology/American Heart Association，ACC/AHA）心力衰竭指南，2014年被中國心力衰竭診斷和治療指南列入生物標記物的推薦之中，說明sST2在心力衰竭診斷、治療和預(yù)后評估中具有明確的價值[23-24]。因此，實現(xiàn)高效、準確的sST2檢測是本領(lǐng)域研究者孜孜不倦的追求?？梢灶A(yù)期，隨著免疫熒光技術(shù)和納米粒子技術(shù)的快速發(fā)展，sST2檢測技術(shù)將會在靈敏度、特異度、檢測限、檢測效率等方面實現(xiàn)突破。