張鳳俊 李晶明 劉秋平

隨著人們生活方式以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病逐漸成為全球公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織報道最新的全球糖尿病患者多達(dá)4.22億人，預(yù)計到2040年將達(dá)6.42億人，而中國糖尿病患者數(shù)將位居世界第一[1-2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)根據(jù)眼底血管損傷程度分為非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。NPDR以血管迂曲、視網(wǎng)膜出血、微血管瘤和脂質(zhì)滲出為特點，當(dāng)出現(xiàn)異常新生血管增殖時發(fā)展為PDR。DR中另一個重要特征是糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)，是由于液體積聚在神經(jīng)視網(wǎng)膜中導(dǎo)致視網(wǎng)膜增厚和黃斑囊樣改變。DME既可以發(fā)生在NPDR中，也可發(fā)生在PDR中，是視力丟失的常見原因。研究表明，毛細(xì)血管閉塞和毛細(xì)血管通透性的增加將破壞血-視網(wǎng)膜屏障，是產(chǎn)生血管滲

漏的主要原因，而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)既可促進(jìn)血管滲漏，又可導(dǎo)致新生血管生成，在DR中扮演了重要的角色[4]。目前抗VEGF治療是DR治療的主流方式，但需多次重復(fù)玻璃體內(nèi)注藥，并且僅對中晚期DR有效，因此存在局限性[5]。而糖尿病患者在出現(xiàn)眼底微血管損傷之前，視網(wǎng)膜早已出現(xiàn)病理生理改變，并影響其視功能，但目前幾乎沒有針對這些早期階段損傷的治療措施[6-7]。因此探索DR的早期分子生物學(xué)改變機(jī)制，并尋找潛在的治療方法具有重大的臨床意義。

1 炎癥

炎癥是對損傷或應(yīng)激的非特異性反應(yīng)。當(dāng)病原體入侵時，機(jī)體通過模式識別受體識別它們，這些受體包括Toll樣受體和高級糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)。在沒有病原體時，激活的TLR或者單純的組織應(yīng)激狀態(tài)就可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄核因子κB(NF-κB)去抑制，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中刺激促炎因子、急性期蛋白和趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)等，從而促進(jìn)單核細(xì)胞、白細(xì)胞的募集和活化以及誘發(fā)隨后的炎癥反應(yīng)。

大量研究表明，炎癥在DR發(fā)展過程中扮演重要角色。在糖尿病患者高血糖狀態(tài)下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞因多元醇、蛋白激酶C、高級糖激化終產(chǎn)物以及腎素血管緊張素系統(tǒng)等生物途徑改變而激活，并釋放大量炎癥因子，增加的炎癥因子可通過促進(jìn)血管生成和神經(jīng)變性兩方面損傷視網(wǎng)膜[8]。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者房水中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和TNF-α水平升高，并且與疾病的嚴(yán)重程度及發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。對于PDR患者，玻璃體中炎癥因子表達(dá)與VEGF一同升高，甚至其可溶性受體sIL-2R表達(dá)也增加[10]。另一個有趣的研究發(fā)現(xiàn)，PDR玻璃體中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat receptor containing apyrin domain 3，NLRP3)炎癥小體被激活，與未發(fā)生視網(wǎng)膜脫離的PDR相比，伴有牽拉性視網(wǎng)膜脫離的PDR眼中NLRP3表達(dá)水平更高[11]。然而Boss等[12]發(fā)現(xiàn)，NPDR患者玻璃體內(nèi)IL-8和TNF-α水平甚至高于PDR，可能的解釋是炎癥是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在DR的早期階段搶救受損神經(jīng)元的一種代償機(jī)制。

在糖尿病動物模型中，亦可觀察到糖尿病視網(wǎng)膜中IL-8、TNF-α、ICAM-1等炎性因子表達(dá)上調(diào)、白細(xì)胞淤積、膠質(zhì)細(xì)胞活化等炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，而抑制炎癥可有效緩解視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[13-16]。Wang等[15]研究表明，夾竹桃麻素通過抑制TLR4/NF-κB信號通路可以改善鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變。Wu等[17]同樣在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，防己醇靈通過抑制RAGE/NF-κB信號通路而減輕視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者在STZ誘導(dǎo)的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特通過阻止NLRP3炎癥小體的激活而減輕DR[13]。在臨床研究中，Ju等[18]觀察190例患或不患DR的2型糖尿病患者不同階段血清IL-1b、TNF-α、VEGF和Lp-PLA2的變化，以及口服非諾貝特治療12周后這些炎性因子的改變情況，研究結(jié)果表明，DR患者血清炎癥因子的水平明顯高于沒有視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者，非諾貝特治療后DR患者炎性因子水平明顯降低，由此可見炎癥在DR的發(fā)生和發(fā)展中起作用，非諾貝特可降低DR患者的炎性因子水平，從而改善炎癥反應(yīng)。

2 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是由活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)引起的。含自由基的物質(zhì)可以是原子，也可以是分子，其外軌道上具有不成對的電子，具有不穩(wěn)定性，容易通過脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)修飾、DNA損傷等損傷生物大分子，最終引起神經(jīng)變性、細(xì)胞凋亡甚至死亡。參與氧化應(yīng)激的各種物質(zhì)包括自由基分子(如超氧化物自由基O2·、羥基自由基OH·)、非自由基[如過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)和臭氧O3]以及反應(yīng)性脂質(zhì)(如酮胺和酮醛基)[19]。正常生理狀態(tài)下有一套抗氧化系統(tǒng)與之平衡，而糖尿病的高血糖打破了整個細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。大量研究表明，DR患者眼中多元醇、氨基己糖、蛋白激酶C、血管緊張素Ⅱ和高級糖基化終產(chǎn)物堆積等多條途徑被激活，均會產(chǎn)生大量的ROS[20]。如多元醇途徑激活時，過多的葡萄糖通過醛糖還原酶和山梨糖醇脫氫酶還原氧化為果糖，這兩種酶需要消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)，導(dǎo)致NADPH水平降低，NADPH再生為細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)減少，從而導(dǎo)致ROS積累，引起細(xì)胞中的氧化應(yīng)激。ROS的積累可逐漸激活NF-κB和MAPK級聯(lián)反應(yīng)釋放炎性因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21-22]。抑制ROS和炎性因子的相互作用是預(yù)防和治療DR的靶標(biāo)之一。本課題組最新的一項研究表明，具有抗炎作用的非諾貝特在1型糖尿病小鼠模型和高糖模擬的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞模型中可減輕氧化應(yīng)激和阻斷氧化應(yīng)激激活的Wnt /β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而改善DR[23]。除炎癥外，神經(jīng)退行性變也是氧化應(yīng)激的潛在靶標(biāo)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retina ganglion cell，RGC)的退化與氧化應(yīng)激-炎癥密切相關(guān)。Yang等[24]體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2和N9，并使用高糖和游離脂肪酸模擬糖尿病，結(jié)果表明二者協(xié)同處理導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物CD11b和Iba-1的表達(dá)上調(diào)，BV-2和N9細(xì)胞被過度激活，并顯著增強氧化應(yīng)激標(biāo)志物和促炎因子，而番紅花素可降低ROS、IL-1β和TNF-α水平而具有治療DR的價值。

在糖尿病狀態(tài)下，ROS可通過酶促途徑和非酶促途徑生成，酶促途徑包括通過胞質(zhì)NADPH氧化酶(NOX)復(fù)合物、細(xì)胞色素p450或黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生。NOX是視網(wǎng)膜胞質(zhì)中活性氧的重要酶促來源，參與了DR的早期和晚期。迄今為止，已鑒定出至少7種NOX異構(gòu)體，包括NOX1至NOX5，雙重氧化酶1和雙重氧化酶2。研究表明，在高血糖條件下，NOX亞型(NOX1-4)被激活產(chǎn)生過氧化物(O2-)或H2O2，從而產(chǎn)生大量ROS。過量的ROS進(jìn)一步導(dǎo)致視網(wǎng)膜氧化損傷(如衰老、凋亡)，或作為啟動視網(wǎng)膜新生血管的信使，促使視網(wǎng)膜新生血管的形成，應(yīng)用NOX的抑制劑或調(diào)節(jié)劑可改善糖尿病視網(wǎng)膜功能[25]。因此，NOX可能是DR治療的潛在靶標(biāo)。

此外，細(xì)胞還具有一套抗氧化系統(tǒng)，也由酶和非酶成分組成。有效的抗氧化防御酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，可將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2，過氧化氫酶又可將H2O2還原為水。例如：銅鋅SOD是一種胞質(zhì)歧化酶，而錳超氧化物歧化酶(SOD2)是一種線粒體基質(zhì)酶。在糖尿病中，視網(wǎng)膜抗氧化防御酶也受到損害，最終導(dǎo)致自由基積累增加[26]。除了幾種抗氧化劑防御酶外，細(xì)胞還具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，如GSH是主要的抗氧化劑之一，可作為自由基的清除劑。在DR中，視網(wǎng)膜及其脈管系統(tǒng)中的GSH水平降低[27]。此外，視網(wǎng)膜還配備了核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2抗氧化反應(yīng)元件信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該途徑控制著消除ROS的重要基因的表達(dá)，例如編碼SOD、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基等。在正常情況下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated proteinl,Keap1)將Nrf2錨定在細(xì)胞質(zhì)中，氧化應(yīng)激時與Nrf2解離，使其向細(xì)胞核中移位，并啟動抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。在DR中，Keap1基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平皆升高，Nrf2與Keap1結(jié)合更緊密，使Nrf2與DNA結(jié)合活性降低，轉(zhuǎn)錄活性受到損害，進(jìn)一步加重并暴露視網(wǎng)膜于氧化狀態(tài)[28]。

3 硝基化應(yīng)激

一氧化氮(nitric oxide，NO)含有一個未配對的電子的自由基。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO產(chǎn)生的催化劑，存在3種亞型[內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)元型(nNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)]，其催化L-精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镹O和瓜氨酸。糖尿病患者在高糖和其他應(yīng)激刺激(包括氧化應(yīng)激)狀態(tài)下觸發(fā)超氧化物的生成，超氧化物與NO發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生過氧亞硝酸根(ONOO-)[29]。ONOO-是一種特殊的受體物質(zhì)，可用于硝基化蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基，產(chǎn)生硝基化應(yīng)激，從而破壞膜蛋白和脂肪酸，促進(jìn)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化和炎癥反應(yīng)上調(diào)，還可啟動凋亡途徑。除了氧化應(yīng)激，硝基化應(yīng)激逐漸成為糖尿病視網(wǎng)膜應(yīng)激狀態(tài)的另一主要機(jī)制，尋找針對性的治療方法是目前DR研究的新方向。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜中NO的神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NADPH-d的活性和iNOS免疫反應(yīng)性增加，視網(wǎng)膜的感光層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和Müller細(xì)胞硝基酪氨酸免疫標(biāo)記陽性，提示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生了硝基化應(yīng)激[30]。同樣，在糖尿病患者血漿中，NO濃度升高與視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度相關(guān)[31]。在DR中，iNOS和緩激肽1型受體(brady kinin receptor,B1R)會導(dǎo)致炎癥、氧化應(yīng)激和血管功能障礙，對糖尿病大鼠施用選擇性iNOS抑制劑可減少這些改變，并且通過玻璃體內(nèi)注射B1R激動劑R-838后，誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜血管通透性的額外增加也被iNOS抑制劑阻止，免疫熒光化學(xué)染色突顯了iNOS和B1R在糖尿病視網(wǎng)膜中的強烈共定位，推測B1R和iNOS具有相互作用，B1R-iNOS軸值得進(jìn)一步深入研究[31]。此外，研究發(fā)現(xiàn)氨基胍是iNOS的藥理學(xué)抑制劑，同時也是晚期糖基化終產(chǎn)物的抑制劑，可預(yù)防糖尿病引起的大鼠眼組織學(xué)變化[32]。但是，目前都無法推斷出氨基胍是否僅通過阻礙NO生成來抑制視網(wǎng)膜病變。因此，明確抑制NO干預(yù)程序的方法對于評估NO在DR發(fā)生中的作用非常重要。

4 表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾包括DNA甲基化，組蛋白修飾和非編碼RNA，是在不改變核苷酸一級序列下調(diào)控基因的表達(dá)，反映了生物與其環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用，并且現(xiàn)在被認(rèn)為是許多慢性疾病(包括惡性腫瘤、糖尿病和自身免疫性疾病)的一些關(guān)鍵因素。表觀遺傳學(xué)在糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥中的作用正在成為一個新興領(lǐng)域。DNA甲基化是最原始的表觀遺傳修飾，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransterase,DNMTS)催化下將甲基從S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)轉(zhuǎn)移到DNA分子上。脊椎動物基因組中，50%的基因轉(zhuǎn)錄與胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島相關(guān)，在胞嘧啶的第5個碳原子上添加甲基會改變DNA片段的活性，而不會改變序列，而甲基化的胞嘧啶(5 methyl cytosine,5mC)在結(jié)構(gòu)上限制了DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。故CpG位點主要位于編碼基因的調(diào)節(jié)區(qū)，通常保持未甲基化。與沒有DR的患者相比，DR患者顯示出明顯更高的DNA甲基化水平，尤其是CpG島的甲基化增加[33]。Agardh等[34]研究1型PDR患者甲基化水平發(fā)現(xiàn)，PDR個體中有349個CpG位點被甲基化，大多數(shù)(79%)甲基化程度降低。這些位點代表了233個與不同功能(例如炎癥、氧化應(yīng)激、視網(wǎng)膜發(fā)育)相關(guān)的獨特基因。DNA甲基化也參與線粒體DNA表觀遺傳修飾中，將在后面線粒體損傷里詳細(xì)描述。

另一個表觀遺傳學(xué)改變，即組蛋白修飾，也是DR病理生理學(xué)改變的關(guān)鍵因素。組蛋白的修飾可以將基因組分為活性(常染色質(zhì))或非活性(異染色質(zhì))區(qū)域。組蛋白上的賴氨酸和精氨酸可以被乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化或SUMO化。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histonc acctyltransferases,HAT)在組蛋白乙?；衅鹬饕饔?，它主要與基因激活有關(guān)。機(jī)體為了維持修飾的和未修飾的組蛋白之間的平衡，存在HAT抑制劑，即組蛋白脫乙酰基酶(histone deacetylase,HDAC)。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型中，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HDAC1的轉(zhuǎn)錄活性升高，而HAT的活性和乙酰化組蛋白H3的表達(dá)均降低[35]。SIRT1是NAD+依賴性組蛋白脫乙?；?HDAC)，是沉默信息調(diào)節(jié)劑2家族的成員，可與靶蛋白相互作用并調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，如增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)。在糖尿病中，SIRT1被抑制，使NF-κB的p65亞基高度乙?；?，并激活基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)表達(dá)，促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[36]。Mishra等[37]證明靶向激活 SIRT1可維持視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元健康，防止線粒體損傷，最終改善DR的發(fā)展。HDAC還會減少正常視網(wǎng)膜所需的抗氧化基因Nrf2的表達(dá)，而用HDAC抑制劑曲古抑菌素A和丙戊酸，可通過增加核因子啟動子區(qū)域的H3和H4乙?；絹砀纳破浔磉_(dá)[35]。

除組蛋白修飾和DNA甲基化外，非編碼RNA，即microRNA(miRNA)也參與表觀遺傳學(xué)修飾，可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這些短的單鏈RNA分子是一類19～25個核苷酸的堿基，可與目標(biāo)mRNA的3’-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降解，使目標(biāo)基因表達(dá)沉默。在整個基因組中，約30%的基因受miRNA的調(diào)控。miRNA也參與DR發(fā)展相關(guān)基因的調(diào)控，從而在DR的表觀遺傳學(xué)改變中發(fā)揮作用[38]。在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜中，總共11個miRNA(miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-135b、miR-592、miR-190b、miR-363和miR-29c)顯示表達(dá)增加，而6種miRNA(miR-10b、miR-10a、miR-219-2-3p、miR-144、miR-338和miR-199a-3p)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)減少[39]。Li等[40]搜集255例DR患者血液檢測發(fā)現(xiàn)，DR患者miR-200b表達(dá)顯著減少，而VEGFA mRNA表達(dá)顯著增加，并在動物實驗中進(jìn)一步證明miR-200b可能通過下調(diào)其靶基因VEGFA減輕DR的發(fā)展。在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b靶向目標(biāo)基因血管緊張素原，介導(dǎo)AngⅡ-ERK1/2信號通路誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[41]。miRNA不僅在新生血管形成中起重要作用，也參與神經(jīng)保護(hù)的調(diào)節(jié)。Zhang等[42]研究證明，抑制miR-145-5p可以提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率以及延遲DR的進(jìn)展，F(xiàn)GF5是其目標(biāo)基因。另外，在PDR中miR-451a/ATF2可通過促進(jìn)線粒體功能來調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞的增殖和遷移[43]?？傊?，miRNA介導(dǎo)的DR相關(guān)基因種類繁多，涉及抗氧化劑、炎癥、神經(jīng)保護(hù)和血管生成等多方面，可為DR治療提供新的方向，但是，每個miRNA具有多個靶點和血-視網(wǎng)膜屏障的限制使其應(yīng)用受限，因此還需更多的研究來探索其治療潛能。

5 線粒體損傷

被稱為能量工廠的線粒體可以利用機(jī)體95%的可用氧經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞提供能量。在正常條件下，只有約2%的氧氣進(jìn)入電子傳輸鏈(electron-transport chain,ETC)，以超氧化物自由基的形式逸出，這是ROS的主要內(nèi)源性來源。低水平的ROS在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，但過量的ROS會氧化修飾細(xì)胞的生物大分子。在DR的發(fā)病機(jī)制中，高循環(huán)葡萄糖會增加通過ETC的電子通量并降低復(fù)合物Ⅲ的活性，最終導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加。更糟的是，胞質(zhì)ROS產(chǎn)生酶NOX也被激活，胞質(zhì)ROS不斷積累會破壞線粒體完整性。另外，線粒體的環(huán)狀DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)緊鄰ETC且缺乏保護(hù)性的組蛋白，很容易受到自由基的破壞。在糖尿病中，視網(wǎng)膜mtDNA氧化的核苷、8-羥基-2-脫氧-鳥苷(8-OHdG)水平升高，序列變異增加[44]。與其他區(qū)域相比，轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起始位點置換環(huán)(D-loop)區(qū)域的破壞更為廣泛，mtDNA轉(zhuǎn)錄受損，進(jìn)一步損害了ETC復(fù)合體，導(dǎo)致更多的自由基產(chǎn)生。為了修復(fù)受損的DNA，線粒體具有有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，包括酶蛋白來修復(fù)氧化改變的堿基、錯配或堿基切除等。MutS家族的Msh2識別錯配，而MutL家族的Mlh1消除錯配。在DR中，盡管視網(wǎng)膜堿基切除修復(fù)酶OGG1的表達(dá)沒有降低，但它們向線粒體的易位受到損害[45]。錯配修復(fù)系統(tǒng)也因線粒體中Mlh1水平降低而受損，最終導(dǎo)致序列變體增多[44]。此外，線粒體為了保持適當(dāng)?shù)墓δ芎陀行У膬?nèi)容交換，它們會發(fā)生融合和裂變。融合裂變保持線粒體形狀并控制線粒體膜電位、呼吸作用和基因組的完整性。裂變受動力蛋白相關(guān)蛋白1(Drp1)的控制；外膜融合由融合蛋白絲裂霉素1和2(Mfn1和Mfn2)介導(dǎo)，內(nèi)膜融合由視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy protein,OPA1)介導(dǎo)。在DR中，視網(wǎng)膜線粒體腫脹，Mfn2表達(dá)降低，Drp1表達(dá)升高，表明線粒體受損破碎，加劇了ROS的產(chǎn)生[46]。另一方面，ROS升高可激活MMP-9和MMP-2，并在熱休克蛋白(Hsp70)的幫助下從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)，破壞線粒體完整性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C泄漏到細(xì)胞質(zhì)中，啟動凋亡機(jī)制[47]。

近年來，DR中表觀遺傳修飾在線粒體損傷中的作用也備受關(guān)注，mtDNA就是表觀遺傳修飾的靶標(biāo)。人類mtDNA盡管無組蛋白，但具有435個CpG位點和4747個胞嘧啶殘基。與核DNA甲基化一樣，異常mtDNA甲基化也受藥物和疾病外部因素的影響。在DR中，視網(wǎng)膜5mC水平增加，mtDNA甲基化程度較高，并且D環(huán)區(qū)域的5mC水平高于其他區(qū)域[48]。由于mtDNA甲基化的增加，編碼ETC相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄減弱，使ETC受損[49]。Kowluru等[50]研究發(fā)現(xiàn)，抑制DNA甲基化可改善D環(huán)區(qū)域中糖尿病引起的錯配，提示DNA甲基化與堿基錯配之間存在正相關(guān)。另外，視網(wǎng)膜中錯配修復(fù)酶Mlh1和POLG的啟動子區(qū)域中的DNA被超甲基化，使mtDNA錯配修復(fù)系統(tǒng)受損[51]。Mfn2啟動子的動態(tài)DNA甲基化也與其表達(dá)降低和線粒體裂變增加有關(guān)[52]。因此在DR中，表觀遺傳修飾對維持視網(wǎng)膜線粒體動力學(xué)和穩(wěn)定性很重要。表觀遺傳修飾還涉及負(fù)責(zé)保護(hù)線粒體免受損傷的基因的調(diào)控。例如，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Sod2的啟動子和增強子處顯示H4K20me3，乙?；鵋3K9和NF-κBp65升高，甚至高血糖的逆轉(zhuǎn)也未能阻止這種改變[53]。在DR中，Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性下降與Keap1的表觀遺傳修飾有關(guān)[28]。Keap1啟動子處H3K4me1的水平增加，促進(jìn)Keap1的表達(dá)，使Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核的運動受到阻礙，這削弱了Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性并降低了抗氧化反應(yīng)基因(包括Sod2)的表達(dá)。Nrf2還可與GSH生物合成酶Gclc的ARE4區(qū)結(jié)合，激活GSH的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)顯示，Gclc-ARE4處H3K4甲基化的改變是導(dǎo)致Nrf2結(jié)合受損的主要因素之一。DR中，視網(wǎng)膜及其脈管系統(tǒng)中總GSH和線粒體GSH水平降低，可能與表觀修飾相關(guān)[49]。除組蛋白和DNA修飾外，許多miRNA現(xiàn)在也參與線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。例如，miR-663已被確定為參與ETC復(fù)合物呼吸鏈亞基的調(diào)節(jié)劑[54]。

由此可見，糖尿病患者視網(wǎng)膜線粒體受氧化應(yīng)激和表觀遺傳修飾的作用而產(chǎn)生損傷，損傷的線粒體反過來繼續(xù)增加氧化應(yīng)激和改變線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)而影響表觀遺傳，三者相輔相成，互相影響。另外有研究認(rèn)為DR是一種低度的慢性炎癥性疾病[55]，功能異常的線粒體在炎癥中的作用以及與線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激日益受到關(guān)注[56]。雖然，線粒體損傷在DR中的作用仍處于早期階段，但為靶向線粒體功能障礙或表觀遺傳修飾以阻止或減緩DR進(jìn)展提供了更多的方向。

6 基因多態(tài)性

基因多態(tài)性亦稱遺傳多態(tài)性，指在一個生物群體中，同一基因的結(jié)構(gòu)或核苷酸序列在不同個體中不完全相同，存在等位基因的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白或沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域?；蚨鄳B(tài)性現(xiàn)象十分普遍，最常見的基因多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是單個堿基通過替換、缺失或插入一個單核苷酸而發(fā)生突變產(chǎn)生的多態(tài)性。盡管高血糖、高血壓和血脂異常已被認(rèn)為是DR的強大危險因素，但遺傳因素在其發(fā)展和進(jìn)程中也起重要作用。了解與DR相關(guān)的遺傳因素將有助于鑒定其生物學(xué)基礎(chǔ)，并可能為藥理研究提供分子靶標(biāo)。近年來，許多研究已將遺傳多態(tài)性與DR的發(fā)生和發(fā)展聯(lián)系起來[57]。其中，VEGF、eNOS和NOX4基因多態(tài)性是與DR風(fēng)險相關(guān)的最常見易感基因[58-60]。已對VEGF SNP與DR之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了薈萃分析，證實與沒有視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者相比，DR患者中VEGF的rs3025039中的T等位基因(TT和TC)和rs833061中的C等位基因的基因型顯著增加，這表明rs3025039中的T等位基因和rs833061中的C等位基因較高頻率可能會增加患DR的敏感性[60]。Midani等[58]在突尼斯人中研究表明，eNOS基因的4b4a和-786T/C多態(tài)性與突尼斯人患DR有關(guān)。然而Qiao等[61]研究卻發(fā)現(xiàn)ACE和AGT基因多態(tài)性與中國2型糖尿病患者的DR發(fā)展無關(guān)，但還需要更多的研究來進(jìn)一步證明。

7 視網(wǎng)膜神經(jīng)變性

長期以來，微血管變化一直被認(rèn)為是DR發(fā)病機(jī)制的核心。然而，近年來隨著視野、電生理、OCT等檢查技術(shù)的發(fā)展更新，越來越多的證據(jù)表明DR相關(guān)的視網(wǎng)膜神經(jīng)變性發(fā)生在血管改變之前，稱之為糖尿病性視網(wǎng)膜神經(jīng)變性(diabetic retinal neurodegeneration，DRN)[62]。大量動物研究也從結(jié)構(gòu)和功能上證明DRN是DR的早期組成部分。Park等[63]觀察到感光細(xì)胞凋亡最早發(fā)生在糖尿病發(fā)病4周內(nèi)，到24周時外核層厚度顯著降低。外核層是感光細(xì)胞核所在，不僅是糖尿病小鼠超氧化物產(chǎn)生的主要部位，還可產(chǎn)生炎癥蛋白，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加和死亡[64-65]。Masser等[66]進(jìn)一步證明，DR神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能缺陷先于mtDNA損傷，推測神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性可能是隨后發(fā)生的血管功能障礙的原因。在人體中，用光學(xué)相干斷層掃描隨訪觀察無DR的糖尿病患者眼底發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞/內(nèi)部叢狀層發(fā)生顯著進(jìn)行性減少，6名DM捐獻(xiàn)者眼中神經(jīng)纖維層明顯較6名年齡相似的對照捐獻(xiàn)者的眼中神經(jīng)纖維層薄。在DM小鼠模型中進(jìn)一步證實，視網(wǎng)膜神經(jīng)變性不是由DR早期周細(xì)胞和毛細(xì)血管丟失等微血管疾病介導(dǎo)的，主要與DM持續(xù)時間相關(guān)[67]。這些結(jié)果表明，DRN并非起源于局部缺血，它先于微血管病變。

但是，目前還需要進(jìn)行更多的縱向研究才能更好地確定血管病變與神經(jīng)病變之間的時間關(guān)系，以及隨時間的進(jìn)展DRN對視覺功能的影響。此外，還需付出更大的努力來標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)測神經(jīng)退行性變的方法以及尋找檢測臨床前損傷更靈敏的手段。最后，基于DRN神經(jīng)保護(hù)劑的研發(fā)也很重要。通過納米等技術(shù)開發(fā)最佳的藥物遞送方式并定義臨床相關(guān)的結(jié)果指標(biāo)，以成功評估神經(jīng)保護(hù)劑對DR的影響將是今后研究人員專注的方向。

8 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙

盡管現(xiàn)在對DR更準(zhǔn)確的定義是神經(jīng)血管疾病，而不僅僅是微血管疾病，但是血管變化仍然是DR的主要病理學(xué)改變。糖尿病狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管產(chǎn)生損傷，需要血管內(nèi)皮細(xì)胞的不斷增殖來修復(fù)受損的血管組織。然而，成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和修復(fù)能力有限。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)于1997年由Asahara等[68]首次發(fā)現(xiàn)，其表面可表達(dá)造血祖細(xì)胞標(biāo)記CD34，在受到血管生成因子刺激時可在體外形成內(nèi)皮細(xì)胞表型。這項研究表明，EPCs可能有助于增加側(cè)支血管向缺血性組織的生長(治療性血管生成)，以及將抗血管生成劑或促血管生成劑分別遞送至病理性或功能性血管生成部位。目前EPCs支持的生物標(biāo)志物是CD34和VEGFR2陽性，而CD14和CD45陰性[69]。EPCs屬于體干細(xì)胞，具有自我更新和分化為一種以上細(xì)胞類型的能力，它們通常是靜止的(處于可逆的G0阻滯狀態(tài))，并且對壓力刺激具有抵抗力。當(dāng)組織損傷，這些細(xì)胞被激活，進(jìn)入細(xì)胞周期，成為特定譜系以促進(jìn)組織再生，或者自我更新以維持靜止的細(xì)胞池。研究表明，DR中EPCs命運受基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及其受體CXCR4信號通路調(diào)節(jié)。DR中SDF-1表達(dá)水平升高，增強了EPCs向視網(wǎng)膜的歸巢，但是另一方面SDF-1也使EPCs保持靜止，不能進(jìn)入細(xì)胞周期完成自我更新，最終導(dǎo)致EPCs分化修復(fù)損傷的微血管失敗，同時增加EC的增殖和遷移，從而導(dǎo)致病理性新生血管形成[70]。另外，在糖尿病情況下，EPCs的命運還受線粒體狀態(tài)和氧化應(yīng)激的影響。首先，高濃度的葡萄糖可以誘導(dǎo)EPCs自噬，并伴隨著線粒體氧化應(yīng)激的增加和線粒體氧化滲透性的破壞[71]。其次，EPCs的分化需要大量能量來完成自我更新和增加特定功能，這就依賴化學(xué)效率更高的線粒體TCA循環(huán)產(chǎn)生ATP，而DR患者線粒體數(shù)量和功能受損，維持EPCs新陳代謝即增殖能力下降，從而導(dǎo)致EPCs衰老和功能下降[70]。最后，線粒體是氧化應(yīng)激的主要來源，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是EPCs的調(diào)節(jié)劑，EPCs暴露于H2O2后增殖能力受到損害[72]。

由此可見，健康的EPCs對維持視網(wǎng)膜微血管的完整性和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)必不可少，而線粒體功能對于確定EPCs的代謝和細(xì)胞命運至關(guān)重要。在糖尿病情況下，代謝應(yīng)激會誘發(fā)線粒體功能障礙，從而使EPCs轉(zhuǎn)化為代謝活躍的增殖狀態(tài)來補充受損血管的功能受損，這可能有助于DR的發(fā)展，但確切機(jī)制尚待確定。因此，迫切需要更多的實驗和臨床研究來更好地了解線粒體在糖尿病EPCs功能障礙中的作用。

治療方面，目前主要是增加EPCs的數(shù)量和功能，來對抗糖尿病的抑制。已開發(fā)出基于粒細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素[73]或CXCR-4拮抗劑[74]的療法，并已證明單純增加天然EPCs可能是有益的[75]。但是，這些治療是姑息性的，不足以恢復(fù)自身EPCs數(shù)量和功能。

9 自噬

自噬是細(xì)胞內(nèi)一項膜運輸過程，通過各種生物膜包裹部分胞質(zhì)和需降解的細(xì)胞器形成自噬體，運輸?shù)饺苊阁w并融合形成自噬溶酶體，對內(nèi)部物質(zhì)進(jìn)行功能性降解，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[76]。自噬是一種基因調(diào)控的程序性細(xì)胞代謝過程，所涉及的基因從酵母到人都是高度保守的。目前根據(jù)發(fā)生過程自噬分為3種類型：伴侶介導(dǎo)的自噬，微自噬和研究最廣泛的大自噬。通常所說的自噬即大自噬，分為2種類型：非選擇性自噬和貨物特異性自噬[77]。非選擇性自噬發(fā)生在營養(yǎng)不足時，使細(xì)胞重新利用和分配蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等，為細(xì)胞提供基本維持和修復(fù)補償機(jī)制。貨物特異性自噬發(fā)生在營養(yǎng)豐富的細(xì)胞中，利用自噬消除可能對細(xì)胞有害無用的蛋白質(zhì)或受損的細(xì)胞器聚集體，避免細(xì)胞損傷和凋亡。線粒體自噬就是貨物特異性自噬的典型代表。通常情況下，線粒體融合足以治療輕度損傷，但當(dāng)該過程無法有效修復(fù)損傷時，線粒體膜破壞，釋放ROS和細(xì)胞色素C觸發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體自噬通過自噬去除特定的貨物，以防止線粒體功能異常引起的損傷，使細(xì)胞能夠縮短周期并恢復(fù)受損的線粒體，以避免細(xì)胞走向調(diào)亡。因此，有效的自噬系統(tǒng)對于維持健康的細(xì)胞環(huán)境至關(guān)重要。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，自噬在糖尿病患者視網(wǎng)膜中增加，并與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性、炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等相關(guān)。Piano等[78]在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，從誘導(dǎo)糖尿病第8周開始，視桿細(xì)胞開始丟失，視紫紅質(zhì)水平下調(diào)，暗視視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)被抑制，而視錐細(xì)胞數(shù)量和功能不受影響，這種改變發(fā)生在任何微血管損傷之前，同時無任何細(xì)胞凋亡的跡象。相反，細(xì)胞內(nèi)自噬活性顯著升高，如在外叢狀層的LC3免疫染色增加，自噬蛋白Beclin-1和Atg5表達(dá)上調(diào)。Shi等[79]在高糖培養(yǎng)的ARPE-19研究中發(fā)現(xiàn)自噬在DR中起保護(hù)作用，用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬后，導(dǎo)致線粒體中ROS積聚，NLRP3炎性小體激活，隨后引起IL-1β分泌。另外，高葡萄糖條件也會誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞(rMC)自噬，但溶酶體功能障礙使自噬底物(p62/SQTSM1)在細(xì)胞質(zhì)中蓄積，導(dǎo)致過量的VEGF釋放和更高的細(xì)胞凋亡率，用mTOR抑制劑雷帕霉素可恢復(fù)溶酶體活性，改善自噬并減輕rMC凋亡和VEGF的產(chǎn)生[80]。另有研究表明，胰高血糖素樣肽治療可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬，這種保護(hù)作用可能是通過GLP-1R-ERK1 / 2-HDAC6信號通路實現(xiàn)的[81]?？傊允稍贒R發(fā)病機(jī)制中就像一把“雙刃劍”。在輕度壓力下，自噬激活可維持細(xì)胞存活，而在重度壓力下自噬失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并可能引發(fā)和惡化DR的進(jìn)展。探索DR中所涉及的自噬機(jī)制并尋找相關(guān)的治療靶點是目前DR發(fā)病機(jī)制及治療的研究熱點。

10 晝夜節(jié)律

晝夜節(jié)律是生命活動以24 h為周期的變動，是內(nèi)源性振蕩器，在調(diào)節(jié)如睡眠-覺醒周期、激素釋放和喂養(yǎng)行為等各種生化和生理過程中起重要作用。已知哺乳動物的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中樞位于大腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)。SCN可驅(qū)動包括視網(wǎng)膜在內(nèi)的周圍器官的節(jié)律。但有趣的是，Storch等[82]報道哺乳動物的視網(wǎng)膜也有一個內(nèi)在的晝夜節(jié)律時鐘，可獨立于SCN外自主進(jìn)行，條件性刪除SCN中的時鐘基因Bmal1不會影響ERG節(jié)律。視網(wǎng)膜時鐘在體內(nèi)可調(diào)節(jié)衰老過程中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活能力、感光細(xì)胞膜盤的脫落、褪黑激素和多巴胺的釋放以及視網(wǎng)膜對光的電反應(yīng)等重要的生理活動，并且還可以影響SCN產(chǎn)生的節(jié)律。

晝夜節(jié)律的紊亂會增加患糖尿病的風(fēng)險。動物實驗表明，通過改變光照來改變晝夜節(jié)律會增加患2型糖尿病的風(fēng)險[83]，這一觀察結(jié)果同樣也體現(xiàn)在美國的輪班工人身上[84]。另一方面，糖尿病本身會導(dǎo)致進(jìn)行性晝夜節(jié)律紊亂或加劇現(xiàn)有的晝夜節(jié)律紊亂。糖尿病患者表現(xiàn)出體溫、心率和空腹血糖的晝夜節(jié)律紊亂[85]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的晝夜節(jié)律逐漸改變可能與視網(wǎng)膜功能受損有關(guān)。在一項基于韓國人群的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，短期(≤5 h)和長時間(≥9 h)的睡眠與男性發(fā)生DR的風(fēng)險較高有關(guān)，推測短暫和長時間的睡眠可能通過破壞晝夜節(jié)律或異常的葡萄糖代謝而對DR的發(fā)展產(chǎn)生影響[86]。Di等[87]研究表明，糖尿病患者不僅會降低視網(wǎng)膜a波、b波和振蕩電位振幅，還會影響ERG的晝夜節(jié)律，并且隨著患糖尿病持續(xù)時間的增加以及視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展，ERG的固有節(jié)律逐漸下降，為DR的致病機(jī)制提供了新的見解。另有研究表明，在沒有DR的糖尿病患者中，晝夜節(jié)律功能的變化是由于糖尿病性眼病早期階段外層視桿細(xì)胞功能的降低導(dǎo)致的，感光細(xì)胞的功能降低有助于褪黑激素的早期釋放，從而產(chǎn)生較差的睡眠行為[88]。該發(fā)現(xiàn)為開發(fā)選擇性靶向視桿細(xì)胞的光療法提供了基礎(chǔ)，有助于維持感光細(xì)胞向SCN傳遞具有晝夜節(jié)律的光信號，改善患者的睡眠-覺醒周期。

綜上所述，DR所涉及的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，至今仍未完全探索清楚。這篇綜述總結(jié)了DR早期的病理生理過程和相關(guān)潛在的治療方向，希望能在血管損傷之前阻止或減緩DR的進(jìn)展，減少這種致盲性眼病的發(fā)生。