鐘成清，楊麗立，舒鑫，王普，余能偉

(1.成都市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，成都610041;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，成都610072;3.綿陽市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 綿陽621000;4.崇州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 崇州611230)

腦卒中作為一組以局灶性神經(jīng)功能缺失為特征的高致死、高致殘性急性腦血管疾病，已成為目前嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病，分為出血性和缺血性。目前公認(rèn)的腦卒中危險(xiǎn)因素包括高血壓、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、血脂異常、吸煙、心房顫動、肥胖等，只有吸煙為可完全控制的危險(xiǎn)因素，其他危險(xiǎn)因素可通過藥物、運(yùn)動和飲食習(xí)慣調(diào)整等部分改善。部分腦卒中可能與遺傳因素導(dǎo)致的個(gè)體差異有關(guān)。隨著遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，腦卒中的遺傳學(xué)研究逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。研究顯示，遺傳和環(huán)境因素在腦卒中的發(fā)生、發(fā)展中有著重要影響［1］。以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)為基礎(chǔ)的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association study，GWAS)是當(dāng)今復(fù)雜性疾病強(qiáng)有力的研究手段，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量易感位點(diǎn)和易感基因，其中染色體9p21.3 基因座已被證實(shí)存在某些疾?。廴缧难芗膊?cardiovascular disease，CVD)［2］、缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)［3］、主動脈瘤［4］、顱內(nèi)動脈瘤［5］、原發(fā)性開角性青光眼［6］、2 型糖尿?。?］、膠質(zhì)瘤［8］、腫瘤易感性［9］］的易感位點(diǎn)，提示染色體9p21 中存在重要的不穩(wěn)定的基因座?，F(xiàn)就9p21 位點(diǎn)多態(tài)性與腦卒中相關(guān)性的研究進(jìn)展予以綜述。

1 9p21 位點(diǎn)多態(tài)性常用研究方法

遺傳多態(tài)性通常是指同一生物群體中，兩種或以上的變異類型或基因型并存的現(xiàn)象，同時(shí)，這種變異型的數(shù)量保持在相對穩(wěn)定的比例［10］。SNP 主要是指在基因組水平上單個(gè)核苷酸發(fā)生變異所引起的DNA 序列多態(tài)性［11］，其具有分布均勻、數(shù)量大、穩(wěn)定性高、自動化分析便捷等特點(diǎn)［12］，是重要的基因遺傳標(biāo)記，能準(zhǔn)確識別有關(guān)區(qū)域的易感基因。

近年來，以SNPs 為基礎(chǔ)的GWAS 已成為研究復(fù)雜性疾病易感位點(diǎn)和基因的主要檢測方法。GWAS的基本策略是用基因芯片在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)對數(shù)十萬乃至上百萬個(gè)SNP 進(jìn)行檢測，通過病例對照關(guān)聯(lián)分析，在不同的群體及大樣本中進(jìn)行多階段重復(fù)驗(yàn)證并整合結(jié)果，從而篩選出與疾病關(guān)聯(lián)的常見變異。GWAS 已成功發(fā)現(xiàn)多個(gè)與人類常見疾病有很強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的SNPs，據(jù)國際人類基因組研究所和歐洲生物信息研究所統(tǒng)計(jì)，截至2015 年6 月，共有2 000 多篇GWAS 研究被收錄，累計(jì)發(fā)現(xiàn)15 000 個(gè)SNPs 位點(diǎn)與約8 000 相關(guān)性狀或疾病相關(guān)［13-15］，但被發(fā)現(xiàn)的相關(guān)位點(diǎn)的作用效應(yīng)很微弱，不能完全解釋這些疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，很難直接定位致病變異，尤其涉及家系和個(gè)體中的稀有或低頻變異時(shí)，GWAS 很難發(fā)現(xiàn)［16］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以外顯子測序技術(shù)為主的高通量測序得到了蓬勃的發(fā)展，它能發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的低頻變異、罕見變異和新的基因，正好與GWAS 發(fā)現(xiàn)常見變異形成互補(bǔ)［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，罕見變異在復(fù)雜疾病遺傳作用的生物學(xué)功能可能更大［18］。高通量測序技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，為進(jìn)一步探究多基因復(fù)雜疾病打開了新的思路，為深入了解人類疾病發(fā)生的遺傳機(jī)制提供了重要線索和科學(xué)依據(jù)。

2 9p21 概述

9p21 區(qū)域DNA 序列全長約為175 kb，具有高度連鎖不平衡性，主要有甲硫腺苷磷酸化酶(methylthioadenodine phosphorylase，MTAP)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitive factor，CDKN)2A 和CDKN2B、ANRIL(antisense non-coding RNA)等基因［19］。MTAP 在甲硫氨酸和嘌呤的合成補(bǔ)救中起關(guān)鍵酶作用，并參與多胺代謝途徑，生成DNA、ATP 和甲硫氨酸，最終在細(xì)胞的DNA、能量、蛋白質(zhì)合成中起重要作用，參與細(xì)胞的新陳代謝，另外，MTAP 的缺失與腫瘤形成相關(guān)［20］。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中MTAP 基因中的SNP 位點(diǎn)與冠心病、IS 的患病相關(guān)［21］。CDKN2A 編碼蛋白質(zhì)p16INK4a(p16 inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a)和p14ARF(p14 alternative reading frame)，CDKN2B編碼蛋白質(zhì)p15INK4b，這些蛋白質(zhì)均參與細(xì)胞周期調(diào)控、老化、衰老、凋亡，并與動脈粥樣硬化形成有密切關(guān)系，當(dāng)然CDKN2A 和CDKN2B 也是抑癌基因［22］。ANRIL 是INK4 位點(diǎn)上一段長約126.3 kb 的反義非編碼RNA，與其他3 個(gè)主要基因有部分重疊，與CDKN2B轉(zhuǎn)錄的方向相反，有研究還表明，ANRIL 可調(diào)節(jié)鄰近基因CDKN2A/2B 表達(dá)，也可能通過某種機(jī)制干預(yù)遠(yuǎn)距離靶基因的表達(dá)，是目前各國科學(xué)家研究9p21 的一個(gè)重要位點(diǎn)［23］。ANRIL 被認(rèn)為是原癌基因，參與胃癌、肺癌、肝癌、食管鱗狀細(xì)胞癌的形成，ANRIL 沉默可以抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在各種腫瘤中ANRIL 表達(dá)升高，可以作為某些腫瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物;另外，ANRIL 已經(jīng)成為CVD 的重要遺傳易感基因，該位點(diǎn)的眾多SNP 與CVD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)［24-25］。

3 IS 與9p21

腦卒中是目前我國居民疾病死亡的第一大原因［26］。盡管目前加強(qiáng)了卒中的預(yù)防，提高了診斷水平，治療措施也不斷改進(jìn)，但腦卒中仍表現(xiàn)為高發(fā)病率、高致殘率和高病死率，而且世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，到2025 年腦卒中發(fā)病率會增加27%，對人類社會的健康造成巨大危害，給患者和社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［27-28］。腦卒中分為IS 和出血性腦卒中，IS 約占全部腦卒中發(fā)病率的80%［29］，是受遺傳、環(huán)境和血管危險(xiǎn)因素相互作用而引起的一種多因子復(fù)雜疾?。?0］，大約一半的發(fā)病可以用傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素解釋，如缺血性心臟病、高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙及心房顫動等［31］。越來越多的研究表明，遺傳因素在IS 發(fā)展中起著非常重要的作用［32］，但國內(nèi)外學(xué)者研究9p21 與IS 是否相關(guān)聯(lián)，得出的結(jié)論卻不一致。

Matarin 等［33］在249 例IS 白種患者及268 例對照中用GWAS 檢測了超過40 萬個(gè)特殊SNPs，結(jié)果沒有一個(gè)位點(diǎn)與卒中風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，但卻首次發(fā)現(xiàn)了9p21 染色體上的CDKN2A 與IS 存在某種微弱關(guān)聯(lián)。后來大多數(shù)研究證實(shí)了9p21 確實(shí)可增加IS 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［34-35］，但另有研究發(fā)現(xiàn)，9p21 與IS 之間不存在這種關(guān)聯(lián)性［36-39］;多項(xiàng)薈萃分析也顯示，9p21中相關(guān)位點(diǎn)是IS 的危險(xiǎn)因素，尤其與大動脈粥樣硬化型(large artery atherosclerosis，LAA)卒中存在顯著的關(guān)聯(lián)［40-42］。Lu 等［43］在528 例非心源性IS 患者(375 例合并頸動脈斑塊，153 無頸動脈斑塊)、258 名健康對照者中對9p21 區(qū)域中的6 個(gè)SNPs 進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2383206、rs4977574 的G 等位基因是IS 的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，且中年人群中的無頸動脈斑塊組攜帶該基因人數(shù)顯著多于正常對照組;含有GG 純合子的個(gè)體比含AG/AA 基因型具有顯著增加IS 風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng);另外，該研究還發(fā)現(xiàn)，65 歲以上IS 患者rs2383206、rs4977574 的G 等位基因與頸動脈斑塊發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。L?vkvist 等［44］也在3 986 例IS 患者和2 459 名健康對照者中證實(shí)了9p21 上的SNP rs4977574 與IS 相關(guān)。Bi 等［45］指出染色體9p21 是IS 的一個(gè)易感基因，其變異產(chǎn)生的影響可能會隨著年齡的變化而發(fā)生改變;該研究第一次證明了rs10757278 GG 基因型、rs1537378-C 等位基因、rs1333047TT 基因型與中國漢族人群IS 相關(guān)聯(lián);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在IS 中rs10757278-GG 攜帶者血漿總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平顯著增加，在納入對照組后差異仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，從而推測rs10757278 變異可能對血脂水平有不同程度的影響，同時(shí)有rs10757278-G等位基因變異和血脂異常的人可能患IS 的易感性更高，基因型對于血脂水平的影響一定程度上會干預(yù)IS 的進(jìn)程。最近的一篇關(guān)于rs10757274 的薈萃分析(納入10 個(gè)研究，6 746 例病例及12 577 例對照)顯示，按種族分組的亞組分析中rs10757274G 等位基因攜帶者發(fā)生IS 的風(fēng)險(xiǎn)增加(包含亞洲人和高加索人);進(jìn)一步對rs10757274 與LAS 進(jìn)行相關(guān)性分析表明，等位基因或GG 基因型增加了亞洲人LAS 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(等位基因模型:OR =1.18，95%CI 1.06 ～1.1，P=0.002;隱性模型:OR =1.33，95%CI 1.12 ～1.57，P=0.001)［46］。2015 年，Carty 等［47］在《Stroke》上發(fā)文，第一次針對GWAS 研究中的14 746 例非洲裔美國人(含1 365 例IS、1 592 例混合型卒中)進(jìn)行了薈萃分析，對達(dá)到P ＜10-6的相關(guān)基因位點(diǎn)在歐洲血統(tǒng)人群缺血性腦卒中遺傳研究聯(lián)盟(METASTROKE)上進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明，在非洲裔美國人身上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與血脂水平和高血壓有關(guān)的基因變異，即基因15q21.3 位點(diǎn)上rs4471613發(fā)生了變異，該變異與所有的卒中相關(guān)(P =3.9 ×10-8)，在歐洲人群中已證實(shí)與IS 相關(guān)的易感位點(diǎn)可能也與之相關(guān)。2015 年，美國國立神經(jīng)病學(xué)與卒中研究所和國際卒中遺傳學(xué)聯(lián)合會分2 個(gè)階段做了一個(gè)大規(guī)模GWAS 識別卒中及其亞型易感基因的研究，結(jié)果在1p13.2 位點(diǎn)的TSPAN2 附近發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與LAA 相關(guān)的基因座(G 等位基因位于rs12122341);同時(shí)研究結(jié)果也支持之前被多次報(bào)道的4 個(gè)位點(diǎn)(包括PITX2、ZFHX3、HDAC9、12q24)與IS 密切相關(guān)，但以前研究發(fā)現(xiàn)的相關(guān)易感基因NINJ2、9p21.3 均未被證實(shí)［48］。2015 年，另一篇發(fā)表在《Stroke》的文章試圖在LAA、心源性腦栓塞(cardio-embolism，CE)和小血管閉塞(small vessel occlusion，SVO)3 種IS 亞型中尋找共同的易感基因，該研究共納入12 389 例IS 患者(包括2 167 例LAA、2 405 例CE 和1 854 例SVO)和62 004 例對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LAA 與SVO 型之間有很高的遺傳相關(guān)性，LAA 與CE、SVO 與CE 只有在混合線性模型下才有微弱的關(guān)聯(lián);隨后又對LAA 和SVO 進(jìn)行了薈萃分析，發(fā)現(xiàn)6q25.2 上OPRM1 的rs17084671(P=1 ×10-7)與之有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，可能是LAA、SVO 的共享遺傳基因［49］。S?derholm 等［50］對瑞典南部人群(IS 組2 385 例，對照組6 077 例)進(jìn)行了外顯子測序，結(jié)果沒發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的易感位點(diǎn)和易感區(qū)域。其他證實(shí)過與IS 相關(guān)的易感基因有APOE(E2/E3/E4)基因［51］、10q25 上HABP2 附近rs11196288［52］、12p13 上rs12425791［53］、9q34.2 上ABO 和7p21.1上HDAC9(與LAA 卒中相關(guān))、PITX2 和ZFHX3 基因(與CE 型卒中相關(guān))［54］以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因(與非CE 型卒中相關(guān))等［55］。針對以上眾多學(xué)者關(guān)于9p21 與IS 的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果不一致的情況，推測腦卒中是一種異質(zhì)性疾病，據(jù)TOAST(trial of org 10172 in acute stroke treatment)病因?qū)W分型，分為LAA、CE、SVO、其他病因確定的卒中、不明原因型5 個(gè)類型，各個(gè)亞型分別有獨(dú)特的病因、危險(xiǎn)因素、遺傳特征，甚至亞型之間也可能有共同的遺傳成分;不同地區(qū)、種族、人群之間也可能有不同的基因分布特點(diǎn)，存在表達(dá)差異;一些研究樣本量偏小，有不同情況的選擇偏倚，忽略了其他因素對IS 的影響，造成了假陽性的結(jié)果。

4 動脈瘤與9p21

2008 年，隨著9p21 上10757278-G 與冠心病、rs10811661-T 與2 型糖尿病相關(guān)聯(lián)的報(bào)道出現(xiàn)，Helgadottir 等［4］試圖去探尋兩基因位點(diǎn)與動脈瘤的關(guān)系，結(jié)果第一次在歐洲人群中證實(shí)了9p21 上的rs10757278-G 與腹主動脈瘤和顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)。同年，Bilguvar 等［56］在涉及芬蘭、荷蘭、日本人群的2 100 例顱內(nèi)動脈瘤和8 000 例對照分析中，不僅證實(shí)了9p21 上的CDKN2A 與動脈瘤有很強(qiáng)的相關(guān)性，還新發(fā)現(xiàn)了染色體2q、8q 也與之相關(guān)。Foroud 等［57］首先在白色人種2 617 例顱內(nèi)動脈瘤和2 548 例對照組中進(jìn)行基因分析，同時(shí)進(jìn)一步薈萃分析，結(jié)果又新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)的位點(diǎn)，即第7 號染色體上HDAC9 的rs10230207，同時(shí)也證實(shí)了9p21 上CDKN2BAS 的rs10733376 與顱內(nèi)動脈瘤的相關(guān)性。Loinard 等［58］在小鼠上剔除9p21 非編碼區(qū)上心血管風(fēng)險(xiǎn)區(qū)間，結(jié)果促進(jìn)了動脈瘤的生長，從而證明了染色體9p21 與動脈瘤易感性有直接關(guān)系。Kurki等［59］通過大樣本、多中心病例對照分析研究發(fā)現(xiàn)，9p21.3、2q23.3、2q33.1、5q31.1 和6q24.2 與囊狀動脈瘤相關(guān)。Abrantes 等［60］研究發(fā)現(xiàn)，rs4667622(UBR3 和MYO3B 之間)、rs6599001(3p22.2 上SCN11A和WDR48 之間)、rs3932338(5p14.2 上PRDM9 下游)、rs10943471(HTR1B 上游)、rs1333040(9p21)與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)，而且新發(fā)現(xiàn)的前4 個(gè)位點(diǎn)與顱內(nèi)動脈瘤的關(guān)聯(lián)性比rs1333040 更強(qiáng)。van't Hof 等［61］在3 個(gè)GWAS 關(guān)于動脈瘤的隊(duì)列研究中(顱內(nèi)動脈瘤1 516 例，對照組4 305 例;腹主動脈瘤818 例，對照組3 004 例;胸主動脈瘤760 例，對照組2 212 例)試圖尋找共同致病基因，結(jié)果在3 種動脈瘤之間沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)與之顯著相關(guān)的共同致病基因，只是發(fā)現(xiàn)18q11 附近的RBBP8 是顱內(nèi)動脈瘤和腹主動脈瘤的風(fēng)險(xiǎn)基因，15q21 附近的FBN1 是主動脈瘤和腹主動脈瘤的風(fēng)險(xiǎn)基因。我國也有學(xué)者去探究動脈瘤與染色體9p21 之間的關(guān)系，張利通［62］在天津地區(qū)的119 例顱內(nèi)動脈瘤患者及257 例對照者中分析了22 個(gè)基因區(qū)域的28 個(gè)SNP 位點(diǎn)，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)了糖尿病相關(guān)基因SLC2A9 上rs7660895 和TOX 基因上rs11777927 是顱內(nèi)動脈瘤的易感基因。Wei 等［63］在155 例腹主動脈瘤和310 例對照組中發(fā)現(xiàn)，9p21.3 上的rs10757278-G、rs1333049-C 顯著增加了腹主動脈瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)。Nakaoka 等［64］通過研究發(fā)現(xiàn)，9p21 對顱內(nèi)不同位置的動脈瘤影響不一樣(后交通動脈部強(qiáng)于前交通動脈)，隨后又在動脈瘤未破裂組和破裂組之間比較基因的表達(dá)譜，探究誘發(fā)動脈瘤破裂的生物機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100A8、S100A9、S100A12表達(dá)水平的下調(diào)會導(dǎo)致動脈瘤血管壁變薄，抗炎因子Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子(krüppel-like transcription factor，KLF)2、KLF12、KLF15 和CDKN2A 的下調(diào)也與動脈瘤相關(guān)。9p21 引起動脈瘤的具體機(jī)制尚不清楚，需要廣大學(xué)者更深入的研究，血管壁結(jié)構(gòu)改變可能是其中之一。

5 小 結(jié)

9p21 區(qū)域在多種復(fù)雜疾病的病理生理機(jī)制中可能發(fā)揮重要的作用，9p21 區(qū)域上存在多個(gè)疾病易感位點(diǎn)，這種現(xiàn)象集中在疾病共同的機(jī)制上，尤其是血管性疾病，揭示了該區(qū)域與血管相關(guān)性疾病的密切聯(lián)系。全面準(zhǔn)確地查找腦卒中的危險(xiǎn)因素，做好針對性的預(yù)防措施，將顯著減輕腦卒中導(dǎo)致的嚴(yán)重社會及家庭負(fù)擔(dān)。通過基因檢測或預(yù)測模型將高危人群從一般人群中精確篩選出來將對疾病的防治起到積極作用，也為個(gè)體化治療提供基因證據(jù)和靶點(diǎn)。為此，有必要開展廣泛人群的基因篩查和健康人群對照，建立流行病數(shù)據(jù)庫有助于更全面地收集遺傳信息，減少卒中的發(fā)生。