鮑遠(yuǎn)，聶銘博，施佳，李孟偉，康皓

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科,武漢 430030)

隨著組織工程技術(shù)的興起，利用人工支架修復(fù)皮膚軟組織缺損的研究越來(lái)越廣泛，并且部分支架已經(jīng)應(yīng)用于臨床。然而單純的支架移植并不能取得良好的臨床效果，其中一個(gè)重要原因是植入體內(nèi)的支架中難以形成血管。因此，如何將正常結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)絡(luò)整合到人工支架中是組織工程領(lǐng)域的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。為了解決這一問(wèn)題，在支架中接種血管生成細(xì)胞(干細(xì)胞或祖細(xì)胞)成為一種較常見(jiàn)的預(yù)處理方式[1]。除了過(guò)去研究最廣泛的生物化學(xué)因素，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)機(jī)械力在血管生成中也起重要作用[2]。力學(xué)因素能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化、功能行為以及形成血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力，因此人工支架的微結(jié)構(gòu)和機(jī)械力學(xué)性能對(duì)其中的內(nèi)皮細(xì)胞形成血管具有重要影響[3]。

細(xì)胞從感知外環(huán)境中的力學(xué)刺激到發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄水平的變化稱為力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能使細(xì)胞感知外界力學(xué)刺激信號(hào)并對(duì)其做出應(yīng)答，該過(guò)程涉及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的快速重構(gòu)并激活特定基因，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)受多種機(jī)械力學(xué)的調(diào)控，同時(shí)也是力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]?，F(xiàn)對(duì)YAP介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)控血管再生中的作用和機(jī)制進(jìn)行歸納和總結(jié)。

1 Hippo信號(hào)通路及其效應(yīng)因子YAP

YAP與c-Yes酪氨酸激酶作用相關(guān)，因而被命名為Yes相關(guān)蛋白[7]。YAP作為一種協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，必須與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合才能促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。其結(jié)構(gòu)中含有WW結(jié)構(gòu)域和TEAD結(jié)合區(qū)域，能識(shí)別并結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子。其中，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體YAP-TEAD所介導(dǎo)的生物學(xué)功能研究報(bào)道較多，研究認(rèn)為TEAD是介導(dǎo)YAP功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[8]。如果YAP或TEAD基因發(fā)生突變導(dǎo)致兩者無(wú)法結(jié)合，則會(huì)顯著抑制細(xì)胞增殖和組織生長(zhǎng)[8]。YAP是位于人類染色體11q22上的擴(kuò)增子，在人體很多癌癥中可以發(fā)現(xiàn)YAP的表達(dá)異常增多，尤其在肝癌中[9]。在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)YAP會(huì)導(dǎo)致肝臟體積增大以及腫瘤的發(fā)生，提示YAP在器官發(fā)育調(diào)控和腫瘤發(fā)生方面起重要作用[10]。

YAP是Hippo通路的直接效應(yīng)因子。YAP活化后能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、組織器官生長(zhǎng)以及細(xì)胞癌變，而Hippo通路通過(guò)抑制YAP活性調(diào)控組織細(xì)胞增殖和器官體積[11]。如小鼠的肝臟被切除2/3后，剩余肝臟再生到正常體積時(shí)就會(huì)停止生長(zhǎng)；此外，在體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞與鄰近其他細(xì)胞的接觸會(huì)導(dǎo)致其增殖受到抑制[12]。在哺乳動(dòng)物中Hippo通路的核心成員包括哺乳動(dòng)物STE20相關(guān)蛋白激酶(mammalian STE20-like protein kinase，MST)1/2、Salvador同源物1(Salvador homolog 1，SAV1)、大腫瘤抑制因子同源物(large tumor suppressor homologue，LATS)1/2和MOB激酶激活因子1(MOB kinase activator 1，MOB1)。MST1/2和LATS1/2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它們相繼發(fā)生磷酸化后形成激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激活Hippo通路。SAV1和MOB1是支架蛋白，前者為MST1/2和LATS1/2的作用提供結(jié)構(gòu)支持；后者能被MST1/2磷酸化，磷酸化后的MOB1結(jié)合LATS1/2的能力增強(qiáng)，從而增加LAT1/2激酶的活性。沉默SAV1或降低MOB1的磷酸化水平均能抑制Hippo通路的活性，因此SAV1-MST1/2或MOB1-LATS1/2復(fù)合體的完整性是Hippo信號(hào)通路發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Hippo通路激活后，活化的LATS1/2將YAP磷酸化。磷酸化的YAP在胞質(zhì)中與14-3-3蛋白結(jié)合，其活性因此被抑制。相反，當(dāng)Hippo通路被抑制，YAP去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4結(jié)合從而啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄[11]。組織再生過(guò)程涉及組織來(lái)源干細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過(guò)程，組織損傷后Hippo-YAP信號(hào)通路動(dòng)員干細(xì)胞，并調(diào)控其增殖、遷移、分化等生物學(xué)行為，在組織損傷修復(fù)過(guò)程中具有重要作用[13]。

2 力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.1肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用 在細(xì)胞增殖、分化、遷移以及干細(xì)胞特性維持的過(guò)程中，細(xì)胞間接觸、細(xì)胞外基質(zhì)硬度、流體剪切力等力學(xué)信號(hào)無(wú)處不在，并發(fā)揮重要調(diào)控作用[14-16]。細(xì)胞表面整合素受體形成的黏附斑是細(xì)胞感知力學(xué)信號(hào)的重要結(jié)構(gòu)。通過(guò)該結(jié)構(gòu)細(xì)胞能夠感知來(lái)自相鄰細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附位點(diǎn)的機(jī)械應(yīng)力，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和張力來(lái)適應(yīng)細(xì)胞外的力學(xué)環(huán)境，從而維持細(xì)胞的形態(tài)并調(diào)控增殖、分化、凋亡、遷移等生物學(xué)行為[17]。絲狀肌動(dòng)蛋白(fibrous actin,F-actin)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，它是由單體的球形肌動(dòng)蛋白(globular actin,G-actin)聚合而成。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架形成后處于解聚與合成的動(dòng)態(tài)平衡中，并受多種因素的調(diào)節(jié)，從而能夠?qū)αW(xué)刺激作出迅速的應(yīng)答[18]。細(xì)胞處于硬度較大的細(xì)胞外基質(zhì)中，F(xiàn)-actin合成增多并形成應(yīng)力纖維，且細(xì)胞伸展出細(xì)長(zhǎng)的絲狀偽足；相反，細(xì)胞在硬度較小的細(xì)胞外基質(zhì)中，F(xiàn)-actin發(fā)生解聚形成單體的G-actin，且細(xì)胞縮小呈圓形[19]。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架處于解聚與合成的動(dòng)態(tài)平衡中并受到Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming kinase,ROCK)信號(hào)通路的調(diào)控。ROCK被GTP-RhoA激活后，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化而被激活，活化的MLC促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架收縮，增加細(xì)胞張力，從而使細(xì)胞伸展。除直接磷酸化MLC，ROCK還可以通過(guò)磷酸化MLC磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基肌球蛋白磷酸酶靶向亞單位1來(lái)抑制MLC磷酸酶活性,從而間接增加MLC的磷酸化水平。此外，ROCK能激活LIM激酶，后者使絲切蛋白磷酸化并抑制其對(duì)細(xì)胞骨架的解聚作用，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的形成[20]。用抑制劑Y-27632抑制ROCK或拉春庫(kù)林B直接解聚F-actin會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞處于低張力狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為不再受到外界機(jī)械力刺激的影響[19]。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)改變?cè)诹W(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.2YAP在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用 Hippo-YAP通路上游的調(diào)控因素非常廣泛，除多種生物化學(xué)信號(hào)外，還包括細(xì)胞外基質(zhì)硬度、細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)的黏附、細(xì)胞密度、細(xì)胞形態(tài)等機(jī)械力學(xué)信號(hào)。這些上游的機(jī)械刺激均會(huì)引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的改變[21]。在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中YAP發(fā)揮關(guān)鍵的作用[22]。機(jī)械力學(xué)信號(hào)能影響YAP的磷酸化水平，細(xì)胞在硬度較大的細(xì)胞外基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，YAP發(fā)生去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄；相反，細(xì)胞在硬度較小的細(xì)胞外基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，YAP發(fā)生磷酸化并滯留在胞質(zhì)中，相關(guān)基因的表達(dá)被抑制[19]。為了進(jìn)一步確定機(jī)械力調(diào)控YAP的機(jī)制，研究者將細(xì)胞接種至不同面積的纖連蛋白涂層上，涂層面積的大小決定細(xì)胞黏附后的伸展面積。研究發(fā)現(xiàn)，在面積較大的纖連蛋白涂層上，細(xì)胞充分伸展，YAP被激活；而在面積較小的纖連蛋白涂層上，YAP的活性被抑制。改變基質(zhì)的硬度后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)仍能得到相同的結(jié)果[19]。該研究認(rèn)為細(xì)胞的形態(tài)和大小能調(diào)控YAP的活性，而其機(jī)制可能與細(xì)胞中F-actin的數(shù)量有關(guān)。體積較大的細(xì)胞內(nèi)有更多的F-actin形成，從而導(dǎo)致YAP被激活。用拉春庫(kù)林B解聚F-actin則會(huì)導(dǎo)致YAP的磷酸化水平升高而失活。因此，F(xiàn)-actin通過(guò)對(duì)YAP活性的調(diào)控將外部的機(jī)械力學(xué)刺激轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)，從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性[19]。在不同的發(fā)育階段和組織類型中，F(xiàn)-actin通過(guò)調(diào)控YAP活性影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。如在果蠅三齡幼蟲的翅成蟲盤中，加帽蛋白的功能缺陷或形成蛋白同源物Dia過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致F-actin合成增多，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織過(guò)度生長(zhǎng)[21,23]。此外，基質(zhì)硬度、細(xì)胞形態(tài)、張應(yīng)力等機(jī)械力刺激通過(guò)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì)YAP活性的調(diào)控能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向特定細(xì)胞系的分化[19]。因此，YAP在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。

3 力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在血管生成中的作用

血管形成過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜和多步驟的過(guò)程，伴隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和生存。該過(guò)程受多種生長(zhǎng)因子的調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是主要的驅(qū)動(dòng)因素，其對(duì)血管功能的影響是目前研究的熱點(diǎn)[24]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)主要有VEGFR1和VEGFR2。VEGFR2與VEGF結(jié)合時(shí)發(fā)生自磷酸化并被激活，通過(guò)一系列下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[25]。VEGF與VEGFR2結(jié)合后引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的變化已被廣泛研究，但VEGF信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)并啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄程序的機(jī)制以及這些基因轉(zhuǎn)錄的具體作用仍不清楚[26]。

在皮膚組織工程的研究中，VEGF被加入人工支架中以促進(jìn)血管的形成[3,26]。然而在部分支架中，加入VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞也無(wú)法形成正常而穩(wěn)定的血管結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，YAP是血管形成過(guò)程中必不可少的因子，并且在此過(guò)程中VEGF能激活YAP的協(xié)同轉(zhuǎn)錄功能[26]。敲除小鼠體內(nèi)VEGF基因會(huì)使胚胎和卵黃囊的血管嚴(yán)重畸形，從而導(dǎo)致胚胎死亡[24]。此外，敲除YAP基因后，卵黃囊內(nèi)也出現(xiàn)明顯的血管缺陷，并導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯[27]。VEGF能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)和富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,CYR61)的表達(dá)，同時(shí)也是YAP的靶基因[28]。轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4能與協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子YAP結(jié)合并啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，有研究證實(shí)TEAD4是VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞成血管過(guò)程中所必需的轉(zhuǎn)錄因子[29]。研究顯示，在新生血管前端的內(nèi)皮細(xì)胞中，YAP表達(dá)量豐富且定位于細(xì)胞核，表明血管生成過(guò)程中伴隨著YAP的大量激活。此外，在處于發(fā)育階段的動(dòng)物體內(nèi)沉默YAP基因會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管發(fā)育障礙[28,30]。這些研究均提示YAP參與血管生成的過(guò)程，而且VEGF能調(diào)控YAP的活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，用VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)YAP去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)YAP的靶基因CTGF和CYR61的表達(dá)明顯上調(diào)。沉默YAP基因后，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和血管形成能力明顯下降，而且VEGF不再增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和血管形成能力，同時(shí)VEGF也不再促進(jìn)CTGF和CYR61的表達(dá)。此外，阻斷VEGFR2能抑制VEGF誘導(dǎo)的YAP去磷酸化的作用[26]。上述研究證實(shí)了VEGF作用于VEGFR2后通過(guò)激活YAP來(lái)啟動(dòng)血管生成的過(guò)程。

在血管生成的過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞從激活、增殖到新生血管形成，除多種化學(xué)信號(hào)參與外，還涉及力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，力學(xué)信號(hào)是調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移、血管生成等生物學(xué)行為的重要因素[4]。研究已證實(shí)，VEGF能夠調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移[31]。完整的細(xì)胞骨架對(duì)于VEGF誘導(dǎo)YAP活化是必需的。用拉春庫(kù)林B解聚F-actin能夠提高YAP的磷酸化水平并使其停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而失去轉(zhuǎn)錄活性[30]。VEGF能誘導(dǎo)YAP去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而在拉春庫(kù)林B存在的情況下VEGF則會(huì)失去這一作用[26]。因此，VEGF誘導(dǎo)YAP活化與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)有關(guān)。Src家族激酶是已知的VEGF-VEGFR2下游的信號(hào)分子，能夠調(diào)控VEGF介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管的侵襲[32]。用Src家族激酶的特異性抑制劑PP2抑制其活性，能阻斷VEGF引起的YAP去磷酸化、核內(nèi)定位以及其靶基因的表達(dá)。RhoA激活ROCK信號(hào)通路后能夠促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架合成并形成應(yīng)力纖維，從而降低YAP的磷酸化水平并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[33]。然而，用RhoA的特異性抑制劑C3抑制其活性后ROCK激酶活性被抑制，此時(shí)VEGF不再對(duì)YAP的磷酸化和亞細(xì)胞定位產(chǎn)生影響。這些研究進(jìn)一步證實(shí)了VEGF通過(guò)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)來(lái)調(diào)控YAP的活性。YAP是Hippo信號(hào)通路的直接效應(yīng)因子，研究證實(shí)VEGF能降低LATS1的磷酸化水平，提示VEGF調(diào)控YAP的活性需要Hippo和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的參與[26]。綜上所述，VEGF啟動(dòng)的血管生成過(guò)程與力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

4 小 結(jié)

隨著對(duì)生物力學(xué)研究的不斷深入，力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等方面的重要作用逐漸被認(rèn)識(shí)到，尤其在組織工程研究領(lǐng)域。在血管再生過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞感知環(huán)境中的力學(xué)信號(hào)，并使肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生快速重構(gòu)，從而激活YAP并啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及形成血管。在細(xì)胞感知機(jī)械力刺激到發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，YAP介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是不可或缺的過(guò)程。將血管網(wǎng)絡(luò)整合到人工支架中仍是各組織工程領(lǐng)域所面臨的重大挑戰(zhàn)，隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，目前可以構(gòu)建精確幾何結(jié)構(gòu)和層次結(jié)構(gòu)的血管形態(tài)。在這種血管形態(tài)結(jié)構(gòu)中施加外力或調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞所受到的機(jī)械應(yīng)力，則能夠調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的能力，這可能成為未來(lái)組織工程支架研究的新思路。因此，理解機(jī)械應(yīng)力調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的機(jī)制，有助于推動(dòng)人工支架在皮膚軟組織缺損治療中的應(yīng)用。