李艷鳳，翟夢(mèng)穎，李雨昕，王蔚佳，劉征

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150040)

發(fā)酵法是中藥炮制的傳統(tǒng)方法，其具有節(jié)約藥料、減毒增效的作用。雖然中藥經(jīng)發(fā)酵炮制，改變了以往的煎煮、蒸浸、煉制等常用工序，但藥物療效明顯增強(qiáng)。如中藥淡豆豉，是由桑葉或麻黃等發(fā)酵后制得，而采取不同的培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)相同的微生物處理之后，藥物的藥性會(huì)發(fā)生明顯變化，所以利用這一特性，可制得不同適應(yīng)證的中藥[1]。發(fā)酵炮制中藥的方法早在我國(guó)漢代最早的中藥學(xué)著作——《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，之后的史料，如《本草綱目》《本草蒙筌》《藥性論》及《韓氏醫(yī)通》中也能找到相關(guān)依據(jù)。現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)是在傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)上進(jìn)一步創(chuàng)新發(fā)展，將中藥發(fā)酵與生物工程學(xué)、微生態(tài)學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合，對(duì)藥材進(jìn)行處理，前景廣泛。為進(jìn)一步發(fā)掘發(fā)酵法在中醫(yī)藥事業(yè)中的新用途、新發(fā)展，現(xiàn)就發(fā)酵的歷史沿革、發(fā)酵方式、目前通過(guò)發(fā)酵炮制的主要中藥品種、發(fā)酵炮制對(duì)藥材的作用及應(yīng)用前景等予以綜述，旨在闡述發(fā)酵應(yīng)與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，從而建立以藥效學(xué)為最終評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為中藥發(fā)酵炮制的研究提供參考和新思路，同時(shí)傳承、發(fā)展、創(chuàng)新中醫(yī)藥事業(yè)，豐富世界醫(yī)學(xué)事業(yè)。

1 發(fā)酵的歷史沿革及現(xiàn)狀

在微生物學(xué)中，發(fā)酵是指微生物細(xì)胞將有機(jī)物氧化釋放的電子直接交給底物本身未完全氧化的某種中間產(chǎn)物，同時(shí)釋放能量并產(chǎn)生各種不同的代謝產(chǎn)物[2]。但在工業(yè)、食品及其他產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中，“發(fā)酵”是一切以微生物為依托進(jìn)行各類生產(chǎn)的統(tǒng)稱。根據(jù)史料記載及推測(cè)，早在8 000年以前，我國(guó)就已經(jīng)出現(xiàn)了曲蘗釀酒；4 000多年前，釀酒已變得十分普遍；2 500年前，勤勞的古代人民發(fā)明了釀醬、醋，并用曲這一特殊的中藥劑型治療消化道疾病。先秦時(shí)期，《莊子·知北游》中記載發(fā)酵為“其所美者為神奇，其所惡者為臭腐。臭腐復(fù)化為神奇，神奇復(fù)化為臭腐”[3]?？梢?jiàn)，那時(shí)人們已認(rèn)識(shí)到在發(fā)酵的過(guò)程中發(fā)生了物質(zhì)轉(zhuǎn)化。東漢時(shí)期，“醫(yī)圣”張仲景所著《傷寒論》中載有“梔子豉湯方”“梔子甘草豉湯”“梔子生姜豉湯”等含有豆豉的方劑，可知豆豉在方劑配伍中具有一定的效用；北魏時(shí)期，農(nóng)學(xué)家賈思勰所著《齊民要術(shù)》里詳細(xì)記載了制曲、釀酒、制醬和釀醋等工藝；到了宋代，發(fā)酵廣泛用于中藥炮制，出現(xiàn)了“半夏合生姜制曲法”，《太平惠民和劑局方》針對(duì)其中記載的相關(guān)方劑，描述了具體的操作方法。此外，醫(yī)之始祖——《黃帝內(nèi)經(jīng)》對(duì)發(fā)酵也有些許記載，其中就有將藥酒稱為“醪醴”的說(shuō)法。

在中藥炮制中，中藥發(fā)酵法是指經(jīng)凈制或處理后的藥物，在一定的溫度和濕度條件下，由于真菌和酶的催化分解作用，使藥物發(fā)泡、生衣的方法[4]。炮制前后藥材性能、治療作用均大為改變。但是因發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生微生物，且其種類眾多、數(shù)量巨大，目前的檢測(cè)方法難以辨清，故2015版《中國(guó)藥典》收載的經(jīng)發(fā)酵方法炮制的中藥材僅有淡豆豉一種。

2 發(fā)酵方式

隨著各類技術(shù)的蓬勃發(fā)展，中藥發(fā)酵法與微生態(tài)學(xué)及現(xiàn)代生物工程的結(jié)合，形成了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)。與傳統(tǒng)中藥發(fā)酵相比，在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)生了益生菌的轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)一些突破性的變化，如在加工過(guò)程中，大分子材料經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成小分子，從而使有效成分進(jìn)入人體后吸收完全，藥效充分發(fā)揮；在新技術(shù)中，多層次、多菌種共同發(fā)酵，藥材療效提高；微生物發(fā)酵狀態(tài)下，中藥中某些有毒物質(zhì)被分解，毒副作用明顯降低；在性味方面，由于發(fā)酵過(guò)程能夠改變或遮蔽藥材原有苦味，從而更易為人們所接受，所以利用發(fā)酵法處理中藥日益受到學(xué)者重視[5]。將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于中藥發(fā)酵，成為中藥研究的重要方法，Lv等[6]通過(guò)巢式聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳研究與紅曲糯米酒發(fā)酵起始物(紅曲和姚曲)相關(guān)真菌和細(xì)菌的微生物組成發(fā)現(xiàn)，真菌與細(xì)菌對(duì)紅曲糯米酒的發(fā)酵過(guò)程具有重大作用，并在一定程度上指導(dǎo)了大規(guī)模生產(chǎn)。

2.1固體發(fā)酵 固體發(fā)酵是指在沒(méi)有自由水或自由水含量極低的條件下，以一定濕度農(nóng)副產(chǎn)品為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，以一種或多種真菌為菌種發(fā)酵，該發(fā)酵方法是從制曲工藝發(fā)展而來(lái)，后經(jīng)改進(jìn)優(yōu)化形成。如半夏曲、六神曲、沉香曲等，其發(fā)酵過(guò)程操作簡(jiǎn)單，溫度、濕度、酸堿度、氧含量等環(huán)境條件易于控制，不易感染雜菌，因此藥效能得到充分的發(fā)揮。遲曉麗等[7]研究發(fā)現(xiàn)，中藥固體發(fā)酵的關(guān)鍵在于優(yōu)勢(shì)菌種的選育，產(chǎn)率高、轉(zhuǎn)化率高、毒性低的菌種是理想選擇標(biāo)準(zhǔn)。劉學(xué)湘等[8]利用白僵菌固體發(fā)酵處理馬錢子，采用急性毒性實(shí)驗(yàn)法和醋酸引起小鼠扭體法、熱板法等實(shí)驗(yàn)方法，探究馬錢子的急性毒性及陣痛活性，結(jié)果證實(shí)發(fā)酵后藥材的毒性作用減弱而鎮(zhèn)痛活性明顯增強(qiáng)。

2.2液體發(fā)酵 液體發(fā)酵是一種現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，依托抗生素生產(chǎn)工藝，將生長(zhǎng)情況良好的菌絲接種到含有一定比例中藥材培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基置于適宜環(huán)境條件下進(jìn)行發(fā)酵。該種發(fā)酵方法相較固體發(fā)酵法有所突破，因而應(yīng)用更為廣泛。但由于大多數(shù)中藥容易在發(fā)酵過(guò)程中被污染，所以其對(duì)工藝設(shè)備的要求較為嚴(yán)格。楊瑾等[9]以高胰島素抵抗人肝癌HepG2細(xì)胞作為受試對(duì)象，探究不同濃度茯苓胞外多糖對(duì)葡萄糖的抑制程度發(fā)現(xiàn)，經(jīng)液體發(fā)酵后的茯苓胞外多糖降低血糖作用明顯優(yōu)于其他濃度或未經(jīng)發(fā)酵處理的胞外多糖。此外，液態(tài)深層發(fā)酵還廣泛用于紅曲的生產(chǎn)菌種研究與大規(guī)模生產(chǎn)[10]。

2.3雙向性固體發(fā)酵 雙向性固體發(fā)酵于20世紀(jì)80年代由南京中醫(yī)藥大學(xué)莊毅教授首次使用，此技術(shù)依托固體發(fā)酵，與其不同的是將菌種生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)變?yōu)橹兴幉幕蛩幵?，使得中藥材在為真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，自身的結(jié)構(gòu)成分也被真菌的代謝產(chǎn)物或細(xì)胞因子影響，從而使藥材出現(xiàn)與原來(lái)不一樣的功能性味，由此具有雙向性[11]。朱舟等[12]采用固體發(fā)酵方式，以中藥天南星為底物，在適宜的白僵菌接種量、溫度和時(shí)間下，以含水量適宜的天南星粗粉-鮮豆渣-米粉作為培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在一定參數(shù)下得到的天南星炮制品與其他方法相比，毒性降低但抗驚厥作用升高。因此，白僵菌在固體發(fā)酵技術(shù)下對(duì)天南星具有減毒增效的作用。

3 發(fā)酵炮制的主要中藥品種

據(jù)《本草綱目》《本草蒙筌》《藥性論》及《韓氏醫(yī)通》等史料記載，采取發(fā)酵炮制制成的中藥主要分為兩大類：①中藥自身經(jīng)過(guò)一定條件發(fā)酵，如淡豆豉、百藥煎等。②藥物通過(guò)與一定介質(zhì)混合產(chǎn)生微生物進(jìn)行發(fā)酵，如六神曲、半夏曲、沉香曲等?，F(xiàn)分別介紹如下。

淡豆豉，收載于《本草匯言》，由青蒿、大豆、桑葉三者自然發(fā)酵得到。味苦、辛，性涼；歸肺、胃經(jīng)；具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的功效，主要用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠[13]。郭文勇[14]研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉中的主要生物活性成分為大豆異黃酮，該成分在預(yù)防及抵抗癌細(xì)胞方面具有一定作用。在中藥發(fā)酵炮制的基礎(chǔ)上，有學(xué)者采用單菌種和雙菌種發(fā)酵淡豆豉，以不同發(fā)酵階段產(chǎn)物的纖溶酶活性為測(cè)定指標(biāo)探究最佳條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以單一的枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)物優(yōu)于其他菌種，這為淡豆豉的大規(guī)模制備提供一定的理論支持[15-16]。

百藥煎，出自《本草蒙筌》，是由五倍子與茶葉發(fā)酵而成的灰褐色塊狀物?！侗静菥V目》載：“其體輕虛，其性浮收，且味帶余甘，治上焦心肺，咳嗽痰飲，熱渴諸病，含噙尤為相宜”[17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，五倍子的有效成分鞣質(zhì)在體內(nèi)易與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀反應(yīng)，患者使用后會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，而經(jīng)發(fā)酵制成百藥煎后，其有效成分刺激性減小、收斂性增強(qiáng)，且能在一定程度上減少甚至使不良反應(yīng)消失。

六神曲，又稱神曲，載自《齊民要術(shù)》?，F(xiàn)在常用的工藝是將切碎的鮮辣蓼、鮮蒼耳子、鮮青蒿與研末后的赤小豆、杏仁與麥麩和白面和勻，經(jīng)自然發(fā)酵制成的曲劑，具有健脾和胃、消食和中的功效。傳統(tǒng)神曲發(fā)酵為自然發(fā)酵，即雜菌發(fā)酵的方式，可控性較差，發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量?jī)?yōu)劣不一。程亦雄[18]通過(guò)水解圈法篩選優(yōu)勢(shì)菌種，得到產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶活性較高的賽氏曲霉，以正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化六神曲深層發(fā)酵工藝。

半夏曲，出自《太平惠民和劑局方》，是將半夏洗后、姜汁碾搗作曲自然發(fā)酵而成。其主治風(fēng)寒咳嗽、喘息氣急，消食積，治泄瀉。因半夏中含有的草酸鈣針晶具有刺激性，故臨床常應(yīng)用其炮制品，但對(duì)半夏發(fā)酵制曲后的毒性變化研究較少。孫佳彬等[19]通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)得出經(jīng)發(fā)酵制成曲后的半夏毒性減弱的結(jié)論，為半夏經(jīng)發(fā)酵制成半夏曲可在一定程度上降低藥材毒性提供了理論基礎(chǔ)。

沉香曲，收于《飲片新參》。沉香曲是由沉香、木香、檀香、砂仁、蔻仁、神曲等20多種藥材研成粉再加面粉，攪和壓制而成。其功能為理脾胃氣，止痛瀉，消脹滿。主治肝胃不和，胸悶脘脹，嘔吐吞酸[20]。在臨床應(yīng)用方面，沉香曲重氣滯諸癥，與多用于濕痰的半夏曲，主健脾胃、助消化的神曲有所不同[21]。

4 發(fā)酵在中藥炮制中的作用

4.1增強(qiáng)藥物療效 中藥發(fā)酵炮制通過(guò)微生物與中藥共同發(fā)酵，在此過(guò)程中微生物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物和藥物成分相互協(xié)同、增強(qiáng)藥效，其原因?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物與藥物發(fā)生作用的同時(shí)拓寬了代謝途徑，甚至?xí)a(chǎn)生明顯不同的有效成分[22-23]。王貞佐等[24]將焦三仙、黃芪、當(dāng)歸、海馬、柴胡制成的提取液作為培養(yǎng)基，探究該中藥提取液對(duì)冬蟲夏草的生長(zhǎng)及其菌絲體中有效成分含量影響的研究顯示，中藥提取液對(duì)冬蟲夏草菌絲體的生長(zhǎng)刺激作用明顯，且冬蟲夏草中甘露醇成分的含量顯著提高，此外提取液中含有的多糖也發(fā)生量的變化。胡昌江等[25]分別以小鼠、大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)對(duì)小鼠的氨水引咳、酚紅祛痰、二甲苯耳郭腫脹實(shí)驗(yàn)和大鼠的皮下塑料環(huán)肉芽腫增生等實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合體外抗菌實(shí)驗(yàn)比較改良百藥煎在發(fā)酵前后的鎮(zhèn)咳、祛痰及抗炎作用證明，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后的改良百藥煎鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎及抗菌作用明顯增強(qiáng)。李世杰等[26]利用黑曲發(fā)酵茯苓多糖進(jìn)行研究顯示，經(jīng)發(fā)酵的茯苓多糖各劑量組的小鼠臟器指數(shù)、溶血素水平、抗體IgG與IgM含量、單核-巨噬細(xì)胞吞噬率均顯著提高且能明顯增強(qiáng)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

4.2提高有效成分提取率 中草藥的有效成分大多包裹在其細(xì)胞壁內(nèi)，致密堅(jiān)硬的細(xì)胞壁是阻礙藥物有效成分從細(xì)胞內(nèi)溶出、妨礙體內(nèi)吸收的屏障。因此，微生物對(duì)有效成分的提取發(fā)揮了一定作用。它能針對(duì)不同成分構(gòu)成的壁結(jié)構(gòu)，分泌各種胞外酶，使構(gòu)成緊密的結(jié)構(gòu)分解，使細(xì)胞與細(xì)胞間的空隙變大，不僅為細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)擴(kuò)散提供通道，還能提高有效成分的提取率、吸收利用率。賈艷姝[27]以保加利亞乳桿菌為生產(chǎn)菌種發(fā)酵黃芪發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前后黃芪總皂苷和總黃酮均有不同程度的增加。馮志華等[28]使用地衣芽孢桿菌C2-13(可產(chǎn)生水解酶)發(fā)酵處理紅花發(fā)現(xiàn)，其可在一定程度上增強(qiáng)產(chǎn)物羥基自由基清除能力、對(duì)肝氧化物的抑制能力，提高紅細(xì)胞溶血抑制率等。徐萌萌等[29]研究發(fā)現(xiàn)，微生物與苷分子間存在一種獨(dú)特的作用，糖類可在微生物的參與下代謝，牛蒡子、甘草、梔子、黃芩的苷轉(zhuǎn)化為苷元，即通過(guò)分解不易被人體吸收利用的成分，使有效成分充分釋放并發(fā)揮作用，縮短作用時(shí)間的同時(shí)提高藥材效用。在治療急性耳郭炎方面，牛蒡子、甘草等發(fā)酵處理品的藥效較生品顯著增強(qiáng)[29]。

4.3降低藥物毒性 中藥不是完全無(wú)害的，有些藥物因其自身所含化學(xué)成分的種類多樣，具有一定程度的毒性和刺激性，所以人們?cè)谑褂脮r(shí)會(huì)出現(xiàn)一些副作用。有些藥材經(jīng)發(fā)酵處理后，其毒性或刺激性明顯減弱，這是由于在微生物的作用下，毒性成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，變成低毒甚至無(wú)毒的物質(zhì)。吳曉峰[30]通過(guò)小鼠口服急性毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠耳殼腫脹實(shí)驗(yàn)、兔紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的巴豆不僅毒性降低且效用增強(qiáng)，其中靈芝和白僵菌發(fā)酵得到的靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)部分減毒作用明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)物巴豆霜。朱舟等[12]將白僵菌與天南星采用雙向發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行處理得到毒性較小、抗驚厥力較高的產(chǎn)物，達(dá)到減毒增效的目的。另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵處理后的大黃，其瀉下作用的有效成分結(jié)合型蒽醌的含量明顯下降[31]。

4.4改變活性成分 發(fā)酵對(duì)藥材活性成分的影響體現(xiàn)在新成分的產(chǎn)生及原有成分的轉(zhuǎn)化。發(fā)酵過(guò)程表現(xiàn)為在酶的作用下，微生物代謝過(guò)程中的大分子成分被分解、轉(zhuǎn)化，進(jìn)而在一定條件下合成新化合物，產(chǎn)生效用更強(qiáng)的有效成分。董玫等[32]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將滋陰補(bǔ)腎經(jīng)典方劑六味地黃丸進(jìn)行發(fā)酵，所得到的發(fā)酵液能抑制小鼠肝癌H22生長(zhǎng)，而將其進(jìn)行煎煮后得到的液體不具有該作用。李國(guó)紅等[33]將三七的須根粉碎，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行固體發(fā)酵，并使用相應(yīng)的儀器技術(shù)對(duì)發(fā)酵所得物中的皂苷成分進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三七及其原料藥中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新成分——人參皂苷Rh4，證明在發(fā)酵的過(guò)程中活性成分發(fā)生變化。

此外，在人體內(nèi)不可直接被利用的有效成分，可在體外通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的有效成分可直接被機(jī)體利用。

5 小 結(jié)

中藥是我國(guó)的寶貴財(cái)富，但隨著工業(yè)化的日益發(fā)展及不合理的開(kāi)發(fā)利用，藥用植物資源逐漸匱乏，野生中藥材瀕危，因此提高藥用資源利用率是開(kāi)發(fā)利用中藥的有效途徑之一。而作為中藥炮制領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一的發(fā)酵法，具有改變藥物性質(zhì)、提高療效、減少毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，為我國(guó)豐富藥用資源的進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)，乃至中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展拓寬了研究范圍。但由于中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制闡釋受限，且不同藥物配伍后對(duì)有效成分產(chǎn)生微妙影響。同時(shí)傳統(tǒng)方法發(fā)酵過(guò)程中易引入有害菌群，結(jié)果可控性不強(qiáng)，易出現(xiàn)安全事故。未來(lái)，應(yīng)將現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于中藥制劑的研究開(kāi)發(fā)，以推進(jìn)中藥現(xiàn)代化。